Plateforme microfluidique numérique basée sur l’électrowetting pour l’analyse immunosorbent liée à l’enzyme automatisée

Summary

Le microfluidique numérique à base d’électrowetting est une technique qui utilise un changement de tension dans l’angle de contact apparent d’une gouttelette de volume de microlitre pour faciliter sa manipulation. La combinaison de ces perles magnétiques avec des perles magnétiques fonctionnalisées permet l’intégration de multiples opérations d’unité de laboratoire pour la préparation d’échantillons et l’identification d’agents pathogènes à l’aide d’analyses immunosorbent liées à l’enzyme (ELISA).

Abstract

L’électrowetting est l’effet par lequel l’angle de contact d’une gouttelette exposée à une charge de surface est modifié. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploite les propriétés diélectriques des films d’isolants minces pour augmenter la densité de charge et donc stimuler l’effet d’électrowetting. La présence de charges entraîne une propagation électrique de la gouttelette qui permet une manipulation délibérée sur une surface hydrophobe. Ici, nous démontrons le protocole basé sur EWOD pour le traitement et la détection d’échantillons de quatre catégories d’antigènes, à l’aide d’une plate-forme automatisée d’actionnement de surface, via deux variantes d’un essai immunosorbent enzymatique (ELISA). L’ELISA est réalisée sur des perles magnétiques avec des anticorps primaires immobilisés qui peuvent être sélectionnés pour cibler un antigène spécifique. Un anticorps conjugué à HRP se lie à l’antigène et est mélangé avec H₂O₂/Luminol pour la quantification des agents pathogènes capturés. Des temps d’achèvement d’intervalle d’intervalle compris entre 6 et 10 min ont été atteints, tandis que de minuscules volumes de réactifs ont été utilisés.

Introduction

La méthode proposée vise à faciliter la préparation automatisée des échantillons pour ELISA avec la détection quantitative des antigènes en utilisant l’approche basée sur eWOD avec microfluidique numérique (DMF) et la séparation magnétophore. Il a été démontré pour de multiples applications biologiques que DMF en combinaison avec la magnétophoresis est une alternative intéressante aux applications de manutention liquide¹. Plus précisément, la détection d’agents pathogènes est un aspect implicite dans de nombreux secteurs, allant de la santé² à l’agriculture et l’environnement^3,4 à la sécurité nationale⁵. Une technologie de détection capable de faire face aux menaces des agents pathogènes doit comporter un débit élevé (p. ex. temps d’analyse court), une efficacité (faible limite de détection - LoD et une sensibilité élevée) et une spécificité (pour le type d’agent pathogène cible) pour qu’elle soit fonctionnelle⁶.

Auparavant, le DMF à base d’EWOD a été mis en œuvre avec succès pour la réaction en chaîne de polymère de transcription inversée (RT-PCR), la détection d’un agent pathogène résistant aux antibiotiques (Staphylococcus aureaus résistant à la méthicilline ou SARM), M.pneumonia et C.albicans à l’aide d’une puce à faible budget, imprimé à circuit imprimé et magnétothèse⁷. La technique a également été appliquée pour la détection des mutations de l’acide désoxyribonucléique (ADN) par pyrosequencing et détection chemiluminescente⁸. Les plates-formes basées sur EWOD étendent également leur fonctionnalité vers les applications immuno-analyse, permettant ainsi la récupération et la détection simultanées d’échantillons au sein d’une seule plate-forme intégrée. Par exemple, une seule conception de puce EWOD a été démontrée avec succès avec une plate-forme DMF pour les tests au point de service pour les deux immuno-tests à base de perles de la troponine cardiaque I à partir d’un échantillon de sang entier et comme une expérience distincte RT-PCR pour la détection du SARM². Cette puce utilise le remplissage d’huile, qui empêche l’évaporation des gouttelettes et facilite la manipulation automatisée fiable des volumes de nanolitres. Des bioapplications polyvalentes ont été étudiées avec la mise en œuvre d’approches DMF similaires couvrant les immunosses quantitatives homogènes et hétérogènes^9,10, y compris la conception d’expériences (DoE) études pour l’optimisation des paramètres d’analyse¹¹.

Malgré ses mérites évidents pour traiter l’intensification due à des volumes de travail minuscules, une plate-forme Remplie d’huile DMF peut être difficile et nécessite un certain niveau d’expertise pour fonctionner. Les systèmes remplis d’huile, parce qu’ils nécessitent des composants scellés, ne sont pas idéaux pour certaines applications sur le terrain où la transportabilité du système est importante. En outre, un système à base d’huile serait très difficile, voire impossible à utiliser pour certaines applications spécifiques, profitant de la collecte de matériaux secs sur une surface telle que proposée par Zhao et Cho¹², Junsson-Niedzi-ka et al.,¹³, et Foat et al.,¹⁴. En revanche, les systèmes sans huile sont simples à intégrer et ont l’avantage de fournir une traduction facile d’échantillons de puces à puce. Pour ces raisons, la méthode proposée a été développée pour fournir une immuno-réponse à base d’EWOD sur DMF qui ne nécessiterait pas d’huile, simplifiant efficacement le fonctionnement de l’appareil.

