Method Article

Identification des voies d'accueil ciblées par les protéines d'effetbactérieur à l'aide d'écrans de toxicité et de suppression de levures

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les agents pathogènes bactériens sécrètent des protéines dans l'hôte qui ciblent des processus biologiques cruciaux. L'identification des voies d'accueil ciblées par les protéines effecteurs bactériens est essentielle pour lutter contre la pathogénie moléculaire. Ici, une méthode utilisant un suppresseur modifié de levure et un écran de toxicité pour élucider des voies d'hôte visées par les protéines bactériennes toxiques d'effecteur est décrite.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les bactéries intracellulaires sécrètent des facteurs de virulence appelés protéines effectrices dans le cytosol hôte qui agissent pour subvertir les protéines hôtes et/ou leurs voies biologiques associées au profit de la bactérie. L'identification des protéines effectrices bactériennes présumées est devenue plus gérable en raison des progrès dans le séquençage du génome bactérien et de l'avènement d'algorithmes qui permettent dans l'identification silico des gènes codant les candidats à la sécrétion et/ou de l'eucaryote Domaines. Cependant, l'identification de ces facteurs importants de virulence n'est qu'une première étape. Naturellement, l'objectif est de déterminer la fonction moléculaire des protéines effectrices et d'élucider la façon dont elles interagissent avec l'hôte. Ces dernières années, des techniques comme l'écran bi-hybride de levure et les immunoprécipitations à grande échelle couplées à la spectrométrie de masse ont aidé à identifier les interactions protéine-protéine. Bien que l'identification d'un partenaire liant hôte soit la première étape cruciale vers l'élucidation de la fonction moléculaire d'une protéine effectrice bactérienne, parfois la protéine hôte présente de multiples fonctions biologiques (p. ex. actine, clathrine, tubuline) ou la protéine bactérienne peut ne pas lier physiquement les protéines de l'hôte, privant le chercheur d'informations cruciales sur la voie précise de l'hôte manipulée. Un écran modifié de toxicité de levure couplé avec un écran de suppresseur a été adapté pour identifier des voies d'hôte impactées par les protéines d'effecteur bactérien. L'écran de toxicité repose sur un effet toxique dans la levure causé par la protéine effecteur interférer avec les voies biologiques de l'hôte, qui se manifeste souvent comme un défaut de croissance. L'expression d'une bibliothèque génomique de levure est employée pour identifier des facteurs d'hôte qui suppriment la toxicité de la protéine d'effecteur bactérien et identifient ainsi des protéines dans la voie que la protéine effectrice cible. Ce protocole contient des instructions détaillées pour les écrans de toxicité et de suppresseur. Ces techniques peuvent être réalisées dans n'importe quel laboratoire capable de clonage moléculaire et la culture de levure et Escherichia coli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le premier rapport de procédures similaires à ceux présentés ici caractérisait l'effecteur de type IV de Legionella pneumophila SidD, un deAMPylase qui modifie Rab11. Des techniques comparables ont été utilisées pour la caractérisation de plusieurs effecteurs de L. pneumophila 1,2,3. L'assay a été adapté pour caractériser une Coxiella burnetii type IV effector protéine4, et récemment l'utilité de cette technique a été élargie pour la caractérisation des protéines de membrane d'inclusion chlamydia trachomatis 5 .

