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Article de méthode

Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'islmnprénatal :GFP Souris transgéniques

10.5K vues

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DOI :

10.3791/60440

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12 novembre 2019

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1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce travail présente un protocole pour produire des cultures cellulaires homogènes des neurones moteurs oculomoteurs, trochléaires et spinaux primaires. Ces cultures peuvent être utilisées pour des analyses comparatives des caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs oculaires et spinaux.

Résumé

Les neurones oculomoteurs (CN3) et les neurones trochléaires (CN4) présentent une résistance remarquable aux maladies dégénératives des neurones moteurs comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) par rapport aux neurones moteurs rachidiens (SMN). La capacité d'isoler et de culture rattacher les CN3, les CN4 et les NSM primaires fournirait une approche des mécanismes d'étude sous-jacents à cette vulnérabilité sélective. À ce jour, la plupart des protocoles utilisent des cultures cellulaires hétérogènes, ce qui peut confondre l'interprétation des résultats expérimentaux. Pour minimiser les problèmes associés aux populations de cellules mixtes, les cultures pures sont indispensables. Ici, le premier protocole décrit en détail comment purifier et cultiver efficacement les CN3/CN4 aux côtés des homologues SMN des mêmes embryons en utilisant le jour embryonnaire 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embryons de souris transgéniques. Le protocole fournit des détails sur la dissection et la dissociation des tissus, l'isolement cellulaire à base de FACS et la culture in vitro de cellules des noyaux CN3/CN4 et SMN. Ce protocole ajoute un nouveau système de culture in vitro CN3/CN4 aux protocoles existants et fournit simultanément une culture SMN pure et équivalente à l'âge pour la comparaison. Des analyses axées sur les caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs sont réalisables dans ce système de culture. Ce protocole permettra de rechercher les mécanismes qui définissent le développement des neurones moteurs, la vulnérabilité sélective et la maladie.

Introduction

La culture des neurones moteurs primaires est un outil puissant qui permet l'étude du développement neuronal, de la fonction et de la susceptibilité aux facteurs de stress exogènes. Les cultures de neurones moteurs sont particulièrement utiles pour l'étude des maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA)1,2, dont les mécanismes de la maladie sont incomplètement compris. Fait intéressant, malgré la mort cellulaire significative des neurones moteurs rachidiens (SMN) chez les patients atteints de SLA et les souris modèles de SLA, la mort cellulaire dans les neurones oculomoteurs (CN3) et les neurones trochléaires (CN4) sont relativement rares1,3,4,5,6,7,8,9. Par conséquent, des analyses comparatives des cultures pures des CN3/CN4 et des NSM pourraient fournir des indices importants sur les mécanismes sous-jacents à la vulnérabilité relative. Malheureusement, un obstacle majeur à de telles analyses a été l'incapacité de cultiver des cultures purifiées de ces neurones moteurs.

De nombreux protocoles ont été décrits pour la purification des SMN à partir de modèles animaux. La plupart de ces protocoles utilisent la centrifugation de gradient de densité10,11,12 et/ou p75NTR-techniques de panoramique à base de cellules à base d'anticorps13,14,15,16. La centrifugation de gradient de densité exploite la plus grande taille des SMN par rapport à d'autres cellules spinales, tandis que p75NTR est une protéine extracellulaire exprimée exclusivement par des SMN dans la moelle épinière. Près de 100% pure cultures SMN ont été générés par l'un ou les deux de ces protocoles11,12,14. Cependant, ces protocoles n'ont pas réussi à générer des cultures CN3/CN4 parce que les CN3/CN4 n'expriment pas p75NTR, et d'autres marqueurs CN3/CN4 spécifiques n'ont pas été identifiés. Ils sont également plus petits que les NSM et, par conséquent, plus difficiles à isoler en fonction de la taille. Au lieu de cela, les études in vitro de CN3 ou CN4se se sont appuyées sur des cultures dissociées17,18,19,20,21, explanter17,22,23,24,25,26, et tranche27,28 cultures, qui sont composées de types de cellules hétérogènes, et aucun protocole n'a existé pour le l'isolement et la culture des CN3 primaires ou des CN4.

Ici, un protocole est décrit pour la visualisation, l'isolement, la purification et la culture des CN3, des CN4 et des NSM du même jour embryonnaire 11,5 (E11.5) IslMN:GFP souris transgéniques29 (Figure 1, Figure 2A). IslMN:GFP étiquette spécifiquement les neurones moteurs avec un GFP farnédilaté qui se localise à la membrane cellulaire. Ce protocole permet de comparer les espèces et l'âge de plusieurs types de neurones moteurs afin d'élucider les mécanismes pathologiques dans la maladie des neurones moteurs.

