Article de méthode

Utilisation d’embryons de poisson zèbre Tg(Vtg1:mcherry) pour tester les effets œstrogéniques des composés perturbateurs endocriniens

DOI :

10.3791/60462

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8 août 2020

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1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici un protocole détaillé pour l’utilisation des embryons de poisson zèbre Tg(vtg1: mCherry) pour la détection des effets œstrogéniques. Le protocole couvre la propagation du poisson et le traitement des embryons, et met l’accent sur la détection, la documentation et l’évaluation des signaux fluorescents induits par les composés perturbateurs endocriniens (EDC).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il existe de nombreux composés perturbateurs endocriniens (EDC) dans l’environnement, en particulier les substances œstrogéniques. La détection de ces substances est difficile en raison de leur diversité chimique; par conséquent, de plus en plus de méthodes de détection d’effets sont utilisées, telles que les organismes biomonitor/bioindicateurs sensibles aux effets œstrogéniques. Ces organismes de biosurveillance comprennent plusieurs modèles de poissons. Ce protocole couvre l’utilisation de la lignée transgénique Tg(vtg1: mCherry) du poisson zèbre comme organisme de biosurveillance, y compris la propagation des poissons et le traitement des embryons, en mettant l’accent sur la détection, la documentation et l’évaluation des signaux fluorescents induits par EDC. Le but du travail est la démonstration de l’utilisation des embryons transgéniques Tg(vtg1: mCherry) pour détecter les effets œstrogéniques. Ce travail documente l’utilisation d’embryons transgéniques de poissons zèbres Tg(vtg1: mCherry) pour la détection des effets œstrogéniques en testant deux substances œstrogéniques, α- et β-zearalenol. Le protocole décrit n’est qu’une base pour la conception des essais; la méthode d’essai peut être modifiée selon les critères d’essai et les échantillons. En outre, il peut être combiné avec d’autres méthodes d’essai, facilitant ainsi l’utilisation future de la ligne transgénique.

Introduction

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Il y a un nombre important de composés perturbateurs endocriniens (EDC) qui sont parmi les substances les plus dangereuses dans notre environnement. Ce sont principalement des composés œstrogéniques qui contaminent l’eau des ressources naturelles. La diversité chimique des substances appartenant au groupe rend les tests de leur présence difficiles, car différentes méthodes d’analyse sont nécessaires pour leur détection. Sur la base de leur structure chimique, il est très difficile de déterminer si une substance est réellement capable d’agir comme un œstrogène. En outre, ces substances ne sont jamais présentes sous une forme pure dans l’environnement, de sorte que leurs effets peuvent être affectés par d’autres composés, trop1. Ce problème peut être résolu par des méthodes de détection d’effet, telles que l’utilisation d’organismes biomonitor/bioindicateurs qui présentent des effets œstrogéniques2,3,4,5.

Récemment, une variété de cellules ligne6 et de systèmes d’essai à base de levure2,3 ont été développés pour détecter les effets œstrogéniques. Cependant, ceux-ci ne sont généralement en mesure de détecter la liaison de la substance au récepteur d’oestrogène2,3. En outre, ils sont incapables de modéliser des processus physiologiques complexes dans l’organisme, ou de détecter les phases sensibles aux hormones des stades de la vie; ainsi, ils conduisent souvent à de faux résultats.

On sait que certains gènes réagissent sensiblement à l’œstrogène dans les organismesvivants 7. La détection des produits génétiques par des méthodes de biologie moléculaire est également possible au niveau de protéine ou d’ARNm8,9, mais implique généralement le sacrifice d’animaux. Les lois sur la protection des animaux sont devenues plus strictes, et il y a une demande croissante de systèmes d’essai alternatifs qui minimisent le nombre et la souffrance des animaux utilisés dans les expériences ou le remplacement du modèle animal par un autre système modèle10. Avec la découverte de protéines fluorescentes et la création de lignées de biomarqueurs, les technologies transgéniques offrent une bonne alternative11. Avec ces lignes, l’activation d’un gène sensible à l’œstrogène peut être testée in vivo.

