Ici, nous présentons un protocole pour induire l'hypertension oculaire et la neurodégénérescence glaucomatous dans les yeux de souris par injection intracamérale d'huile de silicone et la procédure pour l'enlèvement d'huile de silicone de la chambre antérieure pour retourner la pression intraoculaire élevée à Normal.
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Article de méthode
Un modèle d'hypertension oculaire induite par l'huile de silicium réversible chez les souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La pression intraoculaire élevée (IOP) est un facteur de risque bien documenté pour le glaucome. Ici nous décrivons une méthode nouvelle et efficace pour induire uniformément l'élévation stable d'IOP chez les souris qui imite la complication postopératoire d'utiliser l'huile de silicone (SO) comme agent de tamponade dans la chirurgie vitréoretinal humaine. Dans ce protocole, SO est injecté dans la chambre antérieure de l'œil de la souris pour bloquer la pupille et prévenir l'afflux d'humour aqueuse. La chambre postérieure accumule l'humour aqueuse et ceci augmente à son tour l'IOP du segment postérieur. Une seule injection de SO produit une élévation IOP fiable, suffisante et stable, ce qui induit une neurodégénérescence glaucomatous significative. Ce modèle est une véritable réplique du glaucome secondaire dans la clinique de l'œil. Pour imiter davantage le cadre clinique, SO peut être retiré de la chambre antérieure pour rouvrir la voie de drainage et permettre l'entrée de l'humour aqueux, qui est drainé par le maillage trabeculaire (TM) à l'angle de la chambre antérieure. Parce que L'IOP revient rapidement à la normale, le modèle peut être utilisé pour tester l'effet de l'abaissement de l'IOP sur les cellules ganglionnaires rétiniennes glaucomatous. Cette méthode est simple, ne nécessite pas d'équipement spécial ou de procédures répétées, simule de près des situations cliniques et peut s'appliquer à diverses espèces animales. Cependant, des modifications mineures peuvent être nécessaires.
Introduction
La perte progressive des cellules de ganglion rétinien (RGCs) et de leurs axones est la marque du glaucome, une maladie neurodégénérative commune dans la rétine1. Elle touchera plus de 100 millions de personnes âgées de 40 à 80 ans d'ici 20402. L'IOP demeure le seul facteur de risque modifiable dans le développement et la progression du glaucome. Afin d'explorer la pathogénie, la progression, et les traitements potentiels du glaucome, un modèle expérimental fiable, reproductible, et inductible d'hypertension oculaire/glaucome expérimental qui reproduit des dispositifs principaux des patients humains est impératif.
IOP dépend de l'entrée d'humour aqueuse à la chambre antérieure du corps ciliaire dans la chambre postérieure et l'écoulement par le maillage trabecular (TM) à l'angle de la chambre antérieure. En atteignant un état stable, IOP est maintenu. Lorsque l'afflux dépasse ou est inférieur à l'écoulement, iOP augmente ou diminue respectivement. En diminuant l'écoulement aqueux soit en occlouant l'angle de la chambre antérieure, soit en endommageant le TM, plusieurs modèles de glaucome ont été établis3,4,5,6,7,8,9,10. Ces modèles sont normalement associés aux dommages oculaires irréversibles de tissu, et le Haut IOP dans la chambre antérieure cause également des complications non désirées telles que l'oedème cornéen et l'inflammation intraoculaire, qui rendent l'imagerie rétinienne et les essais visuels de fonction difficiles à exécuter et à interpréter.
Pour développer un modèle qui surmonte ces lacunes, nous nous sommes concentrés sur le glaucome secondaire bien-documenté provoqué par l'huile de silicone (SO) qui se produit comme complication postopératoire de la chirurgie vitréorétine humaine11,12. SO est utilisé comme tamponnade dans les chirurgies rétiniennes en raison de sa haute tension de surface. Cependant, SO peut obstruer physiquement la pupille parce qu'elle est plus légère que les fluides aqueux et vitreux, ce qui empêche l'écoulement aqueux dans la chambre antérieure. L'obstruction provoque l'élévation d'IOP dans la chambre postérieure due à l'accumulation aqueuse d'humour. Ceci nous a motivés pour développer et caractériser un modèle de souris oculaire nouvelle d'hypertension basée sur l'injection intracamérale de SO et le bloc pupillaire13,avec des dispositifs principaux du glaucome secondaire : bloc pupillaire efficace, élévation significative d'IOP qui peut revenir à la normale après le déplacement de SO, et neurodegeneration glaucomatous.
Ici nous présentons un protocole détaillé pour l'hypertension oculaire SO-induite dans l'oeil de souris, y compris l'injection et le déplacement de SO et la mesure d'IOP.