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Protocole

Toutes les expériences utilisant des animaux de laboratoire ont été réalisées conformément aux lignes directrices des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et avec l'approbation du Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Hôpital pour enfants de Boston.

1. Mise en place d'accouplements chronométrés avant la dissection

  1. Pour générer des souris embryonnaires prénatales pour la récolte des neurones moteurs, peser chaque souris femelle et mettre en place l'accouplement chronométré entre les souris transgéniques IslMN:GFP adultes 11,5 jours avant le jour de l'isolement neuronal. Pour développer ce protocole, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP souris, âgés de 2 à 9 mois, ont été utilisés et l'accouplement chronométré a été mis en place dans la soirée.
  2. Examinez les souris femelles pour les prises vaginales le lendemain matin. Considérez la date à laquelle le bouchon est identifié comme jour embryonnaire (E) 0,5.
  3. Peser les souris femelles et examiner les chiots à l'aide de l'échographie (voir tableau des matériaux) entre E8.5-11. Vérifiez les signes d'accouplement réussi.
    1. Confirmez l'accouplement réussi en détectant le gain de poids chez les souris femelles (habituellement 1,5 g sur E9.5 s'il y a plus de 5 à 6 embryons).
    2. Confirmer visuellement les embryons par ultrasons. Les embryons sont facilement détectables par ultrasons après E9.5. Les échographies sont effectuées uniquement sur les femmes qui ont pris du poids parce qu'elles sont plus souvent enceintes que celles qui ne le font pas.
      REMARQUE: Les souris femelles peuvent prendre du poids pour des raisons autres que la grossesse, de sorte que le gain de poids seul n'est pas un indicateur fiable de la grossesse. La confirmation par ultrasons empêche les sacrifices inutiles de femmes qui ne sont pas enceintes, mais qui ne sont pas cruciales si elles ne sont pas disponibles.

2. Conditions de dissection et préparation des instruments

  1. Effectuer tous les revêtements (sauf le nettoyage acide des couvertures), la préparation des médias, la dissociation des tissus (à l'exception de la centrifugation et l'incubation), et le travail de culture dans une hotte à flux laminaire pour assurer la stérilité des neurones moteurs des médias et des embryons.
  2. En accordavec une attention particulière à la technique stérile, effectuez une dissection tissulaire à l'extérieur d'une hotte à débit laminaire avec un risque minimal de contamination.
  3. Stérilisez une plaque de dissection, une paire de ciseaux microdissés, une paire de pinces de pansement, deux paires de pinces À pinces À #5 Dumont, un couteau microdissé, et une mini cuillère perforée Moria en plongeant dans 70 % d'éthanol avant d'être utilisé.

3. PDL/Laminin Coating of Dishes/Coverslips

REMARQUE: La culture a dissocié les neurones moteurs primaires dans 96 plaques de puits ou 24 puits, selon le nombre de cellules requises pour l'application. Les cellules peuvent être représentées directement dans la plaque de culture tissulaire sans l'utilisation de résilles si les puits sont optiquement transparents et les épaisseurs sont compatibles avec l'imagerie.

  1. Pour les applications nécessitant des couvertures, préparez des couvertures nettoyées à l'acide, stérilisées et séchées à l'air au moins 2 jours avant l'isolement des neurones, comme décrit précédemment30. Les lots de couvertures peuvent être préparés de cette manière bien avant les expériences et peuvent être stockés jusqu'à 6 mois sans impact sur la qualité expérimentale.
  2. Préparer une solution de travail de 20 g/mL poly D-lysine (PDL) en phosphate tamponné saline (PBS) 2 jours avant l'isolement neuronal.
    1. Aliquot PDL (1 mg/mL) à l'avance et stocker à -20 oC comme solution de stock.
  3. Couvrez la surface de chaque bordereau ou le puits de la plaque de culture tissulaire avec une solution de travail de solution PDL suffisante (p. ex., 100 L par puits sur 96 plaques de puits ou 500 l par puits sur 24 plaques de puits avec ou sans couvertures). Incuber toute la nuit à 37 oC.
  4. Le lendemain, lavez 3x avec de l'eau stérilisée.
    1. Sceller les assiettes avec du film de paraffine et conserver les assiettes lavées enduites de PDL à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 1 mois si elles sont séchées complètement après le lavage final.
  5. Préparer une solution de travail avec 10 l de laminin (1,1 à 1,2 mg/ml) dans 1,2 mL de PBS.
    1. Stocks de lamininali (1,1 à 1,2 mg/ml) à l'avance et entremtuens à -80 oC.
  6. Couvrir la surface de chaque bordereau ou bien avec une solution de laminine suffisante pour enrober uniformément la surface. Incuber pendant au moins 2 h à 37 oC avant de l'utiliser.
    REMARQUE: Les plaques et les plaques de couverture enduites de PDL/laminin peuvent être stockées jusqu'à 1 semaine à 37 oC, mais la lamininine fraîchement enrobée est préférable. Retirer la laminine directement avant de placage30. Laminin ne doit pas être autorisé à sécher. Si les plaques doivent être stockées pendant plus de plusieurs heures, elles doivent être enveloppées dans du film de paraffine.