Chez les vertébrés, le potentiel des poissons dans l’évaluation des risques environnementaux est exceptionnel. Ils offrent de nombreux avantages par rapport aux modèles de mammifères : étant des organismes aquatiques, ils sont capables d’absorber les polluants dans tout leur corps, produisent un grand nombre de descendants, et certaines de leurs espèces sont caractérisées par un temps de production de courte durée. Leur système endocrinien et leurs processus physiologiques présentent de grandes similitudes avec d’autres vertébrés et même avec les mammifères, y compris les humains12.

Plusieurs gènes pour la détection des effets œstrogéniques chez les poissons sont également connus. Les plus importants sont les récepteurs d’oestrogène aromatase-b, choriogenine-H, et vitellogénine (vtg)7,13. Récemment, plusieurs lignées de biocapteurs produisant des œstrogènes ont également été créées à partir de modèles de poissons utilisés en laboratoire, comme celui du poisson zèbre (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Le principal avantage du poisson zèbre dans la création de lignes de biocapteur est le corps transparent des embryons et des larves, parce que le signal de journaliste fluorescent peut alors être facilement étudié in vivo sans sacrifier l’animal10. En plus de la protection des animaux, il est également une caractéristique précieuse car il permet d’étudier la réaction d’un même individu à différents moments du traitement18.

Ces expériences utilisent un journaliste de vitellogenine transgénique zèbre ligne15. La construction transgène utilisée pour le développement de Tg(vtg1:mCherry) a un long (3,4 kbp) naturel vitellogenin-1 promoteur. Le récepteur d’oestrogène (ER) est une protéine d’exhausteur activée par des ligands qui est un représentant de la superfamille stéroïde/récepteur nucléaire. ER se lie à des séquences d’ADN spécifiques appelées éléments de réponse d’oestrogène (EER) avec une forte affinité et transactive l’expression des gènes en réponse à l’estradiol et d’autres substances œstrogéniques, de sorte que plus ERE dans le promoteur provoque une réponse plus forte19. Il y a 17 sites ERE dans la région de promoteur de la construction transgène Tg(vtg1:mCherry) et on s’attend à ce qu’ils imitent l’expression du gène vtg indigène15. Il y a une expression continue du signal fluorescent chez les femelles sexuellement matures. Cependant, chez les mâles et les embryons, l’expression dans le foie n’est visible que lors du traitement avec des substances œstrogéniques (figure 1).

figure-introduction-1
Figure 1 : Signal fluorescent rouge dans le foie du poisson zèbre adulte transgénique vtg1:mCherry et de 5 embryons de dpf, après induction de 17-ß-estradiol (E2). Chez les femelles et chez les hommes traités par E2 (25 μg/L temps d’exposition : 48hrs), une forte fluorescence du foie est visible même à travers la peau pigmentée. Aucun signal fluorescent n’est visible chez les mâles non traités (A). Après induction e2 (50 μg/L temps d’exposition : 0-120 hpf), un signal fluorescent rouge dans le foie de 5 embryons de dpf peut également être observé, ce qui n’est pas visible dans les embryons témoins (B). Bien que le signal fluorescent soit continuellement présent chez les femelles adultes, principalement les mâles et les embryons de la lignée sont appropriés pour détecter les effets œstrogéniques. (BF: champ lumineux, mCherry: vue de filtre fluorescent rouge, images simples, barre d’échelle A: 5mm, barre d’échelle B: 250 μm) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Semblable à la vitellogénine endogène, le journaliste mCherry n’est exprimé que dans le foie. Parce que la vitellogénine n’est produite qu’en présence d’œstrogènes, il n’y a pas de signal fluorescent dans les commandes. Parce que l’expression est seulement dans le foie, l’évaluation des résultats est beaucoup plus facile15.