Ce protocole peut être divisé en deux parties principales : 1) l'écran de toxicité de levure, dans lequel la protéine d'effetur bactérien d'intérêt est exprimée dans la levure et les clones sont examinés pour un phénotype toxique comme démontré par un défaut de croissance, et 2) l'écran de suppression de levure , dans lequel le phénotype toxique est supprimé par l'expression d'une bibliothèque génomique de levure dans la souche toxique. Ainsi, l'écran de toxicité est un écran pour les phénotypes toxiques qui se manifestent comme des défauts de croissance lorsque l'effecteur bactérien d'intérêt est surexprimé. Les clones toxiques, transformés avec succès avec et exprimant l'effecteur bactérien, sont sélectionnés et sauvegardés pour l'étape suivante. La deuxième étape majeure consiste à surexprimer une bibliothèque génomique de levure partiellement digérée dans le clone de levure toxique. Les plasmides constituant la bibliothèque génomique de levure suggérée pour l'utilisation dans ce protocole portent des inserts de 5 à 20 kb, correspondant habituellement à des cadres de lecture ouverts à 3 à 13 levures (ORF) d'une taille moyenne de gène de 1,5 kb sur tous les plasmides, représentant l'ensemble du génome couvert de levures environ 10x. Cette partie de l'assay est appelée l'écran suppresseur, comme le but est de supprimer la toxicité de la protéine effectrice bactérienne. Les plasmides suppresseurs potentiels sont isolés de la levure, séquencés, et les ORF sépilleurs identifiés. La raison d'être de l'écran suppresseur est que la protéine effectrice lie, interagit avec, et / ou submerge les composants de la voie hôte qu'il cible, et que fournir ces protéines hôtes en excès peut sauver l'effet toxique sur la voie et donc, le défaut de croissance. Ainsi, les ORF identifiés qui suppriment la toxicité représentent souvent plusieurs participants d'une voie d'hôte. Des expériences orthogonales sont ensuite effectuées pour vérifier que l'effecteur bactérien interagit en effet avec la voie impliquée. Ceci est particulièrement nécessaire si un partenaire liant tel que la clathrine ou l'actine a été identifié, parce que ces protéines sont impliquées dans une multitude de processus hôtes. D'autres expériences peuvent alors élucider la fonction physiologique de la protéine effectrice pendant l'infection. La toxicité et les écrans suppresseurs sont également de puissants outils pour déchiffrer la fonction physiologique des protéines effectrices bactériennes qui ne lient pas physiquement les protéines hôtes avec des affinités suffisantes pour détecter par immunoprécipitation ou qui interagissent avec le hôte dans les interactions hit-and-run enzymatiques qui peuvent ne pas être détectées par un écran hybride de levure-deux.

Bien que l'écran suppresseur puisse être une méthode puissante pour révéler les interactions physiologiques potentielles entre les protéines d'effecteur bactérien et les voies d'hôte, la protéine d'effecteur bactérien doit induire un défaut de croissance dans la levure, autrement l'utilisant dans le l'écran suppresseur sera de peu d'utilité. En outre, le phénotype toxique doit entraîner au moins un déficit de croissance de 2 à 3 log10, sinon il sera difficile d'identifier les suppresseurs. Si un laboratoire est mis en place pour la culture cellulaire, les protéines effecteurs de dépistage de la toxicité dans les lignées cellulaires communes telles que HeLa peut souvent donner un aperçu de savoir si elle vaut la peine de procéder à l'écran de toxicité de levure. L'expression ectopique de la protéine effectrice dans les cellules HeLa entraîne parfois une toxicité qui est très fortement corrélée avec la toxicité de la souche de levure utilisée pour ces écrans4. Les caractéristiques observables du stress dans les cellules HeLa comprennent la perte de fibres de stress, le détachement cellulaire de la plaque et la condensation nucléaire indiquant l'apoptose. Toute indication visuelle de stress dans les cellules HeLa font de la protéine d'intérêt un bon candidat pour induire un défaut de croissance dans la levure, qui se répliquent beaucoup plus rapidement et sont donc plus sensibles à la perturbation des voies essentielles.

Il convient de noter que l'écran suppresseur n'identifie pas toujours les partenaires liant l'hôte comme des suppresseurs, mais il peut toujours impliquer des composants critiques de la voie hôte (s) ciblée, donnant une vue holistique des processus biologiques détournés par le protéine effecteur bactérienne. À première vue, cela semble contre-intuitif, car on s'attendrait à ce que le fait de fournir le partenaire de liaison de la protéine effecteur en excès sauve le défaut de croissance. Dans les efforts visant à identifier les voies ciblées par la protéine C. trachomatis effector CT229 (CpoS), qui se lie à au moins 10 Rab GTPases différents pendant l'infection5, aucun des partenaires de liaison Rab supprimé la toxicité de CT229. Cependant, de nombreux suppresseurs impliqués dans le trafic de vésicule enduite de clathrine (CCV) ont été identifiés, ce qui a conduit à d'autres travaux démontrant que CT229 subvertit spécifiquement le trafic de CCV dépendant de Rab. De même, lors de l'étude de la protéine effectrice C. burnetii Cbu0041 (CirA) plusieurs Rho GTPases qui ont sauvé le défaut de croissance de levure ont été identifiés, et il a été plus tard constaté que CirA fonctionne comme une protéine d'activation GTPase (GAP) pour RhoA4.