4. Préparation de dissection, de la culture de neurones moteurs, et des solutions de dissociation

REMARQUE: Les concentrations entre parenthèses indiquent les concentrations finales de chaque réactif.

  1. Préparer le milieu de dissection.
    1. Décongeler le sérum de cheval inactivé par la chaleur pendant la nuit à 4 oC, préparer 1 mL d'aliquots et conserver à -20 oC. Décongeler les aliquots à RT directement avant utilisation.
    2. Conserver le supplément de B27 (50x) dans 1 ml d'aliquots à -20 oC. Décongeler les aliquots à RT immédiatement avant utilisation. Évitez les cycles de gel/dégel.
    3. Conserver le supplément de glutamine (100x) à 4 oC ou -20 oC. Diviser en 0,5 ml d'aliquots en stockant à -20 oC.
    4. Conserver la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) dans 1 mL d'aliquots à -20 oC. Décongeler les aliquots à RT immédiatement avant utilisation.
    5. Pour rendre le milieu de dissection, mélanger 9,4 mL d'Hibernate E avec 200 l de sérum de cheval (2 %), 200 oL de supplément de 50 x B27 (1x), 100 oL de supplément de glutamine 100x (1x) (p. ex. GlutaMAX) et 100 l de 10 000 U/mL de pénicilline-streptomycin (100 UL/mL). Utilisez ce milieu pour recueillir les tissus disséqués et faire la suspension finale des cellules dissociées.
    6. Ajouter 500 l de la dissection moyenne à individuelle 1,7 mL tubes microcentrifuge pour la collecte des tissus la veille de l'isolement neuronal. Préparer un tube pour chaque type de tissu qui sera recueilli (p. ex., contrôle positif, contrôle négatif, CN3/CN4, SMN) et le stocker à 4 oC avant l'utilisation.
    7. Combinez 49 mL de milieu hibernat E à faible fluorescence avec 1 ml de supplément B27 (1x) et remplissez une plaque de 24 puits avec ce milieu (2 mL/bien) la veille de l'isolement neuronal. Utilisez ce plat pour la collecte d'embryons de souris. Conserver à 4 oC avant l'utilisation.
  2. Préparer le milieu de culture des neurones moteurs.
    1. Préparer 250 aliquots ll de 25 mM 2-mercaptoethanol dans le milieu L15 de Leibovitz. Conserver à -20 oC.
    2. Générez 5 aliquots ll de 100 solutions de BDNF, CNTF et GDNF diluées dans de l'eau stérilisée. Conserver à -80 oC et décongeler les aliquots à RT immédiatement avant l'utilisation.
    3. Préparer une solution de forskoline de 10 mM en ajoutant 64 ll de sulfoxure de diméthyle (DMSO) à 5 mg (1,0670 M) de forskoline et de vortex pour bien se dissoudre complètement. Ajouter ensuite de l'eau stérilisée (1,003 ml) à la solution DMSO et à un puits de vortex. Entreposer 12 aliquots de 10 mm de forskoline à -20 oC et décongeler les aliquots à RT immédiatement avant l'utilisation.
    4. Préparer 12 aliquots ll de 100 mM d'isobutylmethylxanthine (IBMX) dilués dans DMSO. Conserver à -20 oC et décongeler les aliquots à RT immédiatement avant l'utilisation.
    5. Pour rendre le milieu de culture des neurones moteurs, mélanger 9,4 ml de milieu neurobasal avec 200 l de sérum de cheval (2 %), 200 l de supplément de 50x B27 (1x), 100 oL de supplément de glutamine 100x (1x 100 oL de 10 000 U/m : pénicilline-streptomycine (100 U/mL), et 20 l de 25 mM 2-mercaptoethanol (50 M), de préférence directement avant utilisation. Cette étape peut être effectuée jusqu'à 1 jour avant l'isolement des neurones.
    6. Juste avant l'utilisation, ajouter 1 oL chacun de 100 G/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL), et GDNF (10 ng/mL) et 10 oL de forskoline de 10 mM (10 m) et 10 ML de 100 mIBMX (100 m) au milieu de la culture du moteur. Préréchauffer le milieu à 37 oC.
  3. Préparer les solutions de dissociation.
    1. Préparer la solution de papaïne (20 U/mL papain et 0,005% DNase) et une solution d'inhibiteur d'albumine-ovomucoid (1 mg/mL inhibiteur ovomucoid, 1mg/mL albumin, et 0.005% DNase) suivant les instructions du fabricant.
    2. Préparer 500 aliquots ll de chacune des solutions d'inhibiteurs ovomucoid et de papaïne et entreposer à -80 oC. Décongeler les aliquots à 37 oC immédiatement avant l'utilisation.