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Protocole
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université Stanford.
1. Induction d'hypertension oculaire par injection intracamérale de SO
- Préparer une micropipette en verre pour l'injection intracamérale SO en tirant un capillaire en verre avec un puller pipette pour générer une micropipette. Couper une ouverture à l'extrémité de la micropipette et aiguiser davantage la pointe à l'aide d'une machine à beveling microgrinder pour faire un bevel de 35 à 40 degrés.
- Polir les bords du bevel et enlever tous les débris en les lavant à l'eau. Autoclave la micropipette avant utilisation.
- Préparer l'aiguille paracentesis pour l'entrée cornéenne. Pour ce faire, attachez une aiguille de 32 G à une seringue de 5 ml sur une serrure Luer, et fixez-la avec du ruban adhésif. Pliez l'extrémité du bevel d'aiguille vers le haut à 30 degrés.
- Préparer l'injecteur SO en attachant et en fixant une aiguille émoussée de 18 G sur une seringue de 10 ml d'abord. Puis attachez un tube en plastique avec l'aiguille de 18 G sur une extrémité et remplissez avec SO au besoin à travers l'autre extrémité.
- Fixez la micropipette stérilisée au tube en plastique et poussez le piston de seringue pour remplir la micropipette entière avec SO.
2. Injection intracamérale SO pour un œil
- Placer une souris C57B6/J mâle de 9 à 10 semaines dans une chambre d'induction avec 3 % d'isoflurane mélangé à de l'oxygène à 2 L/min pendant 3 min.
- Injectez intraperitoneally 2,2,2-tribromoethanol à 0.3 mg/g de poids corporel.
REMARQUE : Contrairement à la kétamine/xylazine, le 2,2,2-tribromoethanol ne cause pas de dilatation évidente de la pupille. - Vérifiez l'absence de réponse à une pincée d'orteil et le manque de mouvement des moustaches ou de la queue pour déterminer la force anesthésique.
- Placez la souris en position latérale sur une plate-forme de chirurgie. Pour réduire sa sensibilité pendant la procédure, appliquer une goutte d'hydrochlorure de proparacaïne de 0,5% à la cornée avant l'injection.
- Faire une incision d'entrée avec l'aiguille de paracentesis de 32 G au quadrant superotemporal, environ 0.5 mm du limbus.
- Tunnel à travers les couches de la cornée pendant environ 0,3 mm avant de percer dans la chambre antérieure. Veillez à ne pas toucher la lentille ou l'iris.
- Retirez l'aiguille lentement pour libérer un peu d'humour aqueux (environ 1/2 l) de la chambre antérieure à travers le tunnel (paracentesis).
- Attendez 8 min pour diminuer davantage l'IOP. Ceci peut être déterminé en mesurant l'œil contralatéral et de contrôle.
- Insérez la micropipette en verre préchargée avec SO à travers le tunnel cornéen dans la chambre antérieure, avec le biseau faisant face à la surface de l'iris.
- Poussez le piston de seringue lentement pour injecter SO dans la chambre antérieure jusqu'à ce que la gouttelette SO couvre la majeure partie de la surface de l'iris, de 2,3 à 2,4 mm de diamètre.
- Laisser la micropipette dans la chambre antérieure pendant 10 s de plus avant de la retirer lentement.
- Poussez doucement la paupière supérieure pour fermer l'incision de cornée pour minimiser les fuites SO.
- Appliquer de l'onguent antibiotique (bacitracin-néomycine-polymyxine) à la surface des yeux.
- Tout au long de la procédure, humidifier fréquemment la cornée avec des larmes artificielles.
- Gardez la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu'elle soit complètement récupérée de l'anesthésie.
3. So suppression
- Préparer le système d'irrigation.
- Préparer la solution d'irrigation selon les instructions du fabricant et la placer dans la bouteille d'irrigation. Élever la bouteille de solution d'irrigation à 110 à 120 cm (81 à 88 mmHg) au-dessus de la plate-forme de chirurgie.
- Fixez un ensemble d'administration IV à la bouteille de solution d'irrigation. Retirez les bulles d'air du tube IV. Connectez une aiguille de 33 G pliée à 20 degrés face jusqu'à la tubulure IV.
- Pour préparer le système de drainage, retirer le piston d'une seringue de 1 ml. Fixez une aiguille de 33 G à la seringue et pliez l'aiguille à 20 degrés.
- Retirer SO de la chambre antérieure.
