Tri cellulaire activée par fluorescence pour l’isolement des populations de cellules sclérosiennes

Résumé

Les coraux créent des écosystèmes de biodiversèses importants pour les humains et les organismes marins. Cependant, nous ne comprenons toujours pas le plein potentiel et la fonction de nombreuses cellules coralliennes. Ici, nous présentons un protocole développé pour l’isolement, l’étiquetage et la séparation des populations de cellules coralliennes pierreuses.

Résumé

Les récifs coralliens sont menacés en raison de facteurs de stress anthropiques. La réponse biologique du corail à ces facteurs de stress peut se produire au niveau cellulaire, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. Pour étudier la réponse des coraux aux facteurs de stress, nous avons besoin d’outils pour analyser les réponses cellulaires. En particulier, nous avons besoin d’outils qui facilitent l’application d’essais fonctionnels pour mieux comprendre comment les populations cellulaires réagissent au stress. Dans la présente étude, nous utilisons le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour isoler et séparer différentes populations cellulaires dans les coraux pierreux. Ce protocole comprend : (1) la séparation des tissus coralliens du squelette, (2) la création d’une suspension à cellule unique, (3) l’étiquetage des cellules coralliennes à l’aide de divers marqueurs pour la cytométrie des débits, et (4) les stratégies de gating et de tri cellulaire. Cette méthode permettra aux chercheurs de travailler sur les coraux au niveau cellulaire pour l’analyse, les essais fonctionnels et les études d’expression génique de différentes populations cellulaires.

Introduction

Les récifs coralliens sont l’un des écosystèmes les plus importants sur Terre. Ils facilitent la biodiversité en fournissant des habitats essentiels pour les poissons et les invertébrés et sont essentiels pour soutenir les communautés anthropiques en fournissant des moyens de subsistance alimentaires et économiques grâce au tourisme¹. En tant que principal constructeur de récifs coralliens, l’animal corallien (Phylum: Cnidaria) aide également les communautés côtières en créant de grands cadres de carbonate de calcium qui atténuent les dommages causés par les vagues et les tempêtes².

Les coraux....

Protocole

1. Dissociation des tissus du squelette de corail par aérographe et compresseur

REMARQUE : Effectuez des marches sur la glace et protégez les mains avec des gants.

1. Assembler le kit d’aérographe en connectant le compresseur d’air, le tuyau et l’aérographe(figure 2). Réglez la jauge de pression entre 276 et 483 kPa.
   REMARQUE : Le compresseur et le tuyau d’air recommandés pour cette étude ont été prédéfinis à une pression maximale de 393 kPa. L’utilisation à l’extérieur de cette plage de 276-483 kPa peut entraîner soit un retrait inadéquat des cellules du squelette, soit une rupture des membranes cell....

Résultats

Dans l’ensemble, ce protocole est utile parce qu’il facilite l’identification et la collecte des populations vivantes de cellules coralliennes qui peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles. Le flux de travail a commencé avec la séparation mécanique des tissus coralliens du squelette sous-jacent de carbonate de calcium(figure 1). Il s’agit de l’une des étapes initiales les plus importantes parce que la technique incorrecte entraîne une mortalité .......

Discussion

Ce protocole a été adapté de Rosental et coll.¹⁸ et développé pour l’identification et l’isolement des cellules de P. damicornis. La méthodologie se concentre sur le processus de filtrage des échantillons pour enlever les débris, les cellules non viables, et les cellules hébergées par Symbiodiniaceae par l’examen de facteurs intrinsèques cellulaires, y compris la taille relative des cellules, la granularité des cellules relatives, l’autofluorescence cellulaire, et la présence de membranes.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d’aérographe & Compresseur	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Kit d’aérographe à alimentation par siphon à simple action avec compresseur Master TC-20 & Tuyau d’air
BD FACSAria II	BD	644832
Coupe-os	En vrac Récif Approvisionnement	205357	Océans Merveilles Corail Stony Bone
Cutter Cellule Strainer	Corning	352340	40 um ; BD Faucon ; emballé individuellement ; stérile; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2,5 mM dans DMSO ; Excitation/Émission : 485/520 nm
Sac de collecte	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6 « L x 4 » W Sac poly refermable standard avec fermeture à glissière, transparent ; 2 mil d’épaisseur
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg dans H2O ; Excitation/Émission : 358/461 nm
Sérum de veau fœtal	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Inactivé par la chaleur à 57 ° ; C pour 30 minutes
Hémacytomètre	Sigma-Aldrich	Z359629	Hémacytomètre à lignes vives
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM en DMSO ; Absorption/Émission : 647/668 nm
Microtubes à centrifuger	VWR	87003-294	1,7 mL
de solution saline tamponnée au phophate (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7,4 ; 10X
Tubes à fond rond	VWR	352063	5 mL Seringue à tube rond en polypropylène
	BD	309628	1 mL BD Seringue Luer-Lok stérile, à usage unique en polycarbonate