5. Dissection du cerveau du cerveau et de la moelle épinière ventrales

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes suivantes, à l'exception des étapes 5.1.1-5.1.3 et 5.1.5-5.1.6 sous un stéréomicroscope de dissection de fluorescence. Le temps total de dissection par expérience est généralement de 3 à 5 h, selon la compétence à la technique de dissection et le nombre de neurones moteurs requis pour chaque expérience.

  1. Dissection ventrale de midbrain
    1. Euthanasier une souris enceinte environ 11,5 jours après la fécondation par le gaz carbonique et la luxation cervicale.
    2. Vaporiser l'abdomen à fond avec de l'éthanol et enlever l'utérus à l'aide de ciseaux microdisséssants stériles et de forceps de pansement du pouce. Laver l'utérus brièvement dans le PBS stérile, puis transférer à la plaque de dissection remplie de PBS stérile préréfrigéré.
    3. Retirez soigneusement les embryons islMN:GFP-positifs de l'utérus à l'aide de ciseaux microdissés stériles, de pinces à pansement du pouce et de pinces À #5 Dedumont dans un PBS stérile glacé sous la lumière vive du microscope. À l'aide d'une cuillère stérile Moria mini-perforée, transférer chaque embryon dans un puits séparé d'une plaque de 24 puits remplie d'un milieu de faible fluorescence Hibernate-E préréfrigéré complété par 1x B27. Gardez la plaque de 24 puits sur la glace.
    4. Transférer un embryon dans une plaque de dissection stérile et le recouvrir complètement de la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hank, froide et stérile.
    5. Assurez-vous que les étapes de dissection sont effectuées sous l'illumination de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du microscope. À l'aide d'une pince à épiler, enlever la queue et le visage de l'embryon sans endommager le cerveau moyen (Figure 2Ba). Placez l'embryon enclin avec des membres chevauchés en dessous et la queue pointant vers l'avant du microscope, vers le dissector (indiqué par un astérisque, Figure 2Bb).
    6. À l'aide d'une pince à épiler, ouvrir le toit du quatrième ventricule afin de générer une petite ouverture. Utilisez cette ouverture pour crocheter des pinces dans l'espace créé entre le quatrième ventricule et son toit. Disséquer le long de la surface dorsale de l'embryon rostral au cortex et latérale à la plaque de plancher et à la colonne motrice (Figure 2Ca,b). Ouvrez le tissu disséqué d'une manière ouverte-livre pour indiquer les noyaux GFP-positifs CN3 et CN4.
      REMARQUE: Un petit morceau de tissu du cerveau moyen ventral contenant du mésenchyme, du CN3 et du CN4 sera maintenant exposé.
    7. Séparez soigneusement le cerveau ventral du milieu de l'embryon et retirez le tissu méningéàen à l'aide d'une pince à épiler et d'un couteau microdissétant. Disséquez les noyaux CN3 et CN4 positifs bilatéraux de GFP loin de la plaque de plancher et d'autres tissus environnants GFP-négatifs à l'aide de pinces à épiler et d'un couteau microdissécutoire (figure 2D). Maximisez le nombre de neurones moteurs GFP-positifs dans le tissu excisé, mais évitez de les toucher ou de les endommager.
    8. Si une collection de noyaux CN3 et CN4 distincts est désirée, coupez le long de la ligne médiane de ces deux noyaux (ligne pointillée jaune dans la figure 2D). À l'aide d'une pipette P1000, recueillir le tissu ventral du cerveau ventral disséqué avec un HBSS minimal et le placer dans un tube de microcentrifuge de 1,7 ml étiqueté rempli de milieu de dissection (voir l'étape 4.1.5). Conserver sur la glace jusqu'à la dissociation.
    9. Continuer à mettre en commun les cerveaux ventrales à partir d'embryons supplémentaires dans le même tube jusqu'à ce que le nombre total réponde à l'exigence expérimentale (se référer à l'étape 8 pour les numéros cellulaires idéaux).
