Article de méthode

Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate

DOI :

10.3791/60451

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31 octobre 2019

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1Institute of Molecular Plant Sciences, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh, 3Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole décrivant comment i) assembler un vecteur auto-réplicant à l'aide de la boîte à outils modulaire de clonage CyanoGate, ii) introduire le vecteur dans un hôte cyanobactérieparpare par conjugaison, et iii) caractériser les souches transgéniques cyanobactéries en utilisant un lecteur de plaque ou cytométrie de flux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cyanobactéries sont un groupe diversifié d'organismes photosynthétiques procaryotiques qui peuvent être génétiquement modifiés pour la production renouvelable de produits industriels utiles. Les progrès récents de la biologie synthétique ont mené au développement de plusieurs boîtes à outils de clonage telles que CyanoGate, un système de clonage modulaire standardisé pour la construction de vecteurs plasmides pour la transformation ultérieure ou le transfert conjugal en cyanobactéries. Ici, nous énoncons une méthode détaillée pour l'assemblage d'un vecteur auto-réplication (par exemple, portant une cassette d'expression marqueur fluorescent) et le transfert conjugal du vecteur dans les souches cyanobactériennes Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus elongatus UTEX 2973. En outre, nous décrivons comment caractériser la performance d'une partie génétique (par exemple, un promoteur) à l'aide d'un lecteur de plaque ou d'une cytométrie de flux.

Introduction

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Les cyanobactéries sont des bactéries autotrophes qui peuvent être utilisées pour la biosynthèse d'une grande variété de produits métaboliques naturels et hétérologues de haute valeur1,2,3,4 ,5, 6. Plusieurs obstacles doivent encore être surmontés pour accroître leur viabilité commerciale, notamment les rendements relativement faibles par rapport aux bio-plateformes hétérotrophes (p. ex. Escherichia coli et levure)7. L'expansion récente de....

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Protocole

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1. Assemblage de vecteurs à l'aide des boîtes à outils Plant MoClo et CyanoGate

REMARQUE : Avant de procéder à l'assemblage vectoriel, il est fortement recommandé aux utilisateurs de se familiariser avec les structures de niveau vectoriel des systèmes Plant et CyanoGate MoClo12,15.

  1. Construction de pièces de niveau 0
    REMARQUE : Les parties de niveau 0 peuvent être synthétisées en tant que vecteurs complets ou en séquences linéaires pour l'assemblage avec les accepteurs de niveau 0 (p. ex., gBlocks, IDT). Alternativement, les séquences peuvent être amplifiées à partir d'u....

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Résultats

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Pour démontrer le flux de travail d'assemblage du Golden Gate, une cassette d'expression a été assemblée dans le vecteur d'acceptation de position 1 (pICH47732) contenant les parties suivantes de niveau 0 : le promoteur de l'operon Pcpc560 (pC0.005), la séquence de codage pour eYFP (pC0.008) et le double terminateur TrrnB (pC0.082)12. À la suite de la transformation de la réaction d'assemblage, des assemblages réussis ont été.......

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Discussion

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L'assemblage du Golden Gate présente plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes d'assemblage vectoriel, notamment en termes d'évolutivité20,21. Néanmoins, la mise en place du système Golden Gate dans un laboratoire nécessite du temps pour développer une familiarité avec les différentes parties et les bibliothèques vectorielles acceptor et les processus d'assemblage global. Une planification minutieuse est souvent nécessaire pour des assemblages plus comp.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Les auteurs sont reconnaissants au Réseau de biotechnologie et de recherche en sciences biologiques (BBSRC) du PHYCONET Biotechnology and Biological Research Council (BBSRC) en biotechnologie industrielle et en bioénergie (NIBB) et au Centre d'innovation en biotechnologie industrielle (IBioIC) pour leur soutien financier. GARG, AASO et AP reconnaissent le soutien financier du programme de doctorat BBSRC EASTBIO CASE (numéro de subvention BB/M010996/1), du programme de doctorat Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) et du programme de doctorat IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP), respectivement. Nous remercions Conrad Mullineaux (Queen Mary....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-galactopyranoside (X-gal)Thermo Fisher ScientificR0404Utilisé dans la version 2.1.3.
Adénosine 5&prime ;-triphosphate (ATP) sel disodiqueSigma-AldrichA2383Utilisé dans le tableau 2.
Agar (testé en microbiologie)Sigma-AldrichA1296-500gUtilisé en 8.3.
AgaroseBiolineBIO-41026Utilisé dans 6.
Cytomètre en flux Attune NxTThermo FisherScientific-utilisédans 4.3.1.
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA2153utilisée dans le tableau 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011utilisé dans le tableau 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291utilisé dans le tableau 2.
Carbenicilline disodiqueVWR InternationalA1491.0005Utilisé dans 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well platesSigma-AldrichCLS3527Utilisé en 4.1.3.
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100utilisé dans 3.6.2.
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104Kit d’extraction d’ADN. Utilisé dans 5.
FLUOstar Omega Lecteur de microplaquesBMG Labtech-Utiliséen 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Kit de purification de plasmide. Utilisé à l’étape 2.3.2.
Perles de verre (0,5 mm de diamètre)Produits BioSpec11079105Utilisé dans 5.2.
GlycérolThermo Fisher Scientific10021083utilisé dans 2.3.1, 3.6.2.
L’isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553utilisé dans 2.1.3.
Sulfate de kanamycine (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024Utilisé dans 2.1.3.
Filtres à membrane (0,45 &mu ; m)MF-MilliporeHAWP02500Utilisé dans les microplaques 3.3.7
, 96 puits, à fond plat (puits de cheminée) et micro ; CLEARGreiner Bio-One655096utilisé dans 4.2.1.
Kit d’extraction de gel d’ADN MonarchNew England BiolabsT1020Sutilisé dans 1.1.2.2.
Kit de nettoyage d’ADN Monarch PCRNew England BiolabsT1030Kit de purification d’ADN. Utilisé dans 1.1.2.3.
Incubateur Multitron Pro avec LED IncubateurInfors HT-Shakingavec lumières LED blanches. Utilisé dans 4.1.4.
MyTaq ADN polyméraseBiolineBIO-21108utilisée en 7.1.
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-Wutilisé dans la version 2.3.3.
One Shot TOP10 chimiquement compétent E. coliThermo Fisher ScientificC404010utilisé dans la version 2.1.1.
Solution saline tampon phosphatée (PBS) (concentré 10X)VWR InternationalK813Utilisé dans 4.3.2.
Q5ADN polymérase haute fidélitéNew England BiolabsM0491Sutilisée dans 1.1.2.1.
Échelle d’ADN à chargement rapide de 1 kbNew England BiolabsN0468Sutilisée dans la figure 4.
Tubes à bouchon à vis (1.5 ml)Starstedt72.692.210Utilisé dans 3.6.3
Chlorhydrate de dihydrocine de spectinomycine pentahydratéVWR InternationalJ61820.06Utilisé dans 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter à fond rond à 96 puitsThermo Fisher Scientific612U96Utilisé en 4.3.1.
T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificEL0011Utilisé dans le tableau 2.
TissueLyser IIQiagen85300Broyeur à billes. Utilisé dans la version 5.2.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering m....

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Mots-clés

Conjugaison des cyanobact riesbo te outils CyanoGateassemblage de vecteurs plasmidiquesSynechocystis PCC 6803Synechococcus elongatusanalyse par cytom trie en fluxdosage par lecteur de plaquesaccouplement triparentalassemblage Golden Gate

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