La sensibilité et la facilité d’utilisation des embryons de cette lignée ont été étudiées sur divers mélanges de composés œstrogéniques ainsi que sur des échantillons environnementaux15,20, et dans la plupart des cas, des relations dose-réponse ont été documentées ( figure2). Toutefois, dans le cas de substances hautement toxiques, principalement hépatotoxiques (p. ex., zéaralenone), seul un signal fluorescent très faible peut être visible dans le foie des embryons traités et l’intensité maximale causée par le signal fluorescent peut être atteinte dans une très petite plage de concentration, ce qui rend difficile l’établissement de relations dose-effet20.

figure-introduction-2
Figure 2 : Diagramme dose-réponse (A) et images fluorescentes (mCherry) du foie (B) exposés au 17-α-ethynilestradiol (EE2), dans 5 larves de dpf vtg1:mCherry. Les résultats sont exprimés sous forme de densité intégrée générée par la force du signal et la taille de la zone touchée (±SEM, n = 60). 100% se réfère au maximum observé. L’intensité du signal fluorescent a augmenté progressivement avec la concentration. Barre d’échelle = 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Il existe plusieurs substances œstrogéniques dans l’environnement, comme 17-β-estradiol (concentration environnementale : 0,1–5,1 ng/L)21, 17-α-éthylestradiol (concentration environnementale : 0,16–0,2 μg/L)22, zéaralenone (concentration environnementale : 0,095–0,22 μg/L)23, bisphénol-A (concentration environnementale : 0,45–17,2 mg/L)24. Lors de l’essai de ces substances sous une forme purement active à l’aide d’embryons transgéniques mCherry, les concentrations d’effet les plus faibles observées (LOEC) pour la détection des signes fluorescents étaient de 100 ng/L pour 17-ß-estradiol, 1 ng/L pour 17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L pour la zéaralenone, et 1 mg/L pour le bisphénol-A (traitement 96–120 hpf), qui est très proche ou dans la gamme des concentrations environnementales des substances15. La ligne transgénique Tg(vtg1:mCherry) peut aider à détecter l’œstoïscité dans les échantillons d’eaux usées après une exposition directe. La ligne est aussi sensible que le test d’oestrogène de levure couramment utilisé, l’oestrogène de levure bioluminscente (BLYES) essai15. À l’aide de cette ligne, les effets protecteurs des bêta-cyclodextrines contre la toxicité induite par la zéaralénone ont été confirmés à l’aide de mélanges chimiques20.

Dans un rapport récent, l’utilisation in vivo de la lignée transgénique a été démontrée à l’aide de deux métabolites œstrogéniques de zéaralenone (ZEA), α- et β-zearalénol (α-ZOL et β-ZOL)25. La base de référence du protocole est appropriée pour étudier les effets œstrogéniques de plusieurs composés ou échantillons environnementaux sur les embryons de Tg(vtg1:mCherry).

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Protocole

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Le Protocole sur les animaux a été approuvé en vertu de la loi hongroise sur le bien-être des animaux et toutes les études ont été réalisées avant que les personnes traitées n’aient atteint le stade de l’alimentation libre.

