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Article de méthode

PRÉPARATION DE PLASMA RICHE EN PLAQUETTES ACTIVÉES POUR LA CULTURE DE CELLULES SOUCHES DÉRIVÉES DU TISSU ADIPEUX HUMAIN

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DOI :

10.3791/60480

⸱

4 mai 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Kansai Medical University, 2Department of Plastic Surgery, Zhejiang Provincial People's Hospital

Dans cet article

Résumé

Dans ce rapport, nous décrivons une méthode à double spin pour préparer du plasma riche en plaquettes activées (PRP). À l’aide de thrombine autologues, des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASCs) ont été cultivées. Il a été démontré que le PRP activé favorise la prolifération des hASC.

Résumé

Le plasma riche en plaquettes activées (PRP) préparé à partir de sang total par centrifugation a démontré un effet stimulant de la prolifération dans plusieurs types de cellules cultivées, ce qui implique une utilisation possible en médecine régénérative. Ici, une méthode à double spin a été utilisée pour préparer le PRP à partir de sang total. Le PRP a ensuite été activé par la thrombine autologue. La numération plaquettaire a été mesurée dans le PRP activé et l’effet stimulant de la prolifération dans les cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASCs) a été examiné. La numération plaquettaire résultante était 11,5 fois plus élevée dans le PRP que dans le plasma sanguin total. La prolifération des hASCs a été nettement renforcée par l’incubation avec 1 % de PRP. La méthode décrite peut être utilisée pour préparer de manière reproductible le PRP avec une forte concentration de plaquettes. Le PRP préparé par cette méthode favorise nettement la prolifération des hASC.

Introduction

Le plasma riche en plaquettes activées (PRP) est préparé par centrifugation du sang total et il s’avère qu’il contient des plaquettes bien au-dessus des niveaux de base1. Le RPP autologue a été largement utilisé dans le traitement chirurgical, y compris la cicatrisation des plaies2, les lésions osseuses3 et les chirurgies esthétiques 4,5. Après l’activation des plaquettes dans le PRP, les α-granules présents dans les plaquettes libèrent plusieurs facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), les facteurs de croissance analogue à l’insuline (IGF), le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), et d’autres 1,6,7. Ces facteurs de croissance jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire8, la migration9 et la différenciation9.

À ce jour, plusieurs études ont rapporté l’effet stimulant de la prolifération du PRP dans différents types de cellules 10,11,12,13,14,15,16. L’un de ces types de cellules est les cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASC) ; Les hASCs existent dans le tissu adipeux humain et peuvent être facilement collectés en grand nombre. L’effet régénératif des hASCs suggère en outre une utilisation potentielle dans des applications cliniques8. Nos études précédentes ont rapporté que, par rapport au PRP non activé, le PRP activé avait un effet prolifératif marqué sur les hASC et les fibroblastes dermiques humains (hDF)8. De plus, nous avons rapporté que le PRP favorise la prolifération des hDFs par le biais d’une voie de signalisation ERK1/217. Récemment, nous avons également rapporté que le PRP favorise la prolifération des hASCs par les voies de signalisation ERK1/2, JNK et Akt18. Dans les hASC, le PRP joue un rôle important en tant que complément qui favorise la prolifération. La connaissance de l’effet du PRP sur les hASCs aidera au développement de méthodes de culture à grande échelle et permettra de poursuivre les études sur le mécanisme de prolifération dans les hASC.

Dans ce rapport, nous présentons et décrivons une méthode de préparation du PRP à partir de sang total par centrifugation. Cette méthode utilise la méthode du double spin pour préparer facilement un échantillon stable de PRP. Pour évaluer la fonction biologique du PRP, nous avons mesuré la numération plaquettaire concentrée et la concentration de plusieurs facteurs de prolifération. Nous avons également confirmé l’effet stimulant de la croissance en utilisant le PRP préparé pour la culture des hASC.

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Protocole

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université médicale du Kansai conformément aux directives éthiques de la Déclaration d’Helsinki de 1975. Tous les échantillons ont été prélevés et utilisés avec le consentement éclairé des donneurs.

1. Préparation

  1. Après avoir obtenu le consentement éclairé, prélever du sang sur des donneurs adultes en bonne santé. Ici, le sang a été prélevé sur quatre donneurs de sang masculins âgés de 28 à 38 ans.
    1. Il est recommandé aux donneurs de boire 500 ml d’eau 6 h avant le prélèvement sanguin.
      REMARQUE : Les plages de référence pour l’hémoglobine (Hb), le nombre de globules rouges (GR) et la concentration de plaquettes (PL) chez les adultes en bonne santé sont décrites par Vajpayee19. Afin d’être apte au don de sang, l’analyse de sang du donneur doit se situer dans ces plages.