      REMARQUE: Une collection mise en commun d'au moins 10 midbrains ventral produisant environ 1 x 104 neurones moteurs CN3/CN4 est recommandée parce que les tissus sont sujets au stress pendant la dissociation et le tri.
  2. Dissection ventrale de moelle épinière
    1. Gardez l'embryon enclin avec la tête face à l'avant du microscope, vers le dissector. Tenez l'embryon avec une pince à épiler et insérez la pointe de l'autre paire de pinces dans la partie caudale non ouverte du quatrième ventricule.
    2. Ouvrez le reste du cerveau postérieur et de la moelle épinière dorasiquement sur l'étendue rostrocaudale entière de l'embryon. Ouvrez en coupant le tissu dorsal, à partir du quatrième ventricule et en travaillant vers le canal central de la moelle épinière caudale en utilisant les forceps comme ciseaux (Figure 2Ca,b). Prenez soin d'éviter de toucher ou d'endommager la moelle épinière ventrale au cours de cette procédure.
    3. Tenez l'embryon avec une pince à épiler et pincez le lambeau du tissu dorsal de chaque côté avec l'autre paire de pinces (Figure 2Ea,b).
      REMARQUE: Les tissus dorsaux excisés contiennent la peau dorsale, le mesenchyme, les ganglions de racine dorsal (DRGs), le cerveau postérieur dorsal, et la moelle épinière. Enlever autant de ces tissus que possible sans endommager les noyaux SMN, car ils sont adhésifs et peuvent piéger les NMS pendant le filtrage ou provoquer l'engorgement pendant le tri FACS.
    4. Retirez la moelle épinière ventrale à l'aide du couteau à microdissection pour percer directement en dessous du SMN GFP-positif. Soulevez la moelle épinière ventrale avec des mouvements semblables à des scies des deux côtés (Figure 2Fa,b). Couper la moelle épinière ventrale flottante transversalement directement au-dessus de C1, où les premiers projets de corne antérieure GFP-positif (Figure 2G). De plus, coupez transversalement à la limite supérieure du membre inférieur (Figure 2G). Enlever la partie cervicale (C1)-lombaire (L2-L3) de la moelle épinière ventrale après cette procédure.
    5. Placez le côté dorsal ventral de moelle épinière vers le haut et maintenez en appuyant sur le tissu GFP-négatif entre les colonnes GFP-positives de SMN avec une paire de pinces. Enlever le mesenchyme, les DRG et la moelle épinière dorsal en coupant les deux côtés de la colonne SMN gFP-positive avec le couteau de microdissection (Figure 2H). Prenez soin de maximiser les neurones moteurs GFP-positifs sans les endommager.
    6. À l'aide d'une pipette P1000, recueillir le tissu ventral disséqué de la moelle épinière avec un MINIMUM de HBSS et le placer dans le tube microcentrifuge de 1,7 mL étiqueté SMN rempli de milieu de dissection. Conserver sur la glace jusqu'à la dissociation. Continuer à mettre en commun les moelles épinières ventrales à partir d'embryons supplémentaires dans le même tube jusqu'à ce que le nombre total réponde aux exigences expérimentales.
      REMARQUE: La collecte d'au moins trois moelles épinières ventrales produisant environ 2,1 x 104 SMN est recommandée parce que les tissus sont sujets au stress pendant la dissociation et le tri.
    7. Recueillir les neurones moteurs faciaux et les extrémités des embryons de souris IslMN:GFP comme contrôles GFP-positifs et GFP-négatifs pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), respectivement. Les extrémités sont GFP-négatives parce que les axones GFP-positifs des SMN n'ont pas encore étendu dans les extrémités à cet âge embryonnaire.

6. Dissociation tissulaire

REMARQUE: Le temps total de dissociation est généralement de 1,5 h par expérience.

