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Article de méthode

Une blessure de ballon segmental contrôlé par pression d’artère de rat carotide avec l’application thérapeutique periadventitial

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DOI :

10.3791/60473

⸱

9 juillet 2020

 , 
1Department of Surgery, Division of Vascular Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Center for Nanotechnology in Drug Delivery, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Curriculum in Toxicology & Environmental Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Cell Biology & Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 5McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

La blessure de ballon d’artère carotide de rat imite la procédure clinique d’angioplastie exécutée pour reconstituer le flux sanguin dans les vaisseaux athérosclérostiques. Ce modèle induit la réponse artérielle de dommages en distendant la paroi artérielle, et en dénudant la couche intimal des cellules endothéliales, causant finalement le remodelage et une réponse hyperplastique intimale.

Résumé

Les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde, en partie à cause de l’athérosclérose. La plaque athéroclérotique rétrécit la surface luminaire dans les artères réduisant ainsi le flux sanguin adéquat vers les organes et les tissus distals. Cliniquement, les procédures de revascularisation telles que l’angioplastie de ballon avec ou sans placement de stent visent à reconstituer le flux sanguin. Bien que ces procédures rétablissent le flux sanguin en réduisant le fardeau de la plaque, elles endommagent la paroi du vaisseau, ce qui déclenche la réponse artérielle de guérison. La réponse de guérison prolongée provoque une reposnose artérielle, ou re-rétrécissement, limitant finalement le succès à long terme de ces procédures de revascularisation. Par conséquent, les modèles animaux précliniques font partie intégrante de l’analyse des mécanismes pathophysiologiques qui conduisent la restenose, et offrent la possibilité de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les modèles Murine sont moins chers et plus faciles à utiliser que les grands modèles animaux. Les blessures par ballon ou par fil sont les deux modalités de blessures couramment acceptées utilisées dans les modèles murins. Les modèles de dommages de ballon en particulier imitent la procédure clinique d’angioplastie et causent des dommages proportionnés à l’artère pour le développement de la restenosis. Ci-après, nous décrivons les détails chirurgicaux pour effectuer et analyser histologiquement le modèle modifié et contrôlé par pression de dommages de ballon d’artère de rat. En outre, ce protocole met en évidence comment l’application périadventitiale locale des thérapeutiques peut être employée pour inhiber l’hyperplasie néointimale. Enfin, nous présentons la microscopie de fluorescence de feuille de lumière comme approche nouvelle pour l’imagerie et la visualisation des dommages artériaux dans trois dimensions.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent la principale cause de décès dans lemonde 1. L’athérosclérose est la cause sous-jacente de la plupart des morbidités et mortalités liées aux MCV. L’athérosclérose est l’accumulation de plaque à l’intérieur des artères qui se traduit par un lumen rétréci, ce qui entrave la perfusion sanguine appropriée aux organes et aux tissus distals2. Les interventions cliniques pour traiter l’athérosclérose grave incluent l’angioplastie de ballon avec ou sans placement de stent. Cette intervention consiste à faire avancer un cathéter de ballon jusqu’au site de la plaque et à gonfler le ballon pour comprimer la plaque jusqu’à la paroi artérielle, élargissant ainsi la zone luminaire. Cette procédure endommage l’artère, cependant, initiant la réponse artérielle de dommages3. L’activation prolongée de cette réponse de blessure mène à la restenosis artérielle, ou re-rétrécissement, secondaire à l’hyperplasie néointimale et au remodelage de navire. Pendant l’angioplastie, la couche intimale est dénudée des cellules endothéliales menant au recrutement immédiat de plaquettes et à l’inflammation locale. La signalisation locale induit des changements phénotypiques dans les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) et les fibroblastes adventitiels. Cela conduit à la migration et la prolifération de VSMC et fibroblastes vers l’intérieur vers le lumen, conduisant à l’hyperplasie néointimale4,5. Les cellules progénitrices circulants et les cellules immunitaires contribuent également au volume global de restenose6. Le cas échéant, les endosseurs d’échappement de médicaments (DES) sont la norme actuelle pour inhiber la restenose7. Des inhiber la ré-endothélialisation artérielle, cependant, créant ainsi un environnement pro-thrombotic qui peut avoir comme conséquence la thrombose tard dans-stent8. Par conséquent, les modèles animaux font partie intégrante à la fois pour comprendre la pathophysiologie de la restenose, et pour développer de meilleures stratégies thérapeutiques pour prolonger l’efficacité des procédures de revascularisation.

Plusieurs grands et petits modèlesanimaux 9 sont utilisés pour étudier cette pathologie. Il s’agit notammentde ballon-blessure 3,10 ou wire-blessure11 du côté luminal d’une artère, ainsi que la ligature partielle12 ou le placement de manchette13 autour de l’artère. Les dommages de ballon et de fil denudent la couche endothéliale de l’artère, imitant ce qui se produit médicalement après angioplastie. En particulier, les modèles de ballons-blessures utilisent des outils similaires à ceux du milieu clinique (c.-à-d. cathéter ballon). La blessure de ballon est mieux exécutée dans les modèles de rat, car les artères de rat sont une taille appropriée pour les cathéters disponibles dans le commerce de ballon. Nous décrivons ici une blessure artérielle segmentale contrôlée par pression, une version bien établie et modifiée de la blessure de ballon d’artère carotide de rat. Cette approche contrôlée par pression imite étroitement la procédure clinique d’angioplastie, et permet la formation néointimal reproductible d’hyperplasie deux semainesaprès blessure 14,15. En outre, cette blessure artérielle contrôlée par pression a comme résultat la restauration complète de couche endothéliale par 2 semaines après chirurgie16. Cela contraste directement avec le modèle original de blessure de ballon, décrit par Clowes, où la couche endothéliale ne revient jamais à la couverture complète3.

Après la chirurgie, des thérapeutiques peuvent être appliquées ou dirigées vers l’artère blessée par plusieurs approches. La méthode décrite ci-après utilise l’application périadventitiale d’une petite molécule intégrée dans une solution de gel pluronique. Plus précisément, nous appliquons une solution d’aldéhyde cimnamic de 100 μM dans le gel Pluronic-F127 de 25% à l’artère immédiatement après blessure pour inhiber la formation néointimale d’hyperplasie15. Pluronic-F127 est un gel thermoréversible non toxique capable de livrer des médicaments localement d’une manière contrôlée17. Pendant ce temps, les lésions artérielles sont locales, d’où l’administration locale permet de tester un principe actif tout en minimisant les effets hors cible. Néanmoins, la livraison efficace d’une thérapeutique utilisant cette méthode dépendra de la chimie de la petite molécule ou biologique utilisée.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. Procédures préopératoires

  1. Stériliser les instruments chirurgicaux. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Si vous effectuez plusieurs interventions chirurgicales le même jour, stérilisez les instruments entre les chirurgies à l’aide d’un stérilisateur de perles sèches.
  2. Préparer thérapeutique dans 25% pluronique-127 gel (dilué dans de l’eau distillée stérile).
  3. Installez un cathéter de ballon Fogarty 2F jusqu’à l’insufflateur et placez l’extrémité ballon du cathéter dans une seringue de 1 mL remplie de solution saline.
  4. Induire l’anesthésie en plaçant le rat dans une chambre avec 5% d’isoflurane.
    1. Retirez le rat de la chambre et enregistrez le poids du rat. Utilisez des tondeuses à cheveux pour raser la fourrure sur la région ventrale du cou.
    2. Remettre le rat dans la chambre avec 5% d’isoflurane pour assurer l’induction de l’anesthésie.
  5. Placez la supine de rat sur une plate-forme chirurgicale, insérant le visage dans le cône de nez de sorte que le visage de rat soit vers le chirurgien.
    1. Réduire l’anesthésie par inhalation à 1,5% d’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un réflexe de pincement des pieds sur les quatre pieds.
    2. Tapez les quatre jambes jusqu’à la plate-forme chirurgicale.
  6. Allumez la lampe thermique.
  7. Injecter de l’atropine (0,01 mg/kg) sous-cutanée pour réduire les sécrétions des voies respiratoires.
  8. Injecter du carprofène (5 mg/kg) sous-cutané pour la gestion de la douleur prophylactique. Si les anti-inflammatoires ne sont pas acceptables pour l’expérience se réfèrent aux étapes 3.2.2 et 3.2.3.
  9. Appliquer de l’onguent lubrifiant sur les deux yeux à l’aide d’un coton-tige stérile pour empêcher les cornées de sécher pendant la chirurgie.
  10. Écouvillonner le cou trois fois dans un mouvement circulaire alternant entre 70% d’alcool éthylique suivi de betadine du centre de la région rasée vers l’extérieur pour stériliser le site d’incision.
  11. Infiltrer la ligne d’incision .c. avec 0,25% de bupivacaine.
  12. Mettez des gants chirurgicaux stériles avant de manipuler des instruments chirurgicaux stériles et des fournitures.
  13. Déposer tous les instruments chirurgicaux autoclavés sur une feuille chirurgicale stérile.
  14. Couper trois brins indépendants de 1 pouce de suture stérile 7-0 Prolene.
  15. Déposer les cotons-tiges et la gaze sur une feuille chirurgicale.
  16. Draper le rat d’une feuille chirurgicale stérile qui n’expose que la région du cou stérilisée.
  17. Couper une petite ouverture supplémentaire en feuille qui expose une partie du cône avant. Ce sera le site pour enregistrer le cathéter ballon pendant les blessures.

2. Procédures opérationnelles

  1. Pendant toute la procédure chirurgicale, évaluer la profondeur de l’anesthésie en surveillant le taux respiratoire (le taux doit être constant et jugé normal) ainsi que par pincement des pieds toutes les 15 minutes. Si le taux respiratoire augmente ou s’il y a une réponse au pincement de l’orteil, alors interrompez la manipulation chirurgicale et augmentez l’isoflurane jusqu’à 2,5%.
  2. Exposer l’artère carotide commune (CCA).
    1. Faire une incision superficielle, droite et longitudinale encolure entre les os de la mâchoire du rat. Incision sera d’environ 1,5-2 cm de longueur.
    2. Faire une incision à travers le tissu conjonctif sous la peau jusqu’à ce que la couche musculaire soit exposée. Déplacez les glandes salivaires sous la peau pour accéder au tissu musculaire.
    3. Séparez brutalement le tissu conjonctif du muscle en insérant des ciseaux fermés entre la couche musculaire et le tissu conjonctif et en ouvrant doucement le ciseaux tout en tirant la peau vers le haut.
  3. Disséquer les deux muscles visibles (sternohyoid et sternomastoid) longitudinoïdement le long du côté gauche de la trachée jusqu’à ce qu’un troisième muscle (omohyoid) qui court perpendiculairement aux deux muscles superficiels soit observé.
  4. Utilisez des forceps pour créer une fenêtre séparant ce muscle perpendiculaire (omohyoid) du muscle longitudinal (sternohyoid) fonctionnant au sommet de la trachée. Effectuez doucement cette séparation pour éviter un traumatisme contondant à la trachée.
  5. Atteindre les forceps sous le muscle perpendiculaire et couper pour séparer les deux muscles longitudinals et exposer le CCA.
  6. Disséquer la CCA.
    1. Disséquer le CCA près de la bifurcation jusqu’à ce que l’artère carotide interne (ICA) et l’artère carotide externe (ECA) soient exposées.
    2. Disséquer l’artère thyroïdienne supérieure (STA), qui se ramifie de l’ECA.
    3. À l’aide des sutures prolènes pré-coupées, ligatez le STA et l’ECA près de leur bifurcation respective. Laisser la majorité de la suture d’un côté du nœud et saisir chaque suture avec un hémostat incurvé.
    4. Finissez de disséquer autour de l’ICA, atteignez les forceps en dessous et autour de l’ICA, et utilisez une pince vasculaire non concassante pour atteindre le contrôle distal. Serrez l’artère occipitale avec l’ICA.
    5. Disséquer le CCA proximal à la bifurcation, en veillant à séparer le nerf vague de la CCA.
    6. Atteindre les forceps en dessous et autour de la CCA et utiliser une pince vasculaire non concassante pour atteindre le contrôle proximal. Placer la pince à au moins 5 mm de la bifurcation.
  7. Effectuer des blessures ballon.
    1. Manœuvrez les hémostats incurvés tenant chaque branche ligatée d’artère pour exposer la bifurcation entre l’ECA et la branche supérieure.
    2. Disséquer délicatement le tissu à la bifurcation, puis faire une incision artériotomie entre l’ECA et la branche supérieure à l’aide de ciseaux de microdissection.
    3. Utilisez un coton-tige pour pousser tout le sang hors de la CCA et nettoyer le site d’artériotomie.
    4. Insérez le cathéter ballon non gonflé à travers l’artériotomie et avancez dans le CCA jusqu’à ce que l’extrémité proximale du ballon soit passée la bifurcation.
    5. Cathéter de bande au cône avant de sorte que le ballon ne glisse pas hors de l’artère pendant l’inflation.
    6. Gonflez lentement le ballon à 5 atmosphères de pression et laissez dans le CCA pendant 5 min pour induire des blessures artérielles. Assurez-vous que la pression reste constante pendant toute la durée de 5 minutes.
    7. Après 5 min, dégonfler le ballon et retirer délicatement du CCA par l’artériotomie.
    8. Rincer le CCA en pressant doucement sur la pince du CCA. N’enlevez pas la pince.
    9. Ligate l’ECA proximal à l’artériotomie, puis enlever les pinces de la CCA et ICA pour rétablir le flux sanguin à travers le CCA à l’ICA. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement visible autour de l’artériotomie et que le CCA vibre.
  8. Appliquez 100 μL de véhicule thérapeutique ou de gel pluronique seul periadventitially le long de la CCA blessée. Faites-le en appliquant 50 μL sur le côté gauche du CCA, puis 50 μL sur le côté droit du CCA pour assurer un revêtement même de l’artère blessée.
  9. Fermez le site de la plaie.
    1. Couper l’excès de sutures Prolene.
    2. Fermez la plaie à l’aide de couches vicryl interrompues de 4 à 0 ou 6-0 le long du tissu conjonctif.
    3. Terminer la fermeture de la plaie à l’aide d’une suture en nylon 4-0 le long de la peau.

3. Procédures postopératoires

  1. Placez le rat seul dans une cage propre avec la moitié de la cage sous une lampe chauffante et surveillez jusqu’à ce que le rat reprenne suffisamment conscience pour maintenir la récumbence sternale. Gardez le rat dans une cage séparée jusqu’à ce que l’animal soit complètement alerte et mobile avant de le transférer dans sa cage d’origine.
  2. Surveillez le rat tous les jours pendant les trois prochains jours, puis trois fois par semaine jusqu’à l’euthanasie. Euthanasier à l’aide d’une surdose d’isoflurane suivie d’une thoracotomie bilatérale décrite ci-dessous.
    1. Utilisez l’échelle de grimace du Centre national pour le perfectionnement et la réduction des animaux dans la recherche (NC3Rs) pour identifier les niveaux de douleur postopératoire. Si un animal semble éprouver de la douleur ou développer un compromis neurologique, sacrifiez immédiatement.
    2. Pour les animaux qui ne reçoivent pas de carprofène, administrer de l’acétaminophène 6 mg/mL dans leur eau potable 24 h avant la chirurgie par 48 h après la chirurgie. L’acétaminophène fournit une analgésie avec un minimum d’effets anti-inflammatoires.
    3. Alternativement, d’autres stratégies d’analgésie avec des effets anti-inflammatoires minimaux peuvent être employées, telles que la buprénorphine ou la libération prolongée de buprénorphine. Consultez l’équipe vétérinaire de votre établissement.

4. Récolte et imagerie des tissus

  1. Deux semaines après la chirurgie, euthanasier le rat par surdose d’anesthésie (5% d’isoflurane). Alternativement, euthanasier les rats à un moment plus précoce pour analyser les différents aspects de la réponse des blessures artérielles.
    1. Une fois que la respiration s’arrête effectuer thoracotomy bilatérale comme une méthode secondaire de l’euthanasie.
  2. Faire une incision latérale à travers l’abdomen, puis couper vers le haut, à travers le diaphragme et les côtes, exposant la cavité thoracique.
  3. Perfuser et réparer les artères.
    1. Insérez une canule de 18 G attachée à un système gravitationnel de perfusion-fixation par le ventricule gauche. Maintenir une pression équivalente entre les rats en marquant la hauteur du système de perfusion par rapport au dessus du banc (élévation de 120 cm, équivalent à 91 ± 3 mmHg).
    2. Serrez la canule avec le ventricule à l’aide d’un hémostat incurvé.
    3. Faire une coupe dans l’atrium droit, l’ouverture du circuit vasculaire, et commencer la perfusion avec PBS suivie de 2-4% paraformaldéhyde (environ 250 mL chacun).
    4. Préparez du paraformaldéhyde dilué dans PBS le jour du sacrifice, ou tout au plus la veille du sacrifice. Si vous vous préparez le jour du sacrifice, assurez-vous que le paraformaldéhyde a refroidi à température ambiante avant de commencer la perfusion. Conserver le paraformaldéhyde à 4 °C.
  4. Après fixation, extraire les artères carotides gauche et droite et les conserver à 4 °C pendant 2 h en paraformaldéhyde de 2 à 4 %.
  5. Transférer les artères à 30% de saccharose et les conserver toute la nuit à 4 °C.
  6. Après 16-24 h, intégrer les artères dans le composé de température de coupe optimale (OCT) et congeler les blocs d’artère oct-incorporés.
    1. Conditionner les artères en OCT à température ambiante pendant 10 min. Placez l’artère parallèle au plan du cryomold rempli d’OCT, marquant le côté du cryomold auquel la bifurcation artérielle est confrontée. Snap-freeze dans l’azote liquide.
    2. Conserver les blocs congelés à long terme à -80 °C.
  7. Sectionz les blocs congelés à l’aide d’un cryostat.
    1. Recueillir six sections transversales artérielles de 5 μm d’épaisseur par diapositive, la diapositive 1 commençant à la bifurcation.
    2. Section blocs gelés jusqu’à ce que l’hyperplasie ne soit plus visible (environ 100 diapositives).
  8. Hematoxylin & eosin (H&E) diapositives de tache18
    1. Trouvez la zone de blessure en soudant une diapositive sur dix le long de toute l’artère à partir de la bifurcation (p. ex., diapositives 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 et 100).
    2. Tacher d’autres toboggans autour du site de la blessure pour trouver la glissade avec occlusion maximale (p. ex., diapositives 20, 30 et 40 avaient une hyperplasie visible, donc des glissades de taches 15, 25, 35 et 45).
    3. Tacher et quantifier la diapositive à l’aide d’occlusion maximale et de diapositives équidistantes avant et après la glissade d’occlusion maximale (p. ex., occlusion maximale trouvée à la diapositive 35, puis tacher et quantifier les diapositives 25, 45, etc.) pour un total de 3 à 10 diapositives par rat.
  9. Pour l’imagerie par microscopie par fluorescence des feuilles lumineuses, conserver les artères pendant la nuit à 4 °C après fixation à l’étape 4.4.
    1. Sondez l’artère avec 1:500 dilution de l’anticorps primaire anti-CD31 de lapin dans le diluant (pH 7.4) pendant 3 jours. Puis contre-tache artère avec 1:500 dilution de l’anti-lapin Alexa Fluor 647 anticorps secondaire pendant 2 jours19.
    2. Dégagez l’artère à l’aide d’iDISCO+20.
    3. Image de l’artère à l’aide d’un microscope à fluorescence feuillede lumière 21. Rendre les images à l’aide d’un logiciel (p. ex., Imaris)19.
  10. Quantifier l’hyperplasie néointimale. Effectuez la quantification d’une manière aveuglée si possible.
    1. Utilisez le logiciel ImageJ pour tracer le périmètre de l’intima, du lamina élastique interne (IEL) et du lamina élastique externe (EEL) d’une artère sur chacune des 3 à 10 diapositives déterminées ci-dessus (étape 4.8.3).
    2. Quantifier la superficie de chaque région tracée dans ImageJ et exporter ces valeurs. La trace d’intima donne la zone de lumen, la trace IEL cède la zone IEL, et la trace EEL donne la zone EEL.
    3. Moyenne des valeurs obtenues à partir des diapositives 3-10 pour obtenir la blessure moyenne (% occlusion, intima:media (I:M) ratio, hyperplasie néointimale) par artère carotide de rat.
      Hyperplasie néointimale = zone IEL - Région de Lumen
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2

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Résultats

La figure 1 montre tous les matériaux et les outils chirurgicaux utilisés pour effectuer cette chirurgie. L’hématoxyline et l’éosine (H&E) soudant des sections artérielles transversales blessées de deux semaines permettent une visualisation claire de l’hyperplasie néointimale. La figure 2 montre des images représentatives de sections artérielles tachées de H&E d’une artère saine, blessée et traitée. La figure 2 décrit égalem...

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Discussion

La blessure de ballon d’artère carotide de rat est l’un des modèles animaux de restnosis les plus largement utilisés et étudiés. Le modèle original de blessure deballon 3 et la variation segmentaire modifiée de dommages segmentaires sous pression10 ont informé beaucoup d’aspects de la réponse artérielle de dommages qui se produit également chez l’homme, avec les quelques limitations étant que le thrombus fibrin-riche se développe rarement et l’inflammation locale est minima...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts concernant la publication de ce manuscrit.

Remerciements

N.E.B. a reçu une subvention de formation du National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018) et une bourse prédoctorale de l’American Heart Association (20PRE35120321). E.S.M.B. était un boursier KL2 partiellement soutenu par le Programme des boursiers du Prix des sciences cliniques et translationnelles de l’UNC-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) et le National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Les auteurs remercient le Dr Pablo Ariel, du Laboratoire des services de microscopie de l’UNC, d’avoir aidé à la LSFM. La microscopie de fluorescence de feuille de lumière a été exécutée au laboratoire de services de microscopie. Le Laboratoire des services de microscopie, Département de pathologie et de médecine de laboratoire, est soutenu en partie par P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant au Centre complet de cancérologie Lineberger de l’UNC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
SeringueFisher14955450
1 mL Seringue avec aiguilleBD309626
2 Cathéter d’embolectomie par ballonnet French FogartyEdwards LifeSciences120602F
4-0 Suture Ethilon (Nylon)Ethicon Inc662H
4-0 Suture VicrylEthicon IncJ214H
7-0 Suture ProleneEthicon Inc8800H
70 % alcool éthylique
Anti-Rabbit Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA21245
Sulfate d’atropineVedco Incà usage vétérinaire
Cotons-tigesPuritan806-WC
Hémostats incurvésOutils scientifiques fins13009-12
Pince fine incurvéeOutils de science fine11203-25
Ciseaux finsOutils de science fine14090-11
GazeCovidien2252
Diluant IHC-Tek (pH 7,4)IHC WorldIW-1000
InsufflateurMerit MedicalIN4130
Solution
d’iodePommade oculaire lubrifianteDechraà usage vétérinaire
Mayo CiseauxOutils pour les sciences fines14010-15
Micro SerrefinesOutils pour les sciences18055-05
Ciseaux de microdissectionOutils pour les sciences fines15004-08
Micro-Serrefine Clamp Pince d’applicationOutils pour les sciences fines18057-14
Porte-aiguilleOutils de science fine12003-15
Pluronic-127 (dilué dans de l’eau stérile)Sigma-AldrichP244325 % préparé
Lapin Anti-CD31Abcamab28364
Écarteurtrombones pliés fonctionnent bien
Rimadyl (Carprofène)Zoetis Incà usage vétérinaire
Solutionsaline
Pince StandardOutils Scientifiques Fins11006-12
Champ StérileDynarex4410
T-Pins
Les

Références

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