- Injectez par voie intrapéritone 2,2,2-tribromoéthanol (0,3 mg/g de poids corporel). Vérifiez l'absence de réponse à la pince de l'orteil pour déterminer la force anesthésique et le manque de mouvement des moustaches ou de la queue.
- Placez la souris sur une plate-forme de chirurgie et fixez-la en position latérale avec du ruban adhésif. Appliquer une goutte d'hydrochlorure de proparacaïne de 0,5 % sur la cornée pour réduire sa sensibilité.
- Faire deux incisions dans le quadrant temporel de la cornée entre 2 et 5 heures au bord de la gouttelette SO à l'aide de l'aiguille préfabriquée de 32 G paracentesis.
- Insérez une aiguille d'irrigation de 33 G reliée à la solution d'irrigation par une incision cornéenne, vitesse maximale.
- Insérez une autre aiguille de drainage de 33 G attachée à la seringue sans piston à travers l'autre incision cornéenne pour permettre à la gouttelette SO de sortir de la chambre antérieure tout en irriguant avec la solution d'irrigation.
- Retirez l'aiguille de drainage, puis l'aiguille d'irrigation.
- Injecter une bulle d'air dans la chambre antérieure pour maintenir sa profondeur normale et presser pour fermer l'incision cornéenne.
- Appliquer une pommade antibiotique sur les deux yeux.
- Gardez la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu'elle soit complètement récupérée de l'anesthésie.
4. Mesure IOP une fois par semaine
- Placer la souris dans une chambre d'induction perfusée avec 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène à 2L/min pendant 3 min.
- Injecter intrapéritonement de la xylazine et de la kétamine (0,01 mg xylazine/g, 0,08 mg de kétamine/g).
- Gardez la cornée humide en appliquant des larmes artificielles tout au long de la procédure.
- Attendez environ 15 min pour permettre à la pupille de se dilater complètement.
- Mesurez l'IOP des deux yeux à l'aide d'un tonomètre selon les instructions du produit. Apportez le tonomètre près de l'œil de la souris. Gardez la distance entre la pointe de la sonde et la cornée de la souris à environ 3 x 4 mm. Appuyez sur le bouton de mesure 6x pour générer une lecture. Trois lectures générées par la machine sont obtenues de chaque œil pour acquérir la moyenne IOP.
- Sacrifiez les animaux à 8 semaines après l'injection de SO et exécutez l'immunohistochimie de la rétine de monture entière, du comptage de RGC, des sections semi-minces de nerf optique (ON), et de la quantification des axones survivants, qui ont été décrits avant13.
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Résultats
Peu de temps après l'injection, nous pouvons facilement identifier les souris qui ne produisent pas d'hypertension oculaire stable en raison des gouttelettes SO étant trop petites (1,5 mm)13. Ces animaux sont exclus des expériences ultérieures. Après les procédures d'injection, plus de 80% des souris injectées SO se retrouvent avec des gouttelettes de plus de 1,6 mm. Nous avons mesuré l'IOP de ces yeux de souris une fois par semaine pendant 8 semaines après une seule injection de SO. L'IOP de l'œi...
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Discussion
Ici nous démontrons une procédure simple mais efficace pour induire l'élévation soutenue d'IOP dans l'oeil de souris par injection intracamérale de SO. Cette procédure peut être apprise rapidement par toute personne ayant de l'expérience en microdissection au microscope. Le principal risque potentiel d'échec est la fuite de SO de l'incision cornéenne. Cependant, l'un des avantages de l'utilisation de SO est que parce que la gouttelette d'huile est visible et mesurable, nous pouvons facilement identifier les souris qui on...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail est soutenu par les subventions des NIH EY024932, EY023295, et EY028106 à YH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % | Akorn, Somerset | ||
| 10 mL seringue | BD | Luer-Lok Tip Aiguille | |
| 18G | BD | avec biseau régulier, longueur de l’aiguille : 25,4 mm | |
| 2,2,2-tribromoéthanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| Aiguille d’ophalmologie 33G | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL seringue | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| larmes artificielles | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Solution d’irrigation | Alcon Laboratories | ||
| Extracteur de micropipettes en verre à deux étages | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Système classique | Système EZ Isoflurane | ||
| VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bouteille | |
| IV Kits d’administration | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| CHLORHYDRATE DE KÉTAMINE | INJECTION VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| machine à chanfreiner microgrind | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0,05 » ID, 0,09 » OD, 10 ft. |
| Longueur huile de silicium (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| Tonomètre TonoLab | Colonial Medical Supply, Finlande | ||
| pommade antibiotique vétérinaire | Dechra Veterinary | 1223RX | Pommade ophtalmique BNP, Vetropolycin |
Références
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
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