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La microscopie de force de traction (TFM) est le processus d'approximation des tractions cellulaires à l'aide de champs de déplacement interpolés de marqueurs fiducial générés par une cellule adhérente et contractile. En utilisant TFM, l'influence des indices mécaniques dans l'environnement extracellulaire sur les processus cellulaires importants tels que la prolifération, la différenciation et la migration peut être étudiée1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Malheureusement, de nombreuses approches existantes peuvent être difficiles à mettre en œuvre ou exiger une connaissance des outils d'analyse et de calcul hautement spécialisés qui rendent l'ondes de POINTE difficile à utiliser pour les chercheurs inexpérimentés. Nous décrivons une méthodologie pour générer une plate-forme TFM qui élimine une partie de la difficulté d'analyse tout en fournissant également l'acquisition de données à haut débit.
Parmi les approches TFM existantes, la plus couramment utilisée pour quantifier la souche matérielle consiste à incorporation de petits marqueurs fluorescents (généralement des perles fluorescentes de la taille d'un nanomètre ou d'un micromètre) dans un hydrogel déformable, comme le polyacrylamide (PAA) ou le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA)13,14,15. Ces approches à base de perles permettent de regrouper densément les marqueurs fiduciaux autour d'une cellule d'intérêt afin de maximiser l'échantillonnage par déplacement. Malheureusement, la distribution des perles dans l'hydrogel ne peut pas être directement contrôlée de sorte que l'organisation spatiale est aléatoire. Ce placement aléatoire conduit à des problèmes tels que les perles qui sont trop proches les uns des autres pour résoudre avec précision, ou si la propagation que les taches du substrat donnent des données de faible qualité. L'incapacité de prédire où se trouvent les marqueurs fiducial en l'absence de cellules crée également une contrainte que, pour chaque ensemble collecté de données de traction cellulaire, une image de référence supplémentaire des marqueurs sous-jacents dans un état détendu doit également être capturée. L'image de référence est nécessaire pour que le déplacement dans l'image stressée puisse être approximatif comme la différence entre les images stressées et non stressées. Pour atteindre un état détendu, les cellules mesurées sont soit chimiquement détendues, soit complètement enlevées. Ce processus empêche souvent l'acquisition d'autres mesures expérimentales, inhibe les études cellulaires à long terme et limite le débit. Une image de référence nécessite également des techniques d'enregistrement d'images pour tenir compte de la dérive qui peut avoir eu lieu pendant l'expérimentation, conduisant souvent à l'appariement manuel encombrant des images d'état de stress aux images de référence.
D'autres méthodes TFM jugées sans référence, mettent en œuvre une certaine forme de contrôle sur la distribution des marqueurs fiducial, soit par lithographie haute résolution, impression par microcontact, ou micromolding16,17,18 ,19,20. Le TFM sans référence est réalisé en supposant que l'état détendu de chaque marqueur fiducial peut être prédit en fonction de la façon dont les positions de marqueur ont été prescrites pendant le processus de fabrication. Ces méthodes permettent de saisir complètement l'état de tension d'une cellule au sein d'une seule capture d'image dans laquelle les déplacements de marqueurs fiducial sont mesurés par rapport à une référence implicite que l'on peut déduire de la géométrie du marqueur fiducial. Bien que l'uniformité dans le placement des marqueurs soit généralement atteinte à l'aide de ces plates-formes, elles souffrent généralement de leurs propres lacunes par rapport aux approches largement utilisées basées sur les perles, y compris : 1) une diminution de la résolution de traction; 2) diminution de l'exactitude des déplacements hors avion (dans certains cas, une incapacité totale de mesurer); et 3) diminution de la personnalisation des substrats et des matériaux de plate-forme (p. ex., présentation de ligands, propriétés mécaniques).
Pour remédier à ces lacunes, nous avons conçu une nouvelle plate-forme TFM sans référence. La plate-forme utilise la chimie activée par multiphoton pour relier un petit volume d'un fluorophore dans des emplacements 3D spécifiques dans l'hydrogel qui servent de marqueurs fiducial pour mesurer la souche matérielle. De cette façon, nous avons conçu une plate-forme qui fonctionne de la même façon que les approches basées sur les perles, mais avec l'avantage significatif que les marqueurs fiducial sont organisés en tableaux quadrillés permettant le suivi sans référence des souches matérielles. Cette propriété sans référence offre de nombreux avantages. D'abord et avant tout, il permet une surveillance non intrusive des états de traction cellulaire (c.-à-d., contourne la nécessité de détendre ou d'enlever les cellules pour acquérir des positions de référence des marqueurs fiduciaux déplacés). C'était notre objectif principal dans la conception de ce système, car nous avions l'intention d'intégrer d'autres méthodes d'analyse en aval en tandem avec TFM, ce qui peut être difficile avec des approches destructrices de point final TFM. Deuxièmement, l'utilisation d'une référence implicite basée sur des tableaux quadrillés permet une automatisation quasi complète de l'analyse des déplacements. La régularité des tableaux crée un flux de travail prévisible où l'occurrence de cas exceptionnels (c.-à-d. des données de cellules d'échantillon contenant des artefacts imprévus tels que l'espacement sous-optimal des marqueurs ou les décalages d'enregistrement) peut être maintenue au minimum. Troisièmement, l'oubli de la nécessité d'acquérir une image de référence offre la liberté de surveiller de nombreuses cellules sur un seul échantillon sur de longues périodes de temps. Cela contraste avec les approches traditionnelles à base de perles, où, selon la fidélité des mouvements automatisés de stade du microscope, les erreurs de positionnement peuvent s'accumuler et augmenter la difficulté d'enregistrer correctement les images de référence à la tension cellulaire Images. Dans l'ensemble, cette plate-forme facilite un débit plus élevé dans la collecte de données sur les tensions cellulaires.
Avec ce protocole, nous espérons familiariser les lecteurs avec la technique de lithographie à balayage laser à deux photons que nous avons mise en œuvre pour générer cette plate-forme TFM sans référence pour mesurer les composants de traction en avion et hors plane générés par les cellules enseduites en surface. Non couvert dans ce protocole est la synthèse de certains des composants monomériques. En général, ces réactions comprennent des schémas de réaction de synthèse « un pot » presque identiques décrits précédemment21, et des alternatives à ces produits peuvent également être achetées. Nous visons également à familiariser les lecteurs avec les outils logiciels que nous avons générés pour promouvoir l'utilisation de microscopes à balayage laser disponibles dans le commerce comme outils d'impression 3D et pour faciliter l'analyse des déplacements de marqueurs fiducials.