Dans cette contribution, nous rendons compte de l’utilisation d’une plate-forme DMF entièrement automatisée sur mesure, autonome et entièrement automatisée pour les immuno-analyses, et nous élaborons le protocole de détection rapide des biomolécules, à savoir : protéines, bactéries végétatives, spores bactériennes et virus. La combinaison de la puce EWOD avec des particules magnétiques pour la préparation automatisée de l’échantillon et l’immunoprécipitation a déjà été démontrée avec une mesure supplémentaire hors ligne de la SP¹⁵. Récemment, le diagnostic sur le terrain contre la rougeole et la rubéole IgG a été démontré dans la population éloignée du nord-ouest du Kenya par le groupe Wheeler¹⁶. Wheeler’s et notre système, étant transportable, autonome, entièrement automatisé avec des mesures chemiluminescentes en temps réel incluses sont sans doute parmi les systèmes de biodétection DMF les plus avancés disponibles.

Les deux systèmes ont été conçus avec des applications très différentes à l’esprit. Le système de Wheeler cible les biomarqueurs pour permettre le diagnostic biomédical sur les patients alors que notre système de biodétection est construit autour de l’exigence de défense pour la détection directe des agents pathogènes précédemment échantillonnés à partir de l’air. La similitude entre les deux est le principe sous-jacent de l’actionnement des gouttelettes, qui démontre le large éventail de secteurs qui influencent la vie que la technologie basée sur l’EWOD peut avoir un impact. À savoir, la plate-forme de détection basée sur Le DMF et le système EWOD associé pourraient trouver une incidence clé sur la santé (diagnostic biomédical); protection militaire et civile (détection des menaces); Agro-tech (surveillance des cultures) et sécurité au travail (surveillance contrôlée de l’environnement)

Les performances de notre plate-forme DMF sont évaluées par rapport à la détection entièrement automatisée de l’albumine du sérum humain (HSA, une protéine globulaire), Escherichia coli (E. coli, une bactérie végétative), Bacillus atrophaeus (BG, une spore bactérienne) et MS2 (un virus bactériophage). Plus important encore, la méthode DMF proposée est extrêmement polyvalente en ce sens que les anticorps de capture pourraient être échangés pour cibler la détection d’autres antigènes différents des quatre qui sont considérés dans cet article. Esquipassant entièrement la détection à base d’anticorps, la plate-forme DMF pourrait s’appuyer sur une application potentielle basée sur la biodétection des aptmères, où les perles magnétiques transportent des aptamères spécifiques pour la capture et/ou la détection des nucléotides. La conception et la réalisation des différents composants constituant la plate-forme Intégrée et entièrement autonome DMF, y compris le générateur de forme d’onde à haute tension et l’électronique d’entraînement est divulgué ailleurs⁶.

Protocol

1. Étapes préliminaires nécessaires à l’analyse

REMARQUE (IMPORTANT) : Toutes les étapes préliminaires doivent être effectuées dans un environnement stérile afin d’éviter les contaminations. L’azide de sodium ne doit pas être utilisé pour le stockage car il inhiberait l’activité de l’enzyme de peroxidase de raifort (HRP).

1. Préparer le tampon de fonctionnement (100 mM HEPES, pH 7,5), à l’aide de l’acide (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic, et ajouter Tween 80 à une concentration de 0,01% (v/v).
2. Immobiliser les anticorps primaires (anticorps de capture) à la surface des microbilles magnétiques activées par le NHS en suivant le protocole fourni par le fournisseur. En bref, le protocole Magnetic IP/Co-IP Kit(Tableau des matériaux)englobe les étapes suivantes.
   1. Aliquot 0,2 ml de perles (2 mg) dans un tube en plastique et retirer le supernatant.
   2. Laver les perles en ajoutant 1 ml de HCl glacé de 1 mm.
   3. Lier l’anticorps sélectionné (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG polyclonal, Rbanti-E. coli MRE 162 polyclonal ou Goat anti-MS2 polyclonal), 40 g/mL en 67 mM Borate Buffer, covalente pour les perles pendant 1 h avec secousse à 37 oC. Le tableau 1 contient la liste de tous les anticorps utilisés avec le protocole actuel et les agents pathogènes antigènes⁶.
   4. Laver les anticorps non liés deux fois avec 0,8 ml de tampon d’élution.
   5. Étancher la réaction avec 1 ml de tampon d’étanchéité pendant 1 h.
   6. Laver les perles une fois avec Modified Borate Buffer et une fois avec IP Lysis/Wash Buffer.
   7. Resuspendre les perles dans 0,5 ml de Lysis IP/Tampon de lavage et les conserver à 4 oC jusqu’à ce qu’il soit nécessaire d’utiliser.
      REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, un nouveau lot de microbilles est couplé aux anticorps la veille de l’isolement EWOD et de l’ELISA sur puce. Cependant, les microbilles couplées à l’anticorps primaire peuvent être stockées à 4 oC jusqu’à un mois. En cas d’agglomération, appuyez sur le flacon pour briser le précipité et pour suspendre à nouveau les perles dans la solution.
   8. Bloquer les microbilles avec l’anticorps couplé pendant la nuit, en utilisant la concentration finale 4 mg/mL pour les microbilles, dans une caséine de bloceur (1% w/v) dans 100 mM de phosphate tamponné saline (PBS).
      REMARQUE : L’étape de blocage est toujours effectuée la veille de l’essai de biodétection.
   9. Séparez les perles de la caséine blocker à l’aide d’un aimant et retirez le supernatant.
   10. Resuspendre dans 1 ml de tampon courant et mélanger pendant 1 min.
   11. Séparez les perles à l’aide de l’aimant et retirez le supernatant.
   12. Répétez les étapes de lavage ci-dessus (1.2.10 et 1.2.11) deux fois.
       REMARQUE : Trois étapes de lavage sont suffisantes pour réduire l’adhérence des perles à la surface et pour faciliter la libre circulation de la gouttelette.
   13. Resuspendre les perles dans le tampon en cours d’exécution à une concentration de 2,5 mg/mL. Cette solution de microbilles est prête à l’emploi avec la puce EWOD.
3. Préparer une solution de la peroxidase de raifort conjugué à la néoravidine (HRP) et de l’anticorps biotinylated secondaire à une concentration finale pour chacun de 1 g/mL dans Running Buffer (utilisé pour la détection de BG⁶).
   REMARQUE : Pour cibler les antigènes (tableau 1) diverses concentrations d’anticorps biotinylated secondaires, allant de 0,5 à 4,0 g/mL ont été testées avec succès.
4. Mélanger des volumes égaux du Luminol avec la solution de peroxyde d’hydrogène juste avant d’exécuter l’assay
   REMARQUE : Le luminol est utilisé pour quantifier le nombre d’événements de liaison basés sur l’enzyme HRP qui est liée de façon covalente à l’anticorps secondaire qui cible l’antigène (par exemple, pathogène). Cependant, différentes molécules et stratégies de déclaration peuvent être utilisées pour la détection¹⁷ au lieu de la chemiluminescence et Luminol.

2. Fabrication et traitement de surface des composants de la puce EWOD

REMARQUE : La puce EWOD consiste en une plaque d’actionnement avec des électrodes de chrome à motifs pour alterner l’angle de contact apparent d’une gouttelette et une plaque de couverture pour définir la hauteur des gouttelettes.

1. Dessinez la conception des électrodes et des connecteurs en 2D à l’aide du logiciel CAO standard. Inclure également le tampon de collecte des déchets avec des dimensions de 5 x 5 mm² pour stocker les solvants usagés (Figure 1).
   REMARQUE : Pour manipuler les gouttelettes, nous utilisons 47 électrodes, chacune avec des dimensions de 1,7 x 1,7 mm^2. Cette taille d’électrode s’adapte à des volumes de gouttelettes allant de 1,5 à 3 l (pour un écart de 500 m). D’après l’expérience, lorsque vous travaillez avec un écart de 500 m, 1,5 L est la taille minimale des gouttelettes qui peut être actionnée. Il correspond grosso modo au contour de gouttelette (projeté) circonscrit au pad carré. Cependant, il n’y a pas de limite théorique de taille autre que causée par la résistance (friction) du corps de fluide. Néanmoins, il est recommandé que le volume ne dépasse pas 3 L pour une actionnalisation fiable à l’aide d’un écart de 500 m. Les électrodes sont traitées par l’électronique 48 canaux.
   REMARQUE : Les dimensions et la taille des coussinets peuvent varier en fonction des volumes prévus et des opérations de l’unité de laboratoire (OBO) qui composent le protocole.
2. Envoyer le dessin de conception à un service de fabrication de masques pour l’impression du masque de chrome sur un substrat de verre. L’épaisseur de la couche de chrome est de 100 nm.
   REMARQUE : La couche de chrome sur le photomasque utilisé comme substrat pour la puce EWOD est, par définition, opaque. La conception de chacune de nos électrodes comprend une disposition de grille pour assurer la semi-transparence.
3. Couper la plaque à la taille de 56 x 56 mm² avec une précision CNC Dicing/Cutting Saw.
4. Coller du ruban adhésif sur les contacts électriques afin de les isoler pendant les deux étapes de revêtement.
5. Enrober la plaque de chrome-verre de plaque d’une couche diélectrique en déposant 6 m de Parylène-C sur sa surface. Le procédé Gorham¹⁸ est utilisé avec 7,4 g de DPX-C dans un système de dépôt de parylène(tableau des matériaux).
6. Spin-coat fluoropolymères amorphes (Table of Materials) à l’aide d’un spin-coater à 1500 tr/min pour 30 s sur le dessus de l’assiette et le cuire à 140 oC pendant 30 min.
   REMARQUE : Cela rend la surface hydrophobe. On peut valider si le revêtement a été déposé avec succès en plaçant une goutte d’eau sur la surface. L’angle de contact entre la gouttelette et la plaque doit être de l’ordre de 110o.
7. Retirez le ruban adhésif des contacts électriques.
8. Spin-coat fluoropolymères amorphes (Table of Materials) à l’aide d’un spin-coater à 1500 tr/min pour 30 s sur le dessus de la plaquette de silicium 4-in et le cuire à 140 oC pendant 30 min.
   REMARQUE : Il est important que les surfaces de l’actionnement et les plaques de couverture soient hydrophobes afin de faciliter le mouvement en douceur des gouttelettes discrètes pendant l’analyse.

3. Chargement, assemblage et fonctionnement de la puce EWOD sur la plate-forme DMF

REMARQUE : La puce EWOD fonctionne en utilisant une configuration de plaque parallèle avec un écart précis de 0,5 mm entre la plaque d’actionnement et la plaque de couverture conductrice et groundée. Cet assemblage de sandwichs est décrit dans la section actuelle.

