Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Résumé

Nous décrivons une approche de formation image pour la détermination de l'état oligomeric moyen des oligomères mEGFP-marqué-récepteurs induits par la liaison de ligand dans la membrane de plasma des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B).

Résumé

Malgré l'importance et l'omniprésence de l'oligomerisation des récepteurs, peu de méthodes sont applicables pour détecter les événements de regroupement et mesurer le degré de regroupement. Ici, nous décrivons une approche de formation image pour déterminer l'état oligomeric moyen des homocomplexes mEGFP-marqué-récepteur dans la membrane des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B). La méthode est une méthode semblable à la spectroscopie de corrélation fluorescence (FCS) et à l'histogramme de comptage de photons (PCH), qui sont basées sur l'analyse statistique des fluctuations de l'intensité de fluorescence des fluorophores diffusant dans et hors d'un éclairage volume pendant un temps d'observation. En particulier, n'est une simplification de PCH pour obtenir des informations sur le nombre moyen de protéines dans les mélanges d'oligomériques. Les amplitudes de fluctuation d'intensité sont décrites par la luminosité moléculaire du fluorophore et le nombre moyen de fluorophores dans le volume d'illumination. Ainsi, N-B ne considère que les premier et deuxième moments de la distribution de l'amplitude, à savoir l'intensité moyenne et la variance. C'est, en même temps, la force et la faiblesse de la méthode. Étant donné que seulement deux moments sont pris en considération, n'est pas en passe de déterminer la fraction molaire des oligomères inconnus dans un mélange, mais elle n'estime que l'état moyen d'oligomerisation du mélange. Néanmoins, il peut être appliqué à des séries chronologiques relativement petites (par rapport à d'autres méthodes de moment) d'images de cellules vivantes sur une base pixel par pixel, simplement en surveillant les fluctuations temporelles de l'intensité de la fluorescence. Il réduit le temps efficace par pixel à quelques microsecondes, permettant l'acquisition dans la plage de temps de secondes à millisecondes, ce qui est nécessaire pour la cinétique d'oligomerisation rapide. Enfin, de grandes zones cellulaires ainsi que des compartiments sous-cellulaires peuvent être explorés.

Introduction

Nous décrivons une approche d'imagerie de fluorescence et de luminosité de réflexion interne totale (TIRF-N-B) pour déterminer l'état oligomeric moyen des molécules de récepteur à la membrane de plasma des cellules vivantes, visant à relier l'assemblage de récepteur dynamique à la fonction biologique des protéines (Figure 1).

Sur la liaison extracellulaire de ligand, les récepteurs initient la transduction intracellulaire de signal selon leur conformation, oligomerization, co-récepteurs potentiels et composition de membrane. Malgré l'importance et l'omniprésence de l'oligomerisation des récepteurs, reconnu comme un événemen....

Protocole

1. Préparation de l'échantillon

1. Jour 1. Cellules HeLa de graine dans le milieu complet à une concentration de 100.000-200.000 cellules/mL dans les plats en verre-fond. Graines 6-8 reproduire les plats.
   REMARQUE: Dans cet exemple, le milieu est complété par 10% de chaleur inactivée sérum bovin fœtal (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/100 g de pénicilline/streptomycine. Plusieurs plats reproduits sont préparés.
2. Jour 2-3. Lorsque les cellules sont sous-confluences, transfect la moitié des plats avec le plasmide protéique et la seconde moitié avec des plasmides de référence (monomère et dimère), dans un milieu sans sérum.
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Résultats

Les résultats de deux cellules représentatives HeLa-mEGFP-FGFR1 ensemées dans le même plat de culture sont présentés dans la figure 5 et le tableau supplémentaire 1. Les deux cellules ont été capturées à l'époque 0 min (Figure 5A, top) et 7 min (Figure 5A, bottom) après l'ajout du ligand FGF2.

Discussion

La N-B exige plusieurs précautions dans le choix du modèle cellulaire et de la stratégie d'étiquetage. Il ne peut être appliqué qu'aux cellules vivantes qui restent stablement respectées pendant le temps de capture d'image. Les fluctuations supplémentaires dues à l'ensemble du déplacement rigide de la cellule peuvent être traitées avec des approches appropriées de restauration d'image³⁸. Cependant, généralement quand une cellule se déplace, la membrane cellulaire se déforme également, et la déform.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope inversé 3 couleurs Fast TIRF Leica AM TIRF MC, avec alignement TIRF automatique smi. Le microscope est équipé d’un laser à diode 488 nm, d’un objectif TIRF à huile 100x 1,46, de filtres passe-bande Ex/Em à 490/20 et 525/50, d’un incubateur température/CO2 et d’une caméra EMCCD Andor DU 8285 VP. Le microscope est commandé par le logiciel Leica LIF.	Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne
Albumine de sérum bovin 98 % minimum	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM sans rouge de phénol avec 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	21063029	Sérum utilisé sans pour la microscopie
DMEM à haute teneur en glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Utilisé pour le milieu complet
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé ;, France	X0515-500
Système de séparation des émissions Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Sérum de veau fœtal, qualifié, Brésil	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270106	supplément inactivé à 10 % pour le milieu complet
Fond en verre 35 mm stérile 1,5 boîtes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	non revêtu, épaisseur du verre 0,17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Carcinome cervical humain (HeLa), cellules de composants animaux (AC) sans sérum	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Allemagne	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (rétro-éclairée) Caméra ANDOR contrôlée par le logiciel ANDOR Solis	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Royaume-Uni		Cette caméra, installée dans un port supplémentaire du microscope, est utilisée pour l’acquisition du N& B séries chronologiques
Matlab Executable N& B routine Unité	de Microscopie et d’Imagerie Dynamique, CNIC, Madrid, Espagne		télécharger sur https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin :Streptomycine pour la culture tissulaire 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplément pour milieu à Pénicilline/Streptomycine 100 U/100µ ;g.
Vecteur d’expression pN1-mEGFP-FGFR1	Unité de Recherche en Oncologie Gynécologique, Institut Européen d’Oncologie IRCCS, Milan, Italie		Zamai et al., 2019
Vecteur d’expression pN1-N-Gly-mEGFP-GPI	Unité de Microscopie et d’Imagerie Dynamique, CNIC, Madrid, Espagne		Hellriegel et al., 2011
Vecteur d’expression pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI	Unité de Microscopie et d’Imagerie Dynamique, CNIC, Madrid, Espagne		Hellriegel et al., 2011
FGF2 recombinant	PeproTech EC, Ltd., Londres, Royaume-Uni		Solution de ligand : 20 ng/mL de FGF2 dans du PBS complété par 0,01 % BSA.
Pyruvate de sodium GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1 mM supplément pour moyen
TransIt-LT1 Réactif de transfection	MirusBio LLC, Madison, WI, États-Unis MIR	2300
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	25200056
Type F Liquide d’immersion 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	Supplément à 0,1 % pour milieu sans rouge de phénol utilisé pour les transfections

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