  1. La solution d'inhibiteur de la papaïne chaude et de l'albumine-ovomucoid aliquots à 37 oC 30 min avant la dissociation.
  2. Faites brièvement tourner les tissus microdissés à basse vitesse.
  3. À l'aide d'une pipette P100, retirez soigneusement autant d'Hibernate E que possible sans aspirater les tissus.
    REMARQUE: Assurez-vous d'enlever tous les résidus Hibernate E après cette étape pour éviter de réduire l'efficacité de la dissociation papaïne dans l'étape suivante.
  4. Ajouter le volume approprié de solution de papaïne (tableau 1) à chacun des tubes microcentrifuges de 1,7 ml contenant les échantillons de tissus microdissés.
    REMARQUE: Le volume approprié de papain pour la dissociation a été déterminé afin de maximiser la dissociation efficace tout en minimisant le stress sur les cellules.
  5. Triturate doucement 8x avec une pipette P200. Effectuer toutes les étapes de trituration doucement pour préserver la viabilité des neurones moteurs.
  6. Incuber les tubes contenant les tissus pendant 30 min à 37 oC, en agitant par doigt clignotant 10 fois toutes les 10 min. Triturate doucement chaque suspension 8x avec une pipette P200 après l'incubation. Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min.
  7. Pour assurer l'efficacité de l'inhibition ovomucoid dans l'étape suivante, utilisez une pipette P1000 pour enlever et jeter autant de supernatant que possible sans aspiration des tissus.
  8. Resuspendre les granulés dans le volume approprié de solution d'inhibiteur albumin-ovomucoid (tableau 1) en tritutant doucement 8x avec une pipette P200.
  9. Attendez 2 min pour permettre à tous les morceaux restants de tissu non dissocié de se déposer au fond du tube.
  10. Recueillir autant de supernatant que possible sans aspirater les tissus non dissociés à l'aide d'une pipette P200. Transférer le supernatant dans des tubes microcentrifugefrais de 1,7 ml.
  11. Si certains morceaux de tissu restent non dissociés après l'étape 6.10, répétez les étapes 6.8-6.10 pour les tissus non dissociés qui restent dans les tubes microcentrifugerisateurs originaux de 1,7 mL pour maximiser le rendement final des cellules dissociées tout en minimisant le stress sur les cellules dissocié précédemment, contenu dans le supernatant de l'étape 6.10.
  12. Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement et jetez le supernatant à l'aide d'une pipette P1000.
  13. Resuspendre la pastille dans le volume approprié du milieu de dissection (tableau 1) en pipetting 8x à l'aide d'une pipette P1000. Le volume approprié de la suspension finale a été déterminé de sorte que la densité cellulaire ne dépasse pas 107 cellules/mL, ce qui peut bloquer le flux de la machine de cytométrie d'écoulement, mais aussi de sorte que les cellules ne soient pas excessivement diluées, ce qui entraîne une vitesse de tri ralentie.
  14. Filtrer les suspensions à travers des passoires cellulaires de 70 m pour éliminer les gros touffes ou les tissus non digérés. Transférer les suspensions dans des tubes à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml et les conserver sur glace jusqu'à ce que nécessaire.

7. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

REMARQUE: Ce protocole a été optimisé à l'aide d'un trieur FACS équipé d'un laser violet de 15 mw 405 nm, d'un laser bleu de 100 mw 488 nm, d'un laser orange de 75 mw 594 nm et d'un laser rouge de 40 mw 640 nm. Les cellules ont été triées comme fluide de gaine dans le PBS stérile dans des conditions aseptiques par une buse de 100 m. Afin de minimiser le stress cellulaire, le débit a été fixé à une pression d'échantillon de 1 à 3, de sorte qu'un maximum de 1 000 à 4 000 événements par seconde ont été acquis. Le temps total de FACS est typiquement 1/2 h par expérience.

  1. Configurez des tensions pour la diffusion vers l'avant et latérale de sorte que la population cellulaire puisse être visualisée correctement. La mise en place de tensions appropriées pour le tri cellulaire est complexe et nécessite un opérateur FACS expérimenté.
  2. Pour distinguer les différentes populations cellulaires, tracer les cellules en fonction de la taille déterminée par la zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) par rapport à la complexité interne déterminée par la zone de dispersion latérale (SSC-A). Dessinez une porte autour des cellules vivantes, comme indiqué dans la figure 3Aa et la figure Ba pour exclure les débris et les cellules mortes. Regroupez les cellules dans la région fermée en tant que population 1 (P1).
  3. Pour exclure les amas cellulaires et les doublets, tracez ensuite les cellules P1 en fonction de la largeur de dispersion latérale (SSC-W) par rapport au SSC-A. Portez la population de cellules individuelles en tant que population 2 (P2)(figure 3Ab et Figure Bb).
  4. Tracer les cellules P2 en fonction de la largeur de diffusion vers l'avant (FSC-W) par rapport au FSC-A et la barrière de la population de cellules simples en tant que population 3 (P3) (Figure 3Ac et Figure Bc).
    REMARQUE : L'utilisation de deux portes consécutives dans 7.3 et 7.4 exclut les amas et les doublets cellulaires (FSC-W élevé et FSC-A élevé).
  5. Cellules P3 de porte basées sur GFP contre allophycocyanin (APC). Le canal APC détecte l'autofluorescence. Le gating sur ce canal évite de capturer les cellules autofluorescentes. Utilisez des cellules gFP-négatives pour ajuster la tension pour les canaux fluorescents FITC/GFP. Idéalement, les portes de position pour ces populations cellulaires autour de 102. Sélectionnez les seuils de porte pour la population GFP-positive 4 (P4) individuellement pour chaque type de neurone moteur(figure 3Ad et Figure Bd).
    REMARQUE: Définir la porte GFP beaucoup plus haut pour les NMS que pour les CN3/CN4 afin d'obtenir une culture pure(figure 3Ad et Figure Bd). Une porte GFP inférieure pour les cultures SMN conduit à la contamination des cultures par des neurones gliales et non moteurs. C'est probablement parce qu'il y a l'expression de Bas-niveau de GFP dans quelques neurones de gligique et non-moteurs dus à un promoteur qui fuit. Le pourcentage de cellules GFP-positives par rapport aux cellules totales est généralement de 0,5 à 1,5 % pour les CN3/CN4 et de 1,5 à 2,5 % pour les NSM. Si la dissection a été couronnée de succès, ces chiffres peuvent servir de point de repère pour déterminer la position appropriée pour la porte positive du PFG(figure 3Ae et Figure Be).
  6. Effectuer FACS selon le protocole du fabricant. Recueillir les cellules P4 dans des tubes microcentrifugefrais de 1,7 ml remplis de 500 l de milieu de culture de neurones moteurs. Conserver sur la glace jusqu'au placage.
    REMARQUE: Bien que les cellules puissent être triées directement dans les puits, cela se traduit par un nombre inégal de cellules par puits. Trier les cellules dans des tubes microcentrifuges de 1,75 ml, puis les plaquer manuellement afin d'obtenir une distribution de placage plus uniforme.

8. Culture des neurones moteurs primaires purifiés

  1. Diluer les suspensions CN3/CN4 et SMN isolées par LES FACS avec un milieu de culture de neurones moteurs préréchauffé à 37 oC à des densités de 5 x 103 et 1 x 104 cellules/mL, respectivement.
    REMARQUE: Un embryon E11.5 donne environ 1 x 103 CN3/CN4 et 7 x 103 SMN. Cependant, ces rendements reposent fortement sur la pureté des tissus disséqués, la rigueur de la dissociation cellulaire et le seuil approprié des portes GFP pendant les FACS.
  2. Transférer 96 plaques de puits précouchées de PDL et de laminininde de l'incubateur de culture tissulaire de 37 oC à la hotte à flux laminaire et à aspirer la laminine de chaque puits. Utilisez immédiatement des assiettes et des récsinbières sans se laver.
  3. Ajouter 200 l de suspensions CN3/CN4 diluées et SMN dans le puits de 96 plaques de puits PDL/laminin-enduite. Les densités cellulaires finales devraient être de 1 x 103 et 2 x 103 cellules/puits pour CN3/CN4 et SMN, respectivement.
    REMARQUE: La densité initiale de placage des SMN dans 96 plaques de puits (2 x 103 cellules/puits) est le double de celle des CN3/CN4 (1 x 103 cellules/puits) afin d'obtenir des nombres et des densités de neurones moteurs finaux similaires à 2 et 9 jours in vitro (DIV) (4 x 102 et 2 x 102 cellules par puits, respectivement).
  4. Neurones de culture dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
  5. Nourrir les neurones tous les 5 jours en supprimant la moitié des vieux médias (100 L) et en remplaçant par le même volume de milieu de culture de neurones moteurs frais. Veiller à ce que les processus neuronaux deviennent visibles sur 1 DIV et deviennent plus épais et plus longs par 14 DIV (Figure 4). Les corps cellulaires neuronaux s'agrandissent et ont tendance à s'agréger dans les cultures à long terme, en particulier pour les SMN (figure 4).
    REMARQUE: Effectuer tous les changements moyens et de solution en laissant la moitié du volume moyen d'origine afin d'éviter de détacher les cellules cultivées. Cela comprend les étapes de fixation et d'immunocytochimie (ICC). Si tous les médias sont enlevés, quelle que soit la douceur, la plupart des cellules se détachent et seront emportées.

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Résultats

L'objectif de ce protocole était de purifier et de culture fortement à la fois les CN3/CN4 primaires et les NMc à long terme afin de permettre des analyses comparatives des mécanismes sous-jacents aux troubles des neurones moteurs (voir la figure 1 et la figure 2 pour vue d'ensemble).

Une fois que les neurones ont été isolés et cultivés avec succès en culture, les cultu...

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Discussion

Historiquement, les études in vitro des neurones moteurs CN3 et/ou CN4 se sont appuyées sur des cultures hétérogènes telles que les17,18,19,20,21, explanter17,22,23,24,25,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous remercions Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) pour l'enseignement des techniques de dissection SMN; le Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, le Immunology Division Flow Cytometry Facility de la Harvard Medical School, le Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core, et Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, d'autres membres du laboratoire Engle et des membres du consortium Project ALS pour une assistance technique et une discussion réfléchie. Cette étude a été appuyée par le projet SLA. En outre, R.F. a été financé par la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad et la subvention de formation des NIH en génétique T32 GM007748; J.J. a reçu l'appui du programme de formation DES NIH/NEI sur les bases moléculaires des maladies oculaires (5T32EY007145-16) par l'entremise du Schepens Eye Research Institute et du Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) par l'hôpital pour enfants de Boston; M.C.W a reçu le soutien de NEI (5K08EY027850) et de la Children's Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); et E.C.E. est un chercheur de l'Institut médical Howard Hughes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 488-conjuguée chèvre IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-conjuguée F(ab')2 chèvre IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Supplement (50x), sans sérumThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Cytomètre en fluxBD Bioscience- Il dispose de 4 systèmes laser équipés de lasers 405, 488, 594 et 640 nm.
BD Falcon 70&mu ; m Crépines à cellules en nylonCORNING352350Pour filtrer les cellules dissociatrices avant FACS.
BD Falcon Tubes à essai à fond rond avec capuchon à pressionCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, PS, F-bottom (puits de cheminée)Greiner Bio-One International655090Nous avons essayé plusieurs plats à 96 puits et c’était le meilleur pour la culture et les analyses après ICC
Lunettes de couverture circulaire pour la microscopieKarl Hecht & Assistent1001/14Nous avons utilisé cette lamelle car la zone était grande (diamètre : 14 mm).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-272
Acide cyclopiazonique issu de Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. L’un des facteurs de stress du RE.
4&prime ;,6-diamidino-2-phénylinodole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie TipsRoboz Surgical InstrumentRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-305
Supplément GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061
Hanks' Solution saline équilibrée (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E low fluorescenceBrainBitsHELFLa fluorescence qui entrave l’observation des expressions de la GFP de l’embryon doit être faible.
Sérum de cheval, inactivé par la chaleur, origine Nouvelle-ZélandeThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutylméthylxanthine
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz' s L15 moyenThermo Fisher Scientific11415064
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Micro Ciseaux de dissectionInstrument chirurgical RobozRS-5913
Micro Couteau 4,75" 1,7 mm x 27 mmInstrument chirurgical RobozRS-6272
Moria Mini cuillère perforéeOutils scientifiques fins10370-19
Anticorps monoclonal de souris contre la &bêta ;-tubuline neuronale de classe III (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti microscope à fluorescence de cellules vivantes et logiciel ElementsNikon-Differentialcontrast images et images d’immunocytochimie des cultures cellulaires ont été capturées avec ces équipements
Acide nitrique 90 %, Fuming (certifié ACS)Fisher ScientificA202-212Pour le rinçage des lamelles Olympus
1,7 mL Microtubes, ClearGenesee Scientific22-281Ce sont les tubes que nous avons décrits dans le contexte « tubes microcentrifuges de 1,7 mL ».
ValuingtonBiochemical CorpLK003150solution de papaïne et la solution d’inhibiteur d’alubumine-ovomucoïde sont préparées à partir de ce kit.
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lysine (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Anticorps monoclonal de lapin contre Islet1Abcamab1095171:200
SMZ18 et stéréomicroscopes à zoom SMZ1500 avec DS-Ri1 La dissectionl’appareil photo Nikon a été réalisée et des images d’embryons et de tissus disséqués sont capturées à l’aide de ces microscopes à fluorescence.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B Kit 0,9 kgDow Corning1696157Nous fabriquons des boîtes de dissection à l’aide de ce kit.
Boîtes traitées TC, 100 mm x 20 mmGenesee Scientific25-202Nous fabriquons des boîtes de dissection à l’aide de cette boîte.
Pince à pansement Thum 4,5" Dentelée 2,2 mm Largeur de l’emboutInstrument chirurgical RobozRS-8100
Transducteur pour LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSPour l’échographie sur souris femelles
Appareil à ultrasons vétérinaireGE HealthcareLOGOQ e VETPour l’échographie sur souris femelles
Zeiss LSM série 700 microscope confocal à balayage laser et logiciel ZenCarl Zeiss-image confocale de l’embryon a été capturée avec ces équipements
lame interference de Une

Références

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