L'utilité de l'écran suppresseur de levure pour élucider des voies d'hôte visées par des protéines d'effecteur bactérienne ne peut pas être surestimée, et d'autres chercheurs essayant de caractériser les protéines d'effecteur bactérien intracellulaire peuvent grandement bénéficier de ces techniques. Ces essais sont de valeur si les immunoprécipitations et/ou les écrans hybrides de levure-deux n'ont pas réussi à trouver un partenaire liant et peuvent élucider quelles voies sont visées par la protéine d'effecteur bactérien. Ici, des protocoles détaillés pour la toxicité et les écrans suppresseurs pour identifier les voies biologiques d'hôte visées par les protéines d'effecteur bactérien intracellulaire sont fournis, aussi bien que quelques-uns des obstacles communs éprouvés en utilisant ces essais et leur solutions correspondantes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation des médias et des réactifs

REMARQUE: Les assiettes doivent être préparées avant le jour de l'assidu et sont bonnes pour 1 mois. Les médias et les réactifs peuvent être faits à tout moment et sont bons pour 1 mois.

  1. Préparer 1 L de la solution de glucose (10 % w/v) en dissolvant 100 g de D-()-glucose dans 800 ml d'eau distillée dans un bécher de 1 000 ml. Ajuster le volume à 1 L avec de l'eau distillée. Filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 m dans une bouteille stérile de stockage multimédia de 1 L.
  2. Préparer 1 L de la solution galactose (10% w/v) en dissolvant 100 g de D-(MD)- galactose dans 800 ml d'eau distillée dans un bécher de 1 L. Ajuster le volume à 1 ml à l'aide d'eau distillée et filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 m dans une bouteille stérile de stockage multimédia de 1 000 ml.
  3. Préparer 1 L d'extrait de levure peptone dextrose (YPD) agar en dissolvant 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone, 20 g de glucose, et 20 g d'agar dans 1000 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce qu'il soit refroidi. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  4. Préparer 1 L de bouillon de YPD en dissolvant 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone et 20 g de glucose dans 1 000 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min.
  5. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) glucose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés, 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, et 15 g d'agar dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1. Bien mélanger en remuant doucement ou déposer sur une plaque à remuer. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  6. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) galactose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés, 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, et 15 g d'agar dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de galactose préparée à l'étape 1.2. Bien mélanger en remuant doucement ou déposer sur la plaque à remuer. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  7. Préparer le bouillon d'uracil synthétique (SD) (Ura-) glucose. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés et 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1.
  8. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) leucine (Leu-) glucose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de la base d'azote de levure sans acides aminés; 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, leucine, et tryptophane ; 15 g d'agar; et 0,076 g de tryptophane dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  9. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) leucine (Leu-) galactose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés; 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, leucine, et tryptophane ; 15 g d'agar; et 0,076 g de tryptophane dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de galactose préparée à l'étape 1.2. Bien mélanger en remuant doucement ou en les plaçant sur une plaque à remuer. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  10. Préparer le bouillon synthétique d'uracil (Ura-) leucine (Leu-) glucose. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés; 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, leucine, tryptophane; et 0,076 g de tryptophane dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 à 60 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1.
  11. Préparer la solution de polyéthylène glycol (PEG). Ajouter 50% w/v de polyéthylène glycol 3350 dans de l'eau distillée. Stériliser en autoclant.
  12. Préparer 1 M d'acétate de lithium (LiAc) en dissolvant 10,2 g de déshydratation d'acétate de lithium dans 200 ml d'eau distillée. Stériliser en autoclant.
  13. Préparer l'ADN du sperme de hareng. Diluer 10 mg/mL d'ADN de sperme de hareng à 2 mg/mL à l'aide d'eau distillée. Chauffer à 100 oC pendant 5 min et placer immédiatement sur la glace pendant 5 min.

2. Clonage du gène d'intérêt dans le plasmique plasmique pYesNTA-Kan

REMARQUE : À l'heure actuelle, il existe une variété de vecteurs de toxicité des levures disponibles à la fois sur le plan commercial et académique. L'écran suppresseur de levure peut être utilisé en conjonction avec un grand nombre de ces vecteurs à condition que le plasmide exprimant la protéine effectrice d'intérêt utilise une sélection de décrocheurs autres que l'uracil et un marqueur antibiotique autre que BlaR. Ce travail a utilisé un vecteur pYesNTA modifié4,5 qui comprend une cassette de résistance à la kanamycine pour faciliter le dépistage des suppresseurs potentiels. Le système de clonage doit permettre à la protéine effecteur d'être dans le cadre avec le promoteur Gal et His-Tag. La protéine de membrane d'inclusion de Chlamydia trachomatis CT229 a été employée comme preuve de principe pour ces essais.