2. Prélèvement sanguin

  1. Demandez aux donneurs de sang de s’asseoir pendant la procédure.
  2. Portez des gants. Fixez un garrot sur le bras du donneur pendant que le donneur fait un poing.
  3. Une fois qu’une veine appropriée est trouvée, stérilisez la peau deux fois avec de l’alcool à 70 % et insérez l’aiguille.
  4. Utilisez une seringue de 21 g pour prélever du sang. Ne desserrez pas le garrot pendant la prise de sang.
    1. Utilisez un tube de prélèvement sanguin de 8,5 ml pour prélever le sang. Observez l’état du sang dans le tube et changez de tube dès que le flux sanguin ralentit.
    2. Prélever une quantité suffisante de sang pour faire le PRP. Prélever quatre tubes de sang anticoagulé d’un volume total de 34 ml. Retournez les tubes 10 fois pour mélanger le sang avec l’anticoagulant.
    3. Utilisez un tube de prélèvement de sang sérique de 10 ml (voir le tableau des matières) sans anticoagulant pour prélever le sang afin de fabriquer l’activateur (voir l’étape 4). Prélever 10 mL de sang non anticoagulant.

3. Méthode à double spin pour faire du PRP

  1. Prélever 40 μL de sang total anticoagulant pour la numération plaquettaire. Utilisez des pointes de pipette filtrées pour protéger la pipette de la contamination par le sang.
  2. Centrifugez le sang total anticoagulé pendant 7 min à 450 x g et à température ambiante. Il s’agit de la première rotation permettant d’obtenir des échantillons de sang en couches. La couche supérieure est la fraction plasmatique, la couche intermédiaire est le mince bateau chamois et la couche inférieure est constituée de globules rouges.
  3. À l’aide d’un marqueur, tracez une ligne à 2 mm sous la couche leucocytaire.
  4. À l’aide d’une seringue de 20 mL munie d’une longue canule, recueillir le plasma jusqu’à la marque de 2 mm sous la couche leucocytaire. Le plasma jaune à enveloppe leucocytaire contient des plaquettes, des leucocytes et certains érythrocytes. Prélevez le plasma de deux tubes dans un tube de prélèvement de sang sérique. Combinez le contenu de 4 tubes en 2 tubes pour un volume total de 16 mL de plasma recueilli.
  5. Centrifugez le plasma avec la couche leucalaire pendant 5 min à 1 600 x g et à température ambiante. C’est le deuxième tour. Le surnageant des échantillons de sang stratifiés est le plasma pauvre en plaquettes (PPP).
  6. À l’aide d’une seringue de 20 mL munie d’une longue canule, transvaser le PPP dans un tube de prélèvement de sang sérique de 50 mL contenant 1 mL de liquide à titre de mesure. Les plaquettes qui se sont accumulées dans la pastille de thrombocytes dans le plasma restant de 1 mL ont été utilisées comme PRP. Le volume total de PRP recueilli était de 2 mL.
  7. Vortex le PRP dans chaque tube, puis accumulez-le dans un tube (total 2 ml).
  8. Prélever 400 μL de PRP pour une numération plaquettaire.
  9. Aliquote le PRP dans plusieurs tubes de 1,5 mL, contenant environ 400 μL dans chaque tube. Il y a un total de quatre tubes. Environ 500 μL de PRP par tube sont recommandés.

4. Préparez l’activateur

  1. Laisser reposer les 10 ml de sang sans anticoagulant dans un tube de prélèvement de sang sérique (étape 2.3.3) pendant 30 minutes à température ambiante.
  2. Centrifuger l’échantillon de sang sans anticoagulant pendant 8 min à 2 015 x g et à température ambiante dans une centrifugeuse de laboratoire.
  3. Prélever le surnageant sous forme de thrombine autologue.
  4. Mélangez 0,5 M de CaCl2 et de la thrombine autologue dans un rapport de 1:1 (v/v) comme activateur. Par exemple, 500 μL de CaCl2 ont été mélangés avec 500 μL de thrombine autologue. Préparez un volume total de 1 mL d’activateur.

5. Activation du PRP

  1. Mélangez le PRP et l’activateur dans un rapport de 10:1 (v/v). Mélangez 400 μL de PRP avec 40 μL d’activateur dans chaque tube de 1,5 mL, puis incubez pendant 10 min à température ambiante. Il s’agit du PRP activé sous forme coagulée.

6. Stockage du PRP

  1. PRP activé par centrifugation à 9 000 x g pendant 10 min dans une centrifugeuse de laboratoire à 4 °C.
  2. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette dans une seringue de volume approprié.
  3. Filtrer le surnageant à travers une membrane de 0,22 μm.
  4. Conservez le PRP final à -80 °C jusqu’à utilisation.