1. Retirez le couvercle de la plate-forme DMF⁶ et placez-le sur le banc.
   REMARQUE: Une chambre sombre cage Faraday, est nécessaire pour prévenir la lumière parasite et les interférences électromagnétiques pendant la détection. Il n’y a pas de verrouillage sur le couvercle, donc, la plate-forme nous permet d’observer le mouvement des gouttelettes.
2. Placez une plaque d’actionnement propre sur la scène rotative, le chrome tourné vers le haut. La plaque doit être alignée avec le coin supérieur gauche de l’étape encastrée (Figure 2A).
3. Clamp la plaque d’actionnement à partir du haut à l’aide du panneau avec les 47 broches de contact. Cela fixe la plaque en place et facilite l’alignement avec les broches de contact.
4. Poser le cale de 0,5 mm et le séparateur de 2 mm de polyméthylmethacrylate (PMMA) sur le stade rotatif, afin de fournir un espace contrôlé entre l’actionnement et les plaques de couverture.
   REMARQUE : En option, le papier d’éinter peut être placé sur le tampon d’élimination des déchets avant de présenter les gouttelettes avant l’étape suivante. Au fur et à mesure que l’analyse avance, les déchets sont directement absorbés dans le papier qui peut être enlevé à la fin de l’analyse.
5. Chargez les gouttelettes sur les coussinets de chargement proposés (Figure 1).
   1. Aliquot quatre gouttelettes de 2,5 l du tampon Running sur les pads B-, A-, R-, E-dénotés, une gouttelette sur chaque pad.
   2. Aliquot 2,5 l de Luminol:H₂O₂ (1:1, v/v) solution sur le pad D-dénoté.
   3. Aliquot 2,5 L de neutravidin conjugué à HRP (1 g/mL) sur le tampon F-dénoté.
   4. Aliquot 2,5 L d’anticorps secondaire biotinylated (1 g/mL) sur le tampon noté G.
   5. Aliquot 2,5 l de microbilles avec anticorps primaires conjugués (2,5 mg/mL) vont sur le tampon I-dénoté.
   6. Aliquot 2,5 l de l’échantillon inconnu sur le tampon C-dénoté.
      REMARQUE : Le modèle de chargement proposé n’est qu’un exemple d’une mise en page expérimentale, cependant, le modèle de chargement peut être modifié pour correspondre aux besoins des utilisateurs, tant que ces modifications correspondent à la séquence définie dans le logiciel (Fichier supplémentaire 1).
6. Placez la plaque de couverture sur la surface de la plate-forme, en plus de la zone de récréation ronde, et faites-la glisser latéralement dans l’encastrement et sur le dessus de la plaque d’actionnement (figure 2B).
7. Placez l’aimant permanent sur le dessus de la plaque de couverture et fixez-le en faisant glisser les deux verrous (Figure 2C).
8. Faites pivoter la scène de 180 degrés et inspectez visuellement si les gouttelettes chargées sont toujours en place (figure 1C).
   REMARQUE : Il faut être capable de regarder la position et la forme des gouttelettes à travers la scène transparente et l’arrière de la plaque d’actionnement (Figure 2D). L’essai est prêt à courir si des gouttelettes rondes peuvent être vues sur les coussinets d’électrodes de chargement. Dans le cas où, une gouttelette est déplacée on peut enlever l’aimant et la plaque de couverture, puis récupérer la gouttelette déplacée avec une pipette propre et la placer à nouveau sur le bloc de chargement.
9. Vérifiez que la position de chargement de chaque gouttelette correspond à la séquence d’actionnement programmée dans le logiciel (voir Le fichier supplémentaire 1 pour plus de détails sur le logiciel).
   REMARQUE : Pour pouvoir vérifier visuellement la position des gouttelettes, le photodétecteur doit être démonté (figure 2D).
10. Placez le photodétecteur projeté "peut" dans la fente de l’étape rotative.
    REMARQUE : Le système de photodétection pivote autour d’une photodiode, qui dispose d’une grande zone de collecte (10 x 10 mm²) pour maximiser la collecte de lumière sans optique supplémentaire, plus un amplificateur trans-impedance pour minimiser le bruit⁶. Cependant, le système est extrêmement sensible et peut recueillir des signaux minuscules. Pour réduire le niveau de bruit, un certain nombre de stratégies basées sur l’électronique ont été mises en œuvre (p. ex., le système de photodétection a été protégé en le plaçant dans une cage de Faraday, un boîtier métallique connu sous le nom de « boîte » filtrée).
11. Connectez le câble au photodétecteur projeté "can".
    REMARQUE : Une fois que la puce EWOD est alignée avec le photodétecteur, la plate-forme DMF est complètement assemblée et est maintenant prête à fonctionner.
12. Placez le couvercle sur la plate-forme DMF et commencez la séquence de programme à l’aide de l’interface logicielle développée à l’Université de Hertfordshire.
    REMARQUE : Un logiciel supplémentaire est utilisé pour lire et enregistrer la luminescence de la gouttelette en fonction du temps dans un fichier CSV (voir Le fichier supplémentaire 2).
    1. Assurez-vous que la séquence programmée (voir Fichier supplémentaire 1) invite les messages à l’interface pour informer l’opérateur que « la gouttelette de luminol est prête à collecter les perles magnétiques extraites » ou « La gouttelette de détection est prête à être déplacée vers le site de détection ». Dans les deux cas, la confirmation de l’opérateur est nécessaire pour procéder à la séquence.

4. Fonctionnement en mode visuel (facultatif pour l’optimisation des protocoles)

REMARQUE : Si vous le souhaitez, afin de visualiser chaque opération à base de gouttelettes, l’analyse peut être actionnée en sautant les étapes 3.10-3.12 et en les remplaçant par les opérations suivantes.

1. Démarrez la séquence de programme à l’aide de l’interface logicielle.
   REMARQUE : Le mouvement des gouttelettes peut être observé pendant le fonctionnement en mode visuel, ce qui est utile lors de l’optimisation du protocole. Tout d’abord, pour vérifier la reproductibilité de l’opération de séparation magnétique. Par exemple, si la quantité de perles utilisées est trop faible, la séparation magnétique ne se produira pas, vice versa, si la quantité de perles est trop élevée, la gouttelette peut être immobilisée par le granule de perles. Deuxièmement, vérifier la fiabilité d’un nouvel analyse, car une formulation de gouttelettes peut entraîner une altération de l’actionnement qui peut être détectée par observation.
2. Monter le photodétecteur projeté "peut" dans la fendu de l’étape tournante, lorsqu’il est invité.
3. Connectez le câble au photodétecteur projeté "can", en insérant les broches dans la prise.
4. Placez le couvercle sur la plate-forme DMF et reprenez l’analyse.
   REMARQUE : Utilisez le logiciel supplémentaire pour lire et enregistrer la luminescence de la gouttelette en fonction du temps dans un fichier CSV (voir Dossier supplémentaire 2)

5. Enlever les déchets liquides et nettoyer la puce

ATTENTION : Assurez-vous que l’équipement est éteint et déconnecté des sources d’alimentation (ordinateur, principal) avant le nettoyage. Portez des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de verre protecteur (PPE) lors de l’enlèvement d’échantillons biologiques de la puce!

1. Pour accéder aux électrodes et aux solvants usagés sur la plaque d’actionnement, ouvrez le couvercle de la plate-forme DMF et faites pivoter l’étape à 180 degrés.
2. Détachez le boîtier de l’aimant, retirez l’aimant de la scène rotative et placez-le sur le banc.
3. Retirer la plaque de couverture, plaquette de silicium, de la coupe avec une paire de pinces, le rincer avec de l’eau DI, le sécher avec de l’air comprimé et le placer dans un plat Petri, où la plaquette peut être stockée et réutilisée.
4. Utilisez une micropipette pour déplacer les déchets liquides de la garniture sans toucher la surface.
5. Nettoyez la surface en évacuant le liquide de la plaque d’actionnement à l’aide de papier absorbant (matériau filtre).
   REMARQUE : Garder la surface intacte augmentera la longévité de la plaque d’actionnement, ce qui permet de multiples utilisations.
6. Nettoyez la plaque d’actionnement en balayant doucement la surface des électrodes à l’aide d’une goutte lette d’eau DI propre à l’aide d’une pipette propre. Retirez ensuite la gouttelette avec du papier d’mèche (matériau filtrant).
   CAUTION : Jetez les tissus, les papiers, les tipttes et les gants contaminés par du matériel biologique dans le bac à biodéchets.
7. Utilisez la plaque d’actionnement pour un autre analyse ou retirez-la de la plate-forme DMF pour le stockage ou le recyclage.

Results

L’impact de tension d’actuation a été étudié afin d’élucider quelles étaient les conditions optimales pour effectuer les essais. Une gouttelette du tampon a été entraînée à diverses tensions d’actionnement et son mouvement a été enregistré. Les résultats ont démontré (figure 3) une corrélation existait entre la tension d’actionnement carré e de la racine (V_rms) et la vitesse moyenne. Cependant, la longévité d’une plaque d’actionnement a été réduite lorsque des valeurs élevées pour les_{rm V} ont été utilisées. Sur la base de ces résultats, 105_rmv a été choisi comme tension d’actionnement standard, 120_rms V a été trouvé pour fonctionner le mieux pour le H₂O₂/Luminol gouttelette et 165_rms V a été mis en œuvre pour l’extraction LUO. Ces tensions ont été incluses dans la séquence de programmation automatisée(Fichier supplémentaire 1).

Deux immuno-tests (figure 4) ont été testés avec succès à l’aide de la puce EWOD avec la plate-forme DMF pour quatre pathogènes différents (tableau 1). La puce EWOD a facilité le mouvement consécutif des gouttelettes des coussinets de chargement vers la région de mélange et enfin vers les déchets. Il y avait deux OJO de base qui ont été répétés tout au long du protocole pour compléter ELISA. Le premier était l’extraction LUO; brièvement décrite ici, la gouttelette contenant les perles suspendues a été conduite au site de séparation au milieu de la zone de mélange, l’aimant a été activé automatiquement pour s’approcher de la puce et pour mettre en commun les perles magnétiques dans une pastille (Figure 5). Ensuite, la gouttelette a été déplacée vers la plaque de déchets, laissant les perles sur la plaque d’actionnement, concluant ainsi l’extraction LUO. Le mixage a été la prochaine clé LUO à avoir lieu sur la puce EWOD. L’échantillon d’analyte avec une concentration inconnue d’agents pathogènes a été déplacé sur les perles par électrowetting. Ensuite, les perles ont été remises en suspension en déplaçant la gouttelette avec les perles agglomérées sur la zone de mélange (10 pads au total). Ces deux OJO étaient essentiels car ils facilitaient un traitement miniaturisé, rapide et reproductible de l’échantillon avec la détection consécutive des agents pathogènes en 6 à 10 min. La figure 6 montre la séquence complète des OJO à partir d’un immuno-analyse accompli avec la puce EWOD.

Pour répondre aux niveaux souhaités d’automatisation, des variations dans le protocole pourraient être introduites. Par exemple, les perles ont été séparées de la gouttelette appauvrie d’antigène, qui a été alors transférée à la garniture de déchets, répétant l’extraction de base LUO. À ce stade, le protocole pourrait se ramifier selon que l’anticorps de détection a déjà été conjugué au HRP, en utilisant effectivement huit OBO au total pour la détection des différents antigènes (figure 7A-C). Dans ces cas, la gouttelette avec l’anticorps de détection a été apportée aux perles et ensuite mélangée par actionnement. Alternativement, lier l’anticorps de détection au conjugaison Neutravidin-HRP pourrait être exécuté séquentiellement in situ sur la puce EWOD, comme il a été démontré pour la quantification de E. coli (Figure 7D). Les deux protocoles, les ELISA en huit et dix étapes(figure 4),ont permis de détecter reproductiblement des antigènes.

Les temps d’incubation et les concentrations conjugués ont été modifiés pour trouver expérimentalement les conditions optimales pour l’assidu(figure 7A). On a constaté que le temps d’incubation de 160 s et la concentration conjuguée de 2 g/mL a atteint le meilleur rapport signal/bruit avec une augmentation de 36 % de la force du signal et pratiquement aucun changement dans les niveaux de bruit de fond. Tous les chiffres et données utilisés dans la section des résultats représentatifs ont été modifiés à partir d’un travail antérieur⁶.

Anticorps primaires / Capture	Anticorps de détection	Antigène
Anti-Human Serum Albumin [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241)	Horse Radish Peroxidase (HRP) tagged anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438)	Albumine de sérum humain (HSA, Abcam)
Rb anti-BG polyclonal	Polyclonal anti-BG biotinylated De rb	B. globigii (BG) spores
Rb anti-E.coli MRE 162 polyclonal	Biotinylated Rb anti-E. coli 162 MRE polyclonal	E. coli MRE 162
Chèvre anti-MS2 polyclonal	Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Virus du bactériophage MS2

Tableau 1 : Antigènes et anticorps testés avec ce protocole. Quatre types d’antigènes pathogènes ont été utilisés pour démontrer les capacités de la puce EWOD avec la plate-forme DMF.

Figure 1 : Conception de la plaque EWOD. (a) Notation schématique de la plaque d’actionnement EWOD avec connecteurs (carrés, haut) qui sont liés (lignes) aux électrodes (carrés, en bas). Chaque pad est attribué un numéro et peut être adressé à partir du code logiciel (Fichier supplémentaire 1). Les tampons d’électrode de chargement sont marqués par des flèches et indiqués par une lettre majuscule au-dessus ou au-dessous de chaque tampon. Une caractéristique clé de la plate-forme DMF est la zone de mixage composée de dix pads (No 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Comme guide visuel, la zone de mélange est marquée d’un rectangle rouge. ( b) Micrographe de la conception du microréseau des plaquettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Composants et étapes clés de l’assemblage du système microfluidique numérique (DMF). (A) Fixer la plaque d’actionnement EWOD, placer la cale sur la scène rotative et charger les gouttelettes. (B) Placer la plaque de couverture. (C) Montez le boîtier aimanté, attachez les verrous et faites pivoter l’étape à 180 degrés. (D) L’aimant automatisé pointe vers le bas. Inspectez la position et la forme des gouttelettes, vérifiez que les broches imprimées de circuit imprimé (PCB) sont alignées avec les contacts sur la puce EWOD, connectez le photodétecteur et placez-le dans la fente de photodétecteur. Après avoir connecté l’électronique de contrôle à un ordinateur, le système est prêt à exécuter l’essai. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Utilisation répétitive des plaques d’actionnement et impact sur la tension d’actionnement. La vitesse moyenne d’une gouttelette de la mémoire tampon en cours d’exécution est tracée en fonction de la tension d’actionnement (cercles bleus) et de l’écart standard par rapport à trois mesures indépendantes (N -3). Ici, le nombre d’essais par plaque (barres grises) indique une décomposition accrue de la surface à des tensions plus élevées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Diagramme des immuno-tests testés avec EWOD. Chaque cercle de ce diagramme représente un volume de 2,5 L chargé sur la puce EWOD. Le premier protocole (sur le côté gauche) montre huit OBO utilisant l’anticorps prémélangé-HRP conjugué ; tandis que le deuxième protocole comprend dix OBO, ajoutant séparément de l’anticorps de détection biotinylated, de l’extraction de perles et de la liaison consécutive du conjugaison neutravidin-HRP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Extraction de perles magnétiques. Ce processus est décomposé en (a-c) actionnant la gouttelette avec les perles magnétiques suspendues au site de séparation magnétique au milieu de la zone de mélange (pad no 33), (d, e) l’aimant se déplace en position concentrant les perles, (f, g, h) perles sont maintenues en place par la force magnétique tandis que la gouttelette est actionnée loin par EWOD vers le tampon de déchets (No 41). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Séquence complète d’immuno-analyses à l’aide d’EWOD, montrant les réactifs, le chargement de l’échantillon et les opérations de l’unité de laboratoire. Chaque ligne contient une séquence d’images d’échantillons des opérations caractéristiques sur une gouttelette. Les opérations sont divisées en colonnes. Le mélange n’est pas effectué pour les perles en suspension, présentées par une ligne noire cassée. Les directions des gouttelettes sont indiquées par des flèches bleues, les perles sont mises en évidence dans l’une des images par une flèche orange. La boîte grise (en bas du coin droit) sépare les deux images qui représentent le mouvement et la position dans la zone de détection, le cercle de ligne brisée met en évidence la zone de détection. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Courbes de calibration à partir d’immuno-tests effectués sur puce EWOD avec la plate-forme DMF. Comme indiqué précédemment⁶ les tensions de sortie (mV) par rapport aux concentrations sont indiquées pour : (A) albumin de sérum humain, qui est utilisé pour étudier l’effet de la concentration d’anticorps conjugués [C] et le temps d’incubation, t_inc, mesuré à partir du mélange des perles avec analyte connu jusqu’à l’extraction LUO, (B) B. atrophaeus (BG) spores montrant la reproductibilité de l’immuno-analyse, (C) MS2 bacteriophage immunoassay, et (D) dix-LUOs protocole E. coli. Abréviations : unités de formation de colonies (cfu), unités de formation de plaque (pfu), nombre d’expériences indépendantes (N), opération d’unité de laboratoire (LUO). Figure modifiée par rapport à la publication précédente⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dossier supplémentaire 1 : Séquence complète pour exécuter la plate-forme DMF pour l’analyse ELISA automatisée avec Neutravidin-HRP comme conjugué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : L’interface graphique pour la mesure de chemiluminescence et un exemple d’une mesure avec le logiciel sont montrés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole d’immuno-analyse EWOD est flexible et peut inclure un certain nombre d’opérations d’unité de laboratoire (p. ex., antigène de capture, mélange, incubation, extraction de perles, lavage) selon le type de réactif, la stabilité et les exigences d’utilisation définies par le protocole d’analyse. Comme preuve de principe, dans l’article actuel, deux protocoles d’immuno-adsay sont envisagés montrant la mise en œuvre de huit ou dix OJO (figure 4) avec la puce EWOD décrite. Une telle miniaturisation mérite à partir du microlitre, des volumes discrets de réactifs / analyte qui augmentent l’efficacité de l’ELISA en réduisant à la fois la consommation de réactifs, le temps requis par opération, essentiellement, le temps expérimental total (6 à 10 min). En outre, l’analyse est automatisée avec la manipulation chronométrée des gouttelettes qui diminue les variations et améliore la précision de l’immuno-analyse¹⁷. Dans son format actuel, l’expérience implique la manipulation manuelle des gouttelettes au début de chaque analyse, ce qui est un point pour une discussion plus approfondie dans la section suivante.

Une étape critique dans la méthode Actuelle DMF consiste à distribuer les gouttelettes sur la surface de la puce EWOD. Typiquement, une micropipette avec une pointe jetable est utilisée pour mesurer le volume exact et pour le charger. Cependant, il peut devenir difficile d’immobiliser la gouttelette sur la surface hydrophobe de la plaque d’actionnement en raison des interactions entre la gouttelette et la surface chargée de la pointe jetable. En conséquence, la gouttelette peut tirer vers le haut en suivant la surface extérieure de la pointe au lieu de rester sur la plaque. Pour éviter cela, la micropipette doit être maintenue en position verticale, perpendiculaire à la surface de la puce, sans la toucher, puis la gouttelette peut être distribuée sur le tapis de chargement en le mettant en contact avec la surface. Si la gouttelette colle à la pointe de la pipette, retournez-la à la solution de stock, échangez la pointe et redéposez une gouttelette fraîche. Dans le développement du système actuel de preuve de concept, la livraison automatique des gouttelettes peut être envisagée.

Une autre étape critique, avant d’exécuter l’analyse, est de fermer le couvercle de l’assemblage de plaque parallèle. Comme indiqué précédemment dans le protocole, le couvercle doit être glissé sur la plaque d’actionnement. La surface hydrophobe du couvercle empêche la distorsion et le déplacement des gouttelettes assises sur la plaque d’actionnement. Pour garantir le mouvement en douceur de la gouttelette, il est fortement recommandé d’utiliser une plaque d’actionnement vierge, un chargement correct des gouttelettes et l’assemblage des copeaux. La réutilisabilité des plaques d’actionnement est possible; cependant, le nombre de cycles dépend des tensions d’actionnement (figure 3) et du dépôt d’analyte/réactif sur la surface, aka biofouling. La plate-forme présentée a utilisé la puce EWOD imprimée chrome, qui pourrait être réutilisée de façon fiable pour des mesures consécutives jusqu’à quatre fois à la tension de fonctionnement de 120 V et le nettoyage des plaques intermédiaires après chaque expérience. Les plaques ont été recyclées, afin de réduire le coût par expérience, en décontalant (en brossant la surface avec un agent nettoyant non dilué avant de les rincer complètement) les fluoropolymères amorphes bioendus(Tableau des matériaux)enduit et enrobant un nouveau sur le dessus de la plaque. Cependant, le recyclage des plaques d’actionnement nécessite une manipulation manuelle, des réactifs coûteux (fluoropolymères amorphes(tableau des matériaux))et de l’équipement spécialisé (spin-coater). Les puces EWOD alternatives sont étudiées avec succès avec des substrats rentables tels que le papier¹⁹, les films en acétate ou les circuits imprimés (PCB)^20,21. Ces consommables jetables peuvent faciliter l’utilisation fiable et abordable de la plate-forme DMF et peuvent fournir des moyens d’éviter la question du biofouling.

Le biofouling est la principale limitation de l’EWOD pour les applications biologiques^22,23. Des études antérieures sur le DMF ont identifié deux mécanismes qui contribuent à la biofouling, à savoir, l’adsorption passive due aux interactions hydrophobes, et une adsorption électrostatiquement entraînée se manifestant quand un champ électrique est appliqué²⁴. Les résultats dans l’article courant sont compatibles avec cette théorie car il a été documenté la réutilisabilité de plaque d’actionnement diminue aux tensions élevées d’actionnement. Une explication possible est que les protéines adsorb facilement sur Fluoropolymer-coated (Teflon-like) surfaces et ils agrégent plus rapidement sur les surfaces encrassées par rapport aux surfaces vierges²⁴. En conséquence, les essais liés aux protéines sur DMF sont difficiles à quantifier et peuvent éprouver la perte de l’analyte, la contamination croisée et la précision diminuée¹⁷. Le pire scénario est quand une quantité critique d’adsorbs de protéine rendant ainsi l’appareil inutile. Pour minimiser le biofouling, diverses approches ont été étudiées de minimiser le temps de résidence de la gouttelette sur la puce, à travers les revêtements²³, aux additifs (c.-à-d., surfactants ou acide pluronique) dans les gouttelettes chargées de biomatériaux^6,22. Par conséquent, un aspect important de l’analyse d’immuno-analyse sur EWOD est de choisir des stratégies anti-biofouling qui sont compatibles avec le protocole spécifique à portée de main.

La plate-forme DMF automatisée est conçue pour effectuer un seul test ELISA sandwich par course tout en utilisant des volumes de microlitres pour les réactifs et l’analyte. Lorsqu’il est nécessaire, il existe des kits ELISA conventionnels en sandwich basés sur des plaques pré-enduites de 96 ou 384 puits qui, en combinaison avec l’équipement de laboratoire auxiliaire, entraînent un débit par course plus élevé; sur la base du prix des réactifs seulement, le coût approximatif par analyse/puits est de 6,04 USD (580 USD/96) et de 0,33 USD (2-580 USD/384) respectivement. Cela rend les méthodes ELISA conventionnelles idéales pour un grand nombre d’échantillons traités généralement par du personnel technique qualifié dans des laboratoires centralisés. Toutefois, dans les endroits éloignés, l’analyse détaillée des coûts de l’ELISA pour la surveillance de l’environnement a montré que lorsque les coûts d’immobilisations (c.-à-d. les coûts d’exploitation en laboratoire, les coûts récurrents, le transport d’échantillons, les fournitures et le personnel) étaient inclus, le prix réel par ELISA était de 60 USD, dont 34 USD pour les fournitures par échantillon²⁵. En revanche, la plate-forme DMF proposée est portable, nécessite une formation minimale pour fonctionner et avec des perles pré-enduites peut fournir l’analyse échantillon-réponse en quelques minutes. Par conséquent, la technologie présentée peut être déployée dans des endroits au point de besoin et compléter les analyses autrement disponibles dans les laboratoires centralisés.

Dans la section des résultats représentatifs, la plate-forme automatisée d’immuno-analyse DMF a été utilisée pour la détection directe d’agents pathogènes pour l’application de la défense. D’autres applications possibles pour la plate-forme DMF englobent, mais ne se limitent pas, biodiagnostic, surveillance continue et échantillonnage automatisé. Potentiellement, le DMF pourrait avoir un impact sur divers secteurs, du point de service pour des soins de santé personnalisés, ainsi que la surveillance contrôlée de l’environnement pour la protection des patients contre l’infection acquéreurdale aéroportée des hôpitaux, au système de surveillance des cultures pour l’agriculture et production alimentaire.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Albumine sérique anti-humaine [15C7]	Abcam	ab10241
Albumine sérique anti-humaine [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
Spores de B. atrophaeus (BG)	Dstl, Royaume-Uni	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/ a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/A
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japon	CTL-809M	Fluoropolymères amorphes. Il s’agit d’un revêtement à deux composants.
E. coli MRE 162	Dstl, Royaume-Uni	N/A
Chèvre anti-MS2 polyclonal	Dstl, Royaume-Uni	N/a
Photodiode Hamamatsu	Hamamatsu, Japon	S9270
Acide hidrochlorique (32 %)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Ecosse, Royaume-Uni	N/a
MS2 virus	Dstl, Royaume-Uni	N/A
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, États-Unis	N° CAS : 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contient tous les tampons et réactifs nécessaires à l’immobilisation enzymatique. Conserver à 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Protéine recombinante de l’albumine sérique humaine, HAS	Abcam	ab201876
SCS Système de dépôt de parylène	Système de revêtement spécialisé, États-Unis	2010
Plaquette de silicium, 4'', type p, < 100>, 1&ndash ; 10 et oméga ; cm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜ ; SS MicroTec AG, Allemagne
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrat	Thermo Scientific	37075	Il contient 50 mL de solutions de luminol/exhausteur et de peroxyde stable. Conserver à 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	Le fabricant est Surfact-Amps Detergent Solution.