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Article de méthode

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

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DOI :

10.3791/60498

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28 mai 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’analyse in situ entière d’hybridation d’ARN in situ dans le poisson zèbre et l’essai de formation de tube dans les cellules endothéliales pluripotentes induites par le patient pour étudier le rôle de l’endoglin dans la formation vasculaire.

Résumé

Le développement vasculaire est déterminé par l’expression séquentielle de gènes spécifiques, qui peuvent être étudiés en effectuant des essais d’hybridation in situ dans le poisson zèbre au cours de différents stades de développement. Pour étudier le rôle de l’endoglin (eng) dans la formation des navires pendant le développement de la telangiectasia hémorragique héréditaire (HHT), le renversement ciblé morpholino-négocié de l’eng dans le poisson zèbre sont utilisés pour étudier son expression temporelle et les fonctions associées. Ici, l’hybridation in situ de l’ARN à monture entière (WISH) est utilisée pour l’analyse de l’eng et de ses gènes en aval chez les embryons de poissons zèbres. En outre, les essais de formation de tube sont exécutés dans les cellules pluripotentes pluripotentes induites de HHT-dérivées d’endothéliale d’endothelial (iPSC-ECs ; avec des mutations d’eng). Un système spécifique d’amplification du signal utilisant la quantité entière d’hybridation In Situ - WISH fournit une résolution plus élevée et des résultats de fond inférieurs par rapport aux méthodes traditionnelles. Pour obtenir un meilleur signal, le temps de post-fixation est ajusté à 30 min après l’hybridation de la sonde. Parce que la coloration de fluorescence n’est pas sensible dans les embryons de poissons zèbres, elle est remplacée par la diaminobezidine (DAB) colorant ici. Dans ce protocole, les lignes iPSC hHT-dérivées du patient contenant une mutation d’eng sont différenciées en cellules endothéliales. Après avoir recouvert une plaque de matrice de membrane du sous-sol pendant 30 min à 37 oC, les iPSC-ECs sont ensemencés en monolayer dans des puits et conservés à 37 oC pendant 3 h. Ensuite, la longueur du tube et le nombre de branches sont calculés à l’aide d’images microscopiques. Ainsi, avec ce protocole WISH amélioré, il est démontré que l’expression réduite eng affecte la formation d’ancêtres endothéliaux dans les embryons de poissons zèbres. Ceci est encore confirmé par les essais de formation de tube utilisant iPSC-ECs dérivés d’un patient présentant HHT. Ces essais confirment le rôle de l’eng dans le développement vasculaire précoce.

Introduction

Une mutation simple sur eng (CD105) a été rapportée dans les patients présentant HHT. La mutation conduit à une prolifération accrue de la CE et à une réduction de l’allongement de l’EC négocié par le flux1,2. Il a également été précédemment signalé que l’insuffisance ENG réduit l’expression des marqueurs endothéliaux (c.-à-d., kdrl, cdh5, hey2) dans le poisson zèbre3. Endoglin, principalement exprimée dans les cellules endothéliales, est une glycoprotéine transmémbrane et fonctionne comme un co-récepteur pour transformer le facteur de croissance (TGF-MD) membres de la famille. Il ordonne bMP9 liaison sur la surface cellulaire pour réguler le gène en aval, y compris l’expression Id1, pour induire la différenciation des cellules souches vers les CE4. Ainsi, le gène eng joue des rôles importants dans la vasculogenèse et la maladie vasculaire humaine5,6. Nous avons déjà examiné les effets de l’endoglin knockdown sur la formation de vaisseaux dans les embryons de poissons zèbres, suivie par l’analyse des CPE dérivés d’iPSC acquis à partir d’un patient HHT portant une mutation eng 7. Ce protocole démontre les effets de l’insuffisance d’ENG sur l’expression et la formation de marqueur d’ancêtre endothélial, qui est une méthode quantifiable pour mesurer l’angiogenèse in vitro.

Pour étudier l’expression spatiale et temporelle, WISH est utilisé pour détecter l’expression des gènes in vivo8. L’hybridation in situ (ISH) est une méthode d’utilisation de sondes étiquetées avec des séquences complètes d’acides nucléiques cibles (ADN ou ARNM) pour détecter et visualiser les hybrides d’acide nucléique cible dans un spécimen fixe. Le processus amplifie les signaux d’expression génique in vivo et est utilisé pour détecter l’expression des gènes par microscopie. WISH a été largement utilisé dans divers animaux modèles, en particulier dans le poisson zèbre9. Il est également utilisé pour acquérir les données suivantes : 1) les modèles d’expression spatiale/temporelle des gènes, qui fournissent des informations sur la fonction et la classification des gènes; et 2) ont expressément exprimé des marqueurs génétiques qui sont utilisés dans le dépistage de drogue ou de mutant à haut débit10.