  1. Utilisez PCR pour amplifier cT229 à partir de l'ADN génomique c. trachomatis suivant les instructions du fabricant à l'aide des amorces CT229 no 1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) et CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGAT. Utilisez les conditions PCR suivantes : (1) 98 oC pour 30 s; (2) 98 oC pour 10 s, 55 oC pour 30 s, 72 oC pour 2 min; (3) répéter l'étape 2 pour un total de 25x; (4) 72 oC pendant 10 min; et (5) 4 oC.
  2. Analyser 5 ll du produit PCR sur un gel agarose de 1 % (Figure 1).
  3. Purifier les 45 l'reste d'ADN à l'aide d'un kit de purification PCR suivant les instructions du fabricant.
  4. Diglesez les 50 OL d'insertion purifiée de PCR et de pYesNTA-Kan (Figure 2) pendant 1 h à 37 oC dans un bain d'eau à l'aide de KpnI-HF et XhoI-HF.
    REMARQUE : Pour le pYesNTA-Kan, digérez 5 g de plasmide à l'aide de 5 l de KpnI-HF, de 5 oL de XhoI-HF et de 6 oL de tampon dans un volume total de 60 l. Pour l'insertion, digérez l'ensemble des 50 L de produit PCR purifié à l'aide de 2 l de KpnI-HF, 2 'L de XhoI-HF, et 6 'L de tampon.
  5. Exécuter l'ensemble du plasmide digérer sur un gel d'agarose 1%. Effectuer la purification du plasmide digéré à l'aide d'un kit d'extraction de gel suivant les instructions du fabricant.
  6. Purifez l'insert PCR digéré à l'aide d'un kit de purification PCR suivant les instructions du fabricant.
  7. Clonez l'insert dans pYesNTA-Kan à l'aide de 2 l de pYesNTA-Kan (étape 2.5), de 2 l de tampon de ligase d'ADN, de 1 l de ligase T4 et de 15 l d'insert (étape 2.6). Incuber à température ambiante pendant 1 h.
  8. Ajoutez toute la réaction de clonage à 50 l de cellules compétentes en E. coli et effectuez la réaction de transformation.
  9. Plaquer toute la réaction de transformation sur une plaque LB contenant 100 g/mL de carbenicilline.
  10. Inoculer 10 ml de LB contenant 100 g/mL de carbenicilline avec trois colonies individuelles. Incuber toute la nuit à 37 oC en secouant à 150 tr/min.
  11. Isolez le plasmide à l'aide d'un kit de miniprep plasmien suivant les instructions du fabricant.
  12. Séquencez les plasmides isolés à l'aide d'amorces spécifiques aux gènes (étape 2.1).

3. Testez la protéine d'intérêt pour la toxicité dans la levure

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 sur yPD agar (étape 1.3) pour obtenir des colonies isolées. Incuber à 30 oC pendant 24 h.
  2. Inoculer 10 ml de bouillon de YPD (étape 1.4) avec une seule colonie de la plaque d'agar (étape 3.1). Incuber à 30 oC en secouant à 150 tr/min pendant la nuit.
  3. Ajouter 0,5 ml de la culture de la nuit à 10 ml de bouillon de YPD (étape 1,4) et incuber à 30 oC en secouant à 150 tr/min pendant 4 h.
    1. Pelleter les 10 ml de culture à 3 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
    2. Resuspendre le granule dans 1 ml d'eau stérile, transférer dans le tube de microcentrifuge et granuler à 3 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
    3. Resuspendre la pastille dans 1 ml d'acétate de lithium de 1 mm (LiAc) et la granule à 3 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
    4. Répéter le lavage LiAc 2x.
    5. Retirez le lavage. Resuspendre la pastille dans 2,4 ml de 50% PEG 3350. Ajouter 360 l de 1M LiAc, 500 oL de 2 mg/mL d'ADN de sperme de hareng, et 400 l d'eau stérile.
      REMARQUE : C'est suffisant pour 20 transformations.
    6. Ajouter 180 L du mélange de transformation de l'étape 3.3.5 à un tube de microcentrifuge contenant 5 'L de pYesNTA-Kan CT229 plasmid ADN (100-500 ng) à partir de l'étape 2.12.
    7. Incuber dans un bain d'eau à 30 oC pendant 30 min.
    8. Incuber dans un bain d'eau à 42 oC pendant 30 min.
    9. Pelleter à 3 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
    10. Retirez le mélange de transformation avec la pipette. Resuspendre la pastille dans 100 l'eau stérile. Plaquer la transformation sur SD Ura- agar avec glucose (étape 1.5).
    11. Incuber les assiettes à 30 oC pendant 48 h.
  4. Inoculer 5 ml de SD Ura- bouillon contenant du glucose (étape 1.7) avec une seule colonie de l'assiette. Incuber toute la nuit à 30 oC en secouant à 150 tr/min. Inclure la levure transformée avec le vecteur seul comme un contrôle négatif.
    1. Ajouter 180 l'eau stérile à 5 puits d'une plaque de puits de 96 (A2-A6).
    2. Vortex la culture du jour au lendemain à mélanger.
    3. Ajouter 180 l de levure au premier puits (A1). Diluer en série 1:10 (six échantillons au total, y compris non dilués).
    4. À l'aide d'une pipette multicanal, placez 5 ll de chaque dilution sur SD Ura- glucose (étape 1.5) et Ura- galactose (étape 1.6) plaques d'agar. Incuber à 30 oC pendant 48 h.
  5. Évaluez la toxicité en comparant la croissance de la levure exprimant la protéine effecteur d'intérêt cultivée sur les médias contenant du galactose à la croissance de la levure exprimant le vecteur seul.
  6. Confirmez l'expression de la protéine de fusion His-tag par le ballonnement occidental.

4. Transformez la levure toxique avec la bibliothèque génomique de levure

  1. Inoculer 100 ml de SD Ura- bouillon de glucose (étape 1,7) en utilisant 1 ml du bouillon à partir de l'étape 3.4. Incuber de 16 à 24 h à 30 oC en secouant à 150 tr/min. Placer 900 ml de SD Ura- bouillon de glucose à 30 oC pendant la nuit pour prémouréchauffer les milieux.
  2. Ajouter l'ensemble des 100 ml de la culture de la nuit au flacon préchauffé de 1 L. Incuber de 4 à 5 h à 30 oC en secouant à 150 tr/min.
    1. Pelleter la culture à 6 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
    2. Jetez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 250 ml d'eau stérile. Pelleter la culture à 6 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
    3. Jetez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 250 ml de 1 mM De LiAc. Pelleter la culture à 6 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
    4. Retirez LiAc et suspendez la pastille dans 9,6 ml de 50% PEG 3350. Ajouter 1,44 ml de 1 M LiAc, 2 ml d'ADN de sperme de hareng de 2 mg/mL, 50 g de la bibliothèque génomique pYep13 (ATCC 37323). Ajuster le volume à 15 ml avec de l'eau stérile. Mélanger délicatement par inversion.
    5. Incuber dans un bain d'eau à 30 oC pendant 30 min.
    6. Ajouter 750 l de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour améliorer l'efficacité de la transformation. Incuber dans un bain d'eau à 42 oC pendant 30 min. Mélanger par une légère inversion toutes les 10 min.
    7. Pelleter la levure à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    8. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 10 ml d'eau stérile. Pelleter à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    9. Suspendre la pastille dans 8 ml d'eau stérile.
    10. Pour déterminer l'efficacité de la transformation, diluer 1:10 et la plaque 100 'L de chaque dilution sur SD Ura- Leu- glucose agar (étape 1.8).
    11. Plaque 200 ll de l'échantillon sur les plaques SD Ura- Leu- galactose agar (étape 1.9). Utilisez 50 plaques au total.
    12. Incuber à 30 oC pendant 48 à 96 h ou jusqu'à l'apparition des colonies.
      REMARQUE : Les colonies apparaissent généralement sur les plaques d'agar de glucose à 48-72 h et les plaques d'agar de galactose à 72-96 h.
  3. Patch colonies (sauvetages potentiels) sur SD Ura- Leu- galactose agar (étape 1.9) pour étendre et faire des stocks. Incuber à 30 oC pour 24 à 48 h.
  4. Inoculer 5 ml de SD Ura- Leu- bouillon de glucose (étape 1.10) en utilisant la partie du patch. Incuber toute la nuit à 26 oC en secouant à 150 tr/min.
    1. Ajouter 180 l'eau stérile à 5 puits d'une plaque de puits de 96 (A2-A6).
    2. Vortex la culture du jour au lendemain à mélanger.
    3. Ajouter 180 l de levure au premier puits (A1). Diluer en série 1:10 (six échantillons au total, y compris non dilués).
    4. À l'aide d'une pipette multicanal, repérer 5 'L de chaque dilution sur SD Ura- glucose et SD Ura- plaques d'agar galactose. Inclure l'effecteur toxique seul comme un contrôle.
    5. Incuber à 30 oC pendant 48 h.
  5. Comparez la croissance de la levure exprimant l'effecteur toxique seul à la levure contenant les suppresseurs potentiels. Ne procéder qu'avec les suppresseurs potentiels qui ont diminué la toxicité par rapport à la levure exprimant l'effecteur seul.

5. Identifier et confirmer les suppresseurs

  1. Inoculer 5 ml de SD Ura- Leu- bouillon de glucose (étape 1,10) avec 100 l de levure à partir de l'étape 4.4 et incuber toute la nuit à 30 oC avec des secousses à 150 tr/min.
    1. Pelleter la levure à 3 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Jetez délicatement le supernatant à l'aide d'une pipette.
    2. Isolez le plasmide avec un kit de miniprep plasmique de levure suivant les instructions du fabricant.
  2. Transformez le plasmide isolé en cellules compétentes e. coli et plaquez toute la transformation sur l'agar LB avec 100 g/mL de carbenicilline. Incuber à 37 oC pendant 24 h.
  3. Inoculer 10 ml de bouillon LB contenant 100 g/mL de carbenicilline, avec trois colonies de l'assiette et incuber à 37 oC pendant la nuit en secouant à 150 tr/min.
    1. Cultures de pellets à 3 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Isolez le plasmide à l'aide d'un kit de miniprep suivant les instructions du fabricant.
  4. Retransformez la levure toxique avec les plasmides isolés de l'étape 5.3.1 suivant les étapes de la partie 3 du protocole.
    1. Inoculer 5 ml de SD Ura- Leu- bouillon de glucose avec une colonie de la plaque de transformation. Incuber toute la nuit à 30 oC en secouant à 150 tr/min.
    2. Spot sur Ura- Leu- glucose et galactose agar pour confirmer la suppression de la toxicité.
  5. Séquence utilisant des amorces pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) et pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) pour identifier les ORF àlevures.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avant que l'écran de suppression de levure réel puisse être exécuté, la protéine d'effeteur d'intérêt doit être examinée pour la toxicité dans la levure. Ceci est accompli en exprimant la protéine d'intérêt pour la levure sous le contrôle d'un promoteur galactose-inductible. La croissance du glucose (conditions non induisantes) doit d'abord être comparée pour s'assurer que la toxicité est spécifiquement due à l'expression de la protéine d'intérêt et n'est pas un défaut général. Comme le montre la fig...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit les procédures étape par étape pour identifier les voies biologiques hôtes ciblées par les protéines effectrices bactériennes à l'aide d'une toxicité de levure modifiée et d'un écran suppresseur. La souche de levure utilisée, S. cerevisiae W303, est auxotrophique à la fois pour l'uracil et la leucine. Uracil auotrophy de la souche est utilisé pour sélectionner la levure portant la protéine d'intérêt sur le vecteur pYesNTA-Kan tandis que la leucine auotrophy est utilisé pour sélectionner pour ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Shelby Andersen, Abby McCullough et Laurel Woods pour leur aide dans ces techniques. Cette étude a été financée par des fonds de démarrage du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de l'Iowa à Mary M. Weber.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher ScientificBP2641500
GalactoseMilliporeSigmaG0750-1KG
GeneJet Kit d’extraction de gelThermoFisher ScientificK0691
GeneJet Kit de purification PCRThermoFisherScientific K0701
GeneJet Kit miniprep de plasmideThermoK0503
GlucoseMilliporeSigmaG8270-1KG
Herring Sperme ADNPromegaD1811
KpnI-HFNew England BiolabsR3142S
Acétate de lithium dihydratéMilliporeSigmaL6883-250G
PeptoneFisher Scientific
Phusion Haute-fidélité ADN polyméraseNew England BiolabsM0530
Poly(éthylène glycol) 3350MilliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 ADN ligaseNew England BiolabsM0202S
TryptophaneMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFNew England BiolabsR0146S
Extrait de levureFisher ScientificBP1422-500
Levure miniprep kitZymoD2001
Base azotée de levure sans acides aminésMilliporeSigmaY0626-250G
Levure synthétique Drop-out Medium SupplémentsMilliporeSigmaY1501-20Gsans uracile
Levure synthétique Drop-out Medium SupplémentsMilliporeSigmaY1771-20Gsans uracile, leucine, tryptophane

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles