In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Manu Prasad; Sankar Jagadeeshan; Maurizio Scaltriti; Irit Allon; Moshe Elkabets

doi:10.3791/60410

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Article de méthode

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

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DOI :

10.3791/60410

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9 janvier 2020

Manu Prasad^*¹^,² , Sankar Jagadeeshan^*¹^,² , Maurizio Scaltriti³ , Irit Allon²^,⁴ , Moshe Elkabets¹^,²

¹The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, ²Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, ³Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ⁴Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le développement de modèles murins avec des gènes spécifiques mutés dans les patients atteints de cancer de la tête et du cou est nécessaire pour la compréhension de la néoplasie. Ici, nous présentons un protocole pour la transformation in vitro des cellules primaires de langue murine utilisant un système adeno-associé de virus-Cas9 pour produire des lignes de cellules murines de HNC avec des altérations génomiques spécifiques.

Résumé

L'utilisation de cellules épithéliales normales primaires permet d'induire de façon reproductible les altérations génomiques nécessaires à la transformation cellulaire en introduisant des mutations spécifiques dans les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs, en utilisant des courte répétition palindromic (CRISPR) à base de technologie d'édition du génome chez la souris. Cette technologie nous permet d'imiter avec précision les changements génétiques qui se produisent dans les cancers humains à l'aide de souris. En transformant génétiquement les cellules primaires murines, nous pouvons mieux étudier le développement, la progression, le traitement et le diagnostic du cancer. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules épithéliales de langue de souris Cas9 cre-inductibles pour permettre l'édition de génome utilisant le virus adéno-associé (AAV) in vitro. Plus précisément, en modifiant KRAS, p53, et APC dans les cellules épithéliales normales de langue, nous avons produit une ligne de cellules de tête et de cou murine (HNC) in vitro, qui est tumorigenic dans les souris syngeneic. La méthode présentée ici décrit en détail comment générer des lignées cellulaires HNC avec des altérations génomiques spécifiques et explique leur pertinence pour prédire la progression tumorale chez les souris syngénéiques. Nous envisageons que cette méthode prometteuse sera instructive et utile pour étudier la biologie et la thérapie de tumeur de HNC.

Introduction

HNC est une malignité commune dans le monde¹. La modélisation de la genèse de la néoplasie HNC est actuellement à un tournant scientifique². Bien que de nombreuses mutations génétiques aient été identifiées dans HNC²^,³^,⁴ (p. ex., TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 et RAS), les combinaisons spécifiques d'altérations génomiques requises de concert pour induire hNC demeurent floues.

L'utilisation actuelle des lignées cellulaires humaines hNC a contribué de manière significative à élucider les mécanismes associés....