Les sondes chromogéniques sont facilement dégradées avec l’hybridation in situ chromosomique traditionnelle (CISH), ce qui entraîne un bruit de fond élevé et des signaux non spécifiques11,12. La méthode WISH utilise deux sondes doubles Z indépendantes, qui sont conçues pour s’hybrider pour cibler les séquences d’ARN. Chaque sonde contient une séquence de 18-25 complémentaire à l’ARN cible et une séquence de queue de base de 14 (conceptualisée comme Z). Les sondes cibles sont utilisées en paire (double Z). Les deux séquences de queue ensemble forment un site d’hybridation de base de 28 pour le préamplificateur, qui contient 20 sites de liaison pour l’amplificateur. L’amplificateur, à son tour, contient 20 sites de liaison pour la sonde d’étiquette et peut théoriquement donner jusqu’à 8.000 étiquettes pour chaque séquence d’ARN cible.

Cette technologie de pointe facilite l’amplification simultanée du signal et la suppression de fond pour réaliser la visualisation d’une seule molécule tout en préservant la morphologie des tissus13. D’autres modifications des méthodes WISH sont basées sur des recherches antérieures14, y compris la fixation supplémentaire et la coloration DAB. Il est prévu ici un protocole WISH amélioré qui peut fonctionner même si l’ARN cible est partiellement diminué ou dégradé. Les avantages incluent qu’il peut être complété en 24 h sans conditions sans RNase. Les signaux peuvent également être détectés simultanément par plusieurs canaux à partir de plusieurs cibles, et les résultats sont cohérents et compatibles avec les résultats de différentes plates-formes d’automatisation à haut débit.

Les résultats des modèles animaux ne reflètent pas nécessaire le même phénomène qui se produit chez l’homme. ENG contient deux paires de cystéines conservées, C30-C207 et C53-C182, qui forment des ponts de disulfide dans les régions orphelines. Pour étudier plus en plus le rôle de l’eng dans les patients HHT, les essais de formation de tube avec des iPSCs dérivés des patients de HHT ont été exécutés dans des cellules sans/avec des mutations d’eng (Cys30Arg, C30R)15. Après Kubota et coll. ont d’abord rapporté l’expérience de formation de tube16, l’essai a été développé de plusieurs façons. Il a été utilisé pour identifier les facteurs angiogéniques ou antiangiogéniques, définir les voies de signalisation dans l’angiogenèse, et identifier les gènes régulant l’angiogenèse17.

Avant la disponibilité des iPSC-ECs d’origine patiente, les chercheurs utilisaient principalement des EC cultivés pour étudier l’angiogénèse16. Cependant, pour les cellules endothéliales, il s’agit d’un défi technique de transduire des gènes exogènes avec un virus, en raison du nombre de passage limité que les CE peuvent subir. C’est parce qu’il n’y a guère assez de matériel cellulaire pour être recueilli à partir de vaisseaux humains soit de la chirurgie ou des donneurs approuvés appariés. Avec l’invention de la technique de génération iPSC par Shinya Yamanaka, ECs humains dérivés d’iPSC peuvent être utilisés de manière fiable dans des expériences in vitro, comme indiqué précédemment18.

L’utilisation de CPE transduits viralement avec un nombre et des passages limités peut être suffisante pour les études de signalisation, mais pour les études fonctionnelles, il est préférable de générer des lignées de cellules souches pluripotentes mutantes, (iPSCs ou CRISPER/Cas9-ciblé hESCs), puis les différencier en ECs pour les études d’angiogenèse qui utilisent des essais de formation de tube19. La formation de tube peut être employée pour évaluer la fonction des cellules endothéliales portant des mutations. Ce protocole décrit également la formation de tubes sur une plaque d’angiogenèse à glissement de diapositive, qui est une méthode facile, rentable et reproductible.

Le protocole ci-dessous fournit une méthode fiable et systémique pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans la formation vasculaire, ainsi que des détails pour le modèle d’expression in vivo et la quantification fonctionnelle in vitro pour la modélisation des maladies humaines.

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Protocole

Toutes les expériences animales décrites ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche de l’École de médecine de l’Université du Zhejiang.

1. Hybridation in situ à monture entière

  1. Élevage et reproduction de lignes de poissons zèbres
    1. Nourrir et élever tous les poissons zèbres adultes à 26-28 oC dans un système aquacole recirculant avec 14 h de lumière/10 h cycle sombre pour chaque jour. Utilisez des lignes de poissons zèbres AB (de type sauvage) pour les procédures suivantes.
    2. Mettez une couche de cailloux dans le fond de la boîte de reproduction comme un abri pour les œufs. Groupe de poissons parentaux dans le rapport de 2:1 (c.-à-d., deux femelles et un mâle) dans chaque boîte. Laisser frayer les poissons femelles pendant 1 jour. À la fin du frai, retirer immédiatement les poissons parents pour les empêcher de manger les œufs.
    3. Injecter les 2 ng de morpholinos et 500 pg d’ARNm en embryons à un étage à l’aide du système d’injection Femto Jet au microscope (séquence endoglin-MOs: 5'-GATGAACTCAACTCCTGTCTGAT-3'; 5-mispair control MOs séquence: 5'-AAACAGACCACATCCTCCTCATC-3').
    4. Incuber les zygotes dans l’eau de mer acide à 27 oC pendant environ 48 h.
  2. Collection et fixation des embryons de poissons zèbres
    1. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour recueillir 20-40 embryons de poissons zèbres de l’eau du système en circulation (pH - 5,0) dans un tube de 1,5 mL quand ils sont déchorionés et atteignent une période spécifique de développement. Ajouter 1 ml de solution PFA fraîchement préparée à température ambiante (RT).
      REMARQUE: La période au cours de laquelle l’embryon choisi est basée sur le but de l’expérience. Le tableau 1 montre le temps de fixation requis pour différentes périodes embryonnaires.
    2. Supprimer la solution de fixation, laver les embryons avec une solution tamponnée au phosphate avec Tween-20 (PBST, diluer 1 mL de Tween en 1000 ml de solution PBS) 3x pendant 5 minutes chacun à RT.
    3. Déshydrater les embryons par incubation dans une série de 25%, 50% et 75% de méthanol (dilué dans PBST) pendant 5 minutes chacun. Transférer les embryons à 100 % de méthanol pendant 5 min et remplacer par du méthanol frais. Conservez les embryons à -20 oC pendant la nuit ou plus.
  3. Hydratation et digestion
    1. Hydrater les embryons qui ont été conservés dans du méthanol à 100 % à l’aide d’un tamis avec du maillage en nylon au fond pour laver séquentiellement les embryons dans les puits de 12 plaques de puits avec une série de 75 %, 50 % et 25 % de méthanol (dilué dans PBST) pendant 5 min chacun. Laver les embryons avec PBST 3x pendant 5 minutes chacun à RT.
    2. Ajoutez 50 L de proteinase K (10 mg/mL) dans le tube avec des embryons et suivez le temps de digestion dans le tableau 2 à RT.
    3. Retirer la proteinase K et laver les embryons avec PBST 3x pendant 5 minutes chacun à RT.
  4. Hybridation et post-fixation des sondes
    1. Placez les sondes conçues en fonction des séquences d’ARNm de chaque gène dans un système d’hybridizatine à 40 oC jusqu’à ce que le précipité soit dissous, qui devrait prendre 10 min. Mélanger les sondes cibles de l’exemple (XM_007116,7) et deux autres gènes importants impliquent dans la formation d’ancêtre endothériel du mésoderm précoce (ici, aplnr [NM_001075105.1] et nrp1a [NM_001040326.1]) dans un tube de 1,5 mL à un rapport de 50:1:1.
    2. Ajouter 50-100 l de sondes cibles mixtes dans chaque tube avec des embryons, puis incuber toute la nuit à 40 oC.
      REMARQUE: Les sondes pré-mixtes doivent être pré-réchauffées à 40 oC et refroidies à RT avant utilisation.
    3. Préparer une solution de citrate de sodium salin de 0,2x avec Tween-20 (SSCT) : dissoudre 175,3 g de NaCl et 88 g de citrate de sodium en 1 L de dH2O pour obtenir une solution SSC 20x. Ensuite, diluer la solution 1:100 en dH2O pour obtenir une solution de 0,2 x SSCT. Diluer Tween-20 1:1000 dans la solution SSCT 0.2x.
    4. Transférer les sondes recyclées dans un nouveau tube. Laver les embryons dans la solution SSCT 3x 3x 0.2x pendant 15 minutes chacun à RT. Les sondes recyclées peuvent être réutilisées 5x-10x.
    5. Utilisez 4% de paraformaldéhyde (PFA) pour fixer les embryons pendant 30 min à RT. Laver les embryons dans la solution SSCT 0.2x 3x pendant 15 minutes chacun à RT.
      REMARQUE: Le travail de Gross-Thebing et coll. suggère une période post-fixation de 10 min14, mais le montant réel doit être ajusté en conséquence. Ici, nous avons testé 10 min post-fixation 3x, et la sensibilité de la mort DAB est significativement influencée. Après enquête, assurez-vous que 0,5-1,0 h de fixation est l’état optimal (une période de fixation plus courte ne peut pas produire un signal clair à partir de l’ARN cible, et la prolongation appropriée du temps de fixation aide à renforcer le signal et de fournir moins de bruit de fond).
  5. Hybridation d’amplificateur séquentiel et de sonde d’étiquette
    1. Retirez la solution SSCT et remplacez-la par 50 L d’Amp 1. Laisser les embryons s’installer dans l’ampe 1 à 40 oC pendant 30 min. Ensuite, laver les embryons dans la solution SSCT 0.2x 3x pendant 15 min chacun à RT.
    2. Retirez la solution SSCT et ajoutez 50 L d’Amp 2. Laisser les embryons se déposer à 40 oC pendant 15 min. Ensuite, laver les embryons dans la solution SSCT 0.2x 3x pendant 15 min chacun à RT.
    3. Retirez la solution SSCT, ajoutez 50 L d’ampl 3 et appuyez légèrement sur le tube. Ensuite, incuber les embryons à 40 oC pendant 30 min. Laver les embryons dans la solution SSCT 3x 0.2x pendant 15 minutes chacun à RT.
    4. Retirez la solution SSCT, ajoutez 50 L d’Amp