Identification des voies d'accueil ciblées par les protéines d'effetbactérieur à l'aide d'écrans de toxicité et de suppression de levures

Summary

Les agents pathogènes bactériens sécrètent des protéines dans l'hôte qui ciblent des processus biologiques cruciaux. L'identification des voies d'accueil ciblées par les protéines effecteurs bactériens est essentielle pour lutter contre la pathogénie moléculaire. Ici, une méthode utilisant un suppresseur modifié de levure et un écran de toxicité pour élucider des voies d'hôte visées par les protéines bactériennes toxiques d'effecteur est décrite.

Abstract

Les bactéries intracellulaires sécrètent des facteurs de virulence appelés protéines effectrices dans le cytosol hôte qui agissent pour subvertir les protéines hôtes et/ou leurs voies biologiques associées au profit de la bactérie. L'identification des protéines effectrices bactériennes présumées est devenue plus gérable en raison des progrès dans le séquençage du génome bactérien et de l'avènement d'algorithmes qui permettent dans l'identification silico des gènes codant les candidats à la sécrétion et/ou de l'eucaryote Domaines. Cependant, l'identification de ces facteurs importants de virulence n'est qu'une première étape. Naturellement, l'objectif est de déterminer la fonction moléculaire des protéines effectrices et d'élucider la façon dont elles interagissent avec l'hôte. Ces dernières années, des techniques comme l'écran bi-hybride de levure et les immunoprécipitations à grande échelle couplées à la spectrométrie de masse ont aidé à identifier les interactions protéine-protéine. Bien que l'identification d'un partenaire liant hôte soit la première étape cruciale vers l'élucidation de la fonction moléculaire d'une protéine effectrice bactérienne, parfois la protéine hôte présente de multiples fonctions biologiques (p. ex. actine, clathrine, tubuline) ou la protéine bactérienne peut ne pas lier physiquement les protéines de l'hôte, privant le chercheur d'informations cruciales sur la voie précise de l'hôte manipulée. Un écran modifié de toxicité de levure couplé avec un écran de suppresseur a été adapté pour identifier des voies d'hôte impactées par les protéines d'effecteur bactérien. L'écran de toxicité repose sur un effet toxique dans la levure causé par la protéine effecteur interférer avec les voies biologiques de l'hôte, qui se manifeste souvent comme un défaut de croissance. L'expression d'une bibliothèque génomique de levure est employée pour identifier des facteurs d'hôte qui suppriment la toxicité de la protéine d'effecteur bactérien et identifient ainsi des protéines dans la voie que la protéine effectrice cible. Ce protocole contient des instructions détaillées pour les écrans de toxicité et de suppresseur. Ces techniques peuvent être réalisées dans n'importe quel laboratoire capable de clonage moléculaire et la culture de levure et Escherichia coli.

Introduction

Le premier rapport de procédures similaires à ceux présentés ici caractérisait l'effecteur de type IV de Legionella pneumophila SidD, un deAMPylase qui modifie Rab1¹. Des techniques comparables ont été utilisées pour la caractérisation de plusieurs effecteurs de L. pneumophila ^1,2,3. L'assay a été adapté pour caractériser une Coxiella burnetii type IV effector protéine⁴, et récemment l'utilité de cette technique a été élargie pour la caractérisation des protéines de membrane d'inclusion chlamydia t....

Protocol

1. Préparation des médias et des réactifs

REMARQUE: Les assiettes doivent être préparées avant le jour de l'assidu et sont bonnes pour 1 mois. Les médias et les réactifs peuvent être faits à tout moment et sont bons pour 1 mois.

1. Préparer 1 L de la solution de glucose (10 % w/v) en dissolvant 100 g de D-()-glucose dans 800 ml d'eau distillée dans un bécher de 1 000 ml. Ajuster le volume à 1 L avec de l'eau distillée. Filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 m dans une bouteille stérile de stockage multimédia de 1 L.
2. Préparer 1 L de la solution galactose (10% w/v) en dissolvant 100 g de D-(MD)- galactose dans 800 ml d'ea....

Results

Avant que l'écran de suppression de levure réel puisse être exécuté, la protéine d'effeteur d'intérêt doit être examinée pour la toxicité dans la levure. Ceci est accompli en exprimant la protéine d'intérêt pour la levure sous le contrôle d'un promoteur galactose-inductible. La croissance du glucose (conditions non induisantes) doit d'abord être comparée pour s'assurer que la toxicité est spécifiquement due à l'expression de la protéine d'intérêt et n'est pas un défaut général. Comme le montre la fig.......

Discussion

Ce protocole décrit les procédures étape par étape pour identifier les voies biologiques hôtes ciblées par les protéines effectrices bactériennes à l'aide d'une toxicité de levure modifiée et d'un écran suppresseur. La souche de levure utilisée, S. cerevisiae W303, est auxotrophique à la fois pour l'uracil et la leucine. Uracil auotrophy de la souche est utilisé pour sélectionner la levure portant la protéine d'intérêt sur le vecteur pYesNTA-Kan tandis que la leucine auotrophy est utilisé pour sélectionner pour .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet Kit d’extraction de gel	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet Kit de purification PCR	ThermoFisher	Scientific K0701
GeneJet Kit miniprep de plasmide	Thermo	K0503
Glucose	MilliporeSigma	G8270-1KG
Herring Sperme ADN	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Acétate de lithium dihydraté	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion Haute-fidélité ADN polymérase	New England Biolabs	M0530
Poly(éthylène glycol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 ADN ligase	New England Biolabs	M0202S
Tryptophane	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Extrait de levure	Fisher Scientific	BP1422-500
Levure miniprep kit	Zymo	D2001
Base azotée de levure sans acides aminés	MilliporeSigma	Y0626-250G
Levure synthétique Drop-out Medium Suppléments	MilliporeSigma	Y1501-20G	sans uracile
Levure synthétique Drop-out Medium Suppléments	MilliporeSigma	Y1771-20G	sans uracile, leucine, tryptophane