1. Récolte et traitement des embryons

  1. Maintenir le poisson zèbre Tg(vtg1:mCherry) à 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, conductivité entre 525 ± 50 μS/m, niveau d’oxygène ≥80 % de saturation et 14 h de lumière et cycle foncé de 10 h.
  2. Remplissez les réservoirs d’accouplement avec de l’eau du système et mettez en place les poissons pour l’accouplement l’après-midi avant la récolte des œufs.
  3. Placez le poisson mâle et le poisson femelle dans le réservoir et séparez-les à l’aide d’un diviseur.
  4. Retirez le séparateur des réservoirs lorsque la lumière s’allume le lendemain matin. Vérifiez les réservoirs d’accouplement pour les œufs toutes les 15 à 20 minutes.
  5. Récoltez tous les embryons à l’aide d’une passoire à thé ou d’une maille fine densément tissée et combinez-les en une grande boîte de Pétri avec un tampon E3 (chlorure de sodium de 5 mM, chlorure de potassium de 0,17 mM, chlorure de calcium de 0,33 mM, sulfate de magnésium de 0,33 mM) ou de l’eau claire du système.
  6. Placez les embryons dans l’incubateur réglé à 25,5 ± 0,5 °C.
  7. Après 1–1,5 h, retirer et jeter les œufs non fertilisés ou mal divisés à l’aide d’un pipet de transfert en plastique sous un microscope à dissection.
    REMARQUE : Les œufs non fécondés sont opaques; les œufs fécondés sont transparents. Pour commencer le traitement à un stade ultérieur de développement, faites attention au développement normal des personnes traitées.
  8. Placez les embryons sélectionnés dans les récipients de traitement (p. ex., dans des boîtes de Pétri ou des plaques de culture tissulaire) qui ont déjà été étiquetés et remplis de différentes concentrations de la substance d’essai.
  9. Incuber les embryons à 25,5 ± 0,5 °C jusqu’à la fin de l’expérience.
    REMARQUE : Les embryons peuvent réagir avec une sensibilité individuelle significative à divers composés œstrogéniques, il est donc recommandé d’utiliser au moins 15 embryons dans au moins trois traitements répétés afin d’évaluer l’expérience correctement. Lors de la sélection du récipient, gardez à l’esprit que le développement d’un embryon nécessite au moins 200 μL d’eau26. Dans cette expérience, les embryons ont été incubés jusqu’à 120 hpf à 25,5 ± 0,5 °C.
  10. Actualiser la solution d’essai s’il est nécessaire de maintenir la concentration du traitement. Soyez prudent lorsque vous modifiez la solution d’essai afin d’éviter d’endommager les embryons.
    REMARQUE : Il est également possible d’étudier la mortalité ou les symptômes sublétaux pendant l’expérience. Les concentrations utilisées doivent rester aussi stables que possible pour obtenir des résultats fiables. Cela peut être facilement réalisé en rafraichissant les solutions de test. La fréquence de rafraîchissement peut varier en fonction de la substance d’essai. Par conséquent, il est conseillé de vérifier la concentration de la substance d’essai par des mesures analytiques pour déterminer la fréquence des mises à jour de la solution.

2. Préparation des larves pour la photographie

  1. Préparer 4% de méthylcellulose avec MS-222 (tricaine-méthane-sulfonate) à l’avance.
    1. Pour ce faire, ajouter 4 mg/mL MS-222 à 100 mL d’eau double distillée à une concentration finale de 0,168 mg/mL, et porter la solution à 4 °C. Ajouter ensuite 4 g de méthylcellulose. Remuer avec un agitateur magnétique, puis le laisser à 4 °C pendant la nuit.
    2. Le lendemain, remuez-le à nouveau et la solution doit être prête à l’emploi. Si la méthylcellulose n’est pas complètement dissoute, remettez-la à 4 °C et attendez quelques heures de plus.
  2. Placer les larves de 5 jours dans une boîte de Pétri de 5 cm par groupe de traitement avec une pipette Pasteur.
  3. Retirer la solution de traitement des larves à l’aide d’une pipette en plastique, puis remplir la boîte de Pétri de 2 mL de 0,02 % de solution anesthésique MS-222.
    REMARQUE : L’anesthésie est habituellement efficace en moins d’une minute. Les larves sont anesthésiées si elles ne nagent pas loin en réponse au toucher. Une surdose de MS-222 peut tuer les larves.
  4. Remplissez chaque carré d’une boîte de Pétri de 10 cm spécialement conçue avec 4 % de méthylcellulose avec MS-222 (figure 3).
    REMARQUE : Collez deux surfaces carrées de 1,5 x 1,5 cm au fond de la boîte de Pétri à l’aide de feuilles de plastique (hauteur de 1 mm, 5 mm de large). Vingt larves peuvent être placées l’une à côté de l’autre dans un carré. Au lieu d’une boîte de Pétri spécialement conçue, un autre récipient à bord bas peut être utilisé pour fixer la position des embryons.

figure-protocol-1
Figure 3 : Une boîte de Pétri de 10 cm avec 1,5 x 1,5 cm de large, carrés de tôles en plastique de 1 mm d’épaisseur pour la préparation des larves pour la photographie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Transférer les larves anesthésiées dans la méthylcellulose avec un peu d’eau dans l’un des deux carrés. Dès le premier carré, transférer les larves dans le deuxième carré.
    REMARQUE : À l’aide de ce transfert, la méthylcellulose de 4 % utilisée pour la photographie ne sera pas diluée et les larves ne tourneront pas pendant l’imagerie.
  2. Dans le deuxième carré, tournez et orientez les larves vers leur côté gauche et appuyez doucement vers le bas de la cellulose avec une pointe de pipette microchargeuse coupée jusqu’à 2 cm.
    REMARQUE : N’utilisez pas d’autres pointes de pipette parce qu’elles causent des blessures aux larves.

3. Microscopie

REMARQUE : La photographie ne tue pas les animaux. Les animaux peuvent être réveillés en les retirant de la méthylcellulose et en les plaçant dans de l’eau fraîche du système ou une solution de traitement, de sorte que la même personne peut être examinée plusieurs fois pendant le traitement.

  1. Afin d’évaluer le signal du journaliste exprimé, imagez les embryons avec la même vue et les mêmes paramètres.
    REMARQUE : Voir l’étape 2.6 pour un positionnement optimal de l’embryon. Les photos du manuscrit ont été prises dans les conditions décrites. Champ lumineux: 60x grossissement, 6 ms exposition, Iris 100%, Gain:1.1, photos de fluorescence: 60x grossissement, 300 ms exposition, Iris: 100%, Gain:1, filtre mCherry, source lumineuse fluorescente: ampoule à halogénure en métal mercure. Pour la prise de photos d’un stéréomicroscope fluorescent, appareil photo dédié, et un logiciel pour le microscope ont été utilisés.
  2. Placez la boîte de Pétri sur le stade du microscope.
  3. Concentrez-vous sur le foie de l’embryon et capturez une image de champ lumineuse à l’aide du logiciel associé.
  4. Passez le microscope au filtre mCherry et prenez une image fluorescente du foie sous la lumière fluorescente à l’aide du logiciel associé.
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de fluorescence dans l’obscurité. Ne modifiez pas le grossissement, la mise au point ou la position de l’embryon entre la capture du champ lumineux et les images fluorescentes, car cela aidera à l’analyse des images.
  5. Répétez les étapes 3.3 et 3.4 jusqu’à ce que tous les embryons de l’expérience aient été photographiés.

4. Détermination de la densité intégrée

REMARQUE : L’un des meilleurs indicateurs pour comparer la puissance du signal fluorescent est la valeur de densité intégrée (c.-à-d. le produit de la zone et la valeur grise moyenne). L’une des façons les plus faciles de déterminer la densité intégrée est d’utiliser le programme ImageJ27. Le programme est disponible sur Internet et peut être installé sur l’ordinateur.

  1. Ouvrez ImageJ puis téléchargez l’image fluorescente à analyser en faisant glisser et déposer l’image ou en cliquant sur Fichier| Ouvrir.
  2. Cliquez sur Image| Couleur| Divisez les canaux pour diviser l’image réalisée par le filtre fluorescent selon le graphique couleur RGB.
  3. Travaillez avec le spectre d’image de canal rouge, fermez les autres canaux.
  4. Désignez une zone elliptique de taille similaire dans l’image afin que les faux signaux n’interfèrent pas avec l’évaluation. À l’aide des outils ovales, dessinez une ellipse sur la zone du foie en surbrillance aussi précisément que possible.
  5. Si le signal est faible, utilisez des images de microscopie légère (c.-à-d. la paire de champ lumineux de l’image fluorescente) pour déterminer l’emplacement du foie.
  6. Cliquez sur Analyser| Mesurez la puissance du signal et la taille de la zone touchée. La valeur de densité intégrée est automatiquement calculée par le logiciel (colonne IntDen dans le graphique).
  7. Poursuivre l’analyse en répétant les étapes 4.1–4.6 jusqu’à ce que toutes les images fluorescentes de tous les embryons du groupe de traitement soient analysées.
  8. Enregistrez les données, puis analysez les valeurs de densité intégrées.
    REMARQUE : Sélectionnez toujours la même taille de zone dans les images pendant l’analyse. La taille de la zone à analyser dépend du grossissement, de la résolution d’image, d’autres paramètres de prise de vue, etc. L’analyse peut être accélérée ou rendue plus précise en utilisant des macros personnelles pour l’analyse. Par exemple, les macros peuvent être utilisées pour s’assurer que la zone sélectionnée est toujours la même dans les images examinées. Des descriptions détaillées pour la création de macros qui permettent la meilleure analyse d’image en fonction de paramètres photo particuliers sont trouvées sur le site Web d’ImageJ.

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Résultats

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Dans l’expérience présentée dans ce manuscrit, les effets de deux substances œstrogéniques ont été testés à cinq concentrations à partir de la fécondation pendant 5 jours sur des embryons de poisson zèbre Tg(vtg1:mCherry). Nous avons étudié si des signaux fluorescents sont apparus dans le foie des poissons à la fin du temps d’exposition en raison des substances et s’il y avait des différences dans l’œstogenicité des deux substances. Les résultats ont été évalués sur la base des images fluorescentes et des valeur...

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Discussion

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L’utilisation de biomonitors/bioindicateurs pour les effets œstrogéniques s’est répandue dans des études toxicologiques. Les modèles in vivo jouent un rôle remarquable, car contrairement aux tests in vitro, ils fournissent non seulement des informations sur la réponse d’une cellule ou d’un récepteur, mais permettent également l’étude de processus complexes dans l’organisme. Plusieurs lignes transgéniques pour l’étude des effets œstrogéniques ont été produites à partir de poissons zèbres, dont l’un Tg(vtg1:mCherry)

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été appuyés par le Bureau national de la recherche, du développement et de l’innovation (NKFIH) du Fonds national de recherche, de développement et d’innovation (NKFIA); Accord de subvention : NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 projet cofinancé par l’Union européenne, et le Programme d’excellence thématique NKFIH-831-10/2019 de Szent István University, décerné par le ministère de l’Innovation et de la Technologie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de culture tissulaire à 24 puitsJet BiofilTCP011024
Chlorure de calcium (CaCl2)Reanal Laborvegyszer Ltd.16383-0-27-39
Logiciel GraphPad Prism 6.01 LogicielGraphPad Software Inc.
Logiciel ImageJNational Institutes of Health, États-UnisLogiciel d’accès public, téléchargeable à partir de : http://imagej.nih.gov/
Leica Application Suite X logiciel calibréLeica Microsystems GmbH.Nous avons utilisé le logiciel décrit dans les expériences, mais tout logiciel photographique est conforme aux tests
: stéréomicroscope Leica M205 FA, appareil photo Leica DFC 7000T,Leica Microsystems GmbH.Nous avons utilisé les équipements décrits dans les expériences, mais tout stéréomicroscope à fluorescence convient pour les tests
Sulfate de magnésium (MgSO4)Reanal Laborvegyszer Ltd.20342-0-27-38
mFiltre ceriseLeica Microsystems GmbH.
Mehyl-celluloseSigma Aldrich Ltd.
Pointe de pipette MicroloaderEppendorf GmbH.
Pipette PasteurVWR International LLC.612-1684
Boîte de PétriJet BiofilTCD000060
chlorure de potassium (KCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.18050-0-01-33
Chlorure de sodium (NaCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.24640-0-01-38
Tricane-méthanesulfonate (MS-222)Sigma Aldrich Ltd.E10521
2744295242956003

Références

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