7. Mesure des concentrations plaquettaires et des taux de facteurs de croissance

  1. Comptez le nombre de plaquettes dans le plasma entier et le PRP à l’aide d’un système d’hématologie automatisé (voir la table des matériaux).
  2. Analysez les concentrations de PDGF-BB, IGF et EGF dans le plasma entier et le PRP activé à l’aide de kits ELISA disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux).

8. Essai de prolifération cellulaire

  1. Isoler les CSh à l’aide de la méthode décrite précédemment18.
    1. Semez les hASC à une densité de 1,0 x 104 cellules/puits dans des plaques de culture à 24 puits et incubez dans du DMEM contenant 10 % de FBS et des antibiotiques pendant la nuit à 37 °C. Utilisez les hASCs des passages 7 à 9 dans les expériences.
  2. Remplacez le milieu cellulaire par du DMEM sans sérum. Après 6 h, ajouter du PRP aux concentrations désignées et incuber davantage pendant 48 h à 37 °C.
  3. Incuber avec la solution WST-8 (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h à 37 °C. Absorbance de lecture à 450 nm avec un lecteur de plaques multipuits.
  4. Construisez une courbe standard : Amorcez des hASC à des densités de 0, 6 250, 12 500, 25 000, 50 000 et 100 000 cellules/puits dans des plaques à 24 puits dans DMEM avec 10 % de FBS pendant 3 h. Lire l’absorbance à 450 nm après l’incubation avec la solution WST-8 pendant 1 h à 37 °C
    1. Tracez la courbe standard en traçant le nombre de cellules en fonction de A450 nm.
  5. Estimez le nombre de hASC à partir de l’absorbance sur la base de la courbe standard.

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Résultats

Concentrations enrichies de plaquettes et de PDGF-BB dans le PRP
Les concentrations de plaquettes et de PDGF-BB dans le PRP ont été multipliées par 11,5 et 25,9, respectivement, aussi élevées que celles du plasma entier. Cependant, les concentrations d’EGF dans le PRP n’ont pas changé et l’IGF n’était que de 70 % de celle du plasma entier (tableau 1). Les expériences ont été reproduites quatre fois par la méthode du double spin.

Prolifération accrue...

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Discussion

Après l’activation du PRP, plusieurs facteurs de croissance, tels que PDGF, EGF, IGF, TGF-β et VEGF 1,6,7 « activent » les cellules et les tissus des plaies favorisant la cicatrisation des plaies20,21. Dans le cas de la chirurgie de reconstruction esthétique, il a été démontré que les cellules activées induisent la guérison et améliorent...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Sans objet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 20 ml, serrure de seringue Terumo de typeTerumo, Tokyo, Japon.Tube SS-20LZP
de 50 ml, tube conique en polypropylèneCorning, NY, États-Unis.352070
Système d’hématologie automatiséSysmex Corp., Tokyo, JaponXE-2100
, set SafeTouch PSV avec adaptateur Luer, 21 G x 3/4"Nipro, Osaka, Japon.32-384
Tube de prélèvement sanguin, ACD Solution A Tube de prélèvement sanguin, 8,5 mLBD Vacutainer, NJ, États-Unis.
Tube de prélèvement sanguin 364606, Tube de prélèvement de sang sérique/monovette, 10 mLBD Vacutainer, NJ, États-Unis.366430
Chlorure de calcium, 1 mEq/ mL,Usine pharmaceutique Otsuka, Tokushima, Japon.3215400A1061
Canule, aiguille sans biseau, 18 G (1,2 mm) x 75 mmBS Medical, Tokyo, Japon.BS-81007Pas à vendre
Kit de comptage cellulaire-8Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, JaponCK04
CentrifugeuseKokusan, Tokyo, Japon.H-19F
Eppendorf, Hambourg, Allemagne.5415R
EnSpire 2300 Lecteur multi-étiquettesPerkinElmer, Inc., Waltham, MA, États-Unis
Unité de filtrageMerck Millipore, Co. Cork, Irlande.
Humain EGF Quantikine ELISA KitR& D Systems, Minneapolis, MN, États-UnisDEG00
Humain IGF-I Quantikine ELISA KitR& D Systems, Minneapolis, MN, États-UnisDG100
Humain PDGF-BB Quantikine ELISA KitR& D Systems, Minneapolis, MN, États-UnisDBB00
, ART 1000 Reach Barrier TipThermo Scientific, MA, États-Unis.2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 &mu ; LNichiryo, Saitama, Japon.00-NPX2-1000
Gants d’examen en nitrile sterling Power-FreeKimberly-Clark50707
Yamazen Alcool pour la désinfectionYamazen Pharmaceutical, Osaka, Japon.A7L07
Aiguille de prélèvement sanguin Centrifugeuse SLGP033RS Pointe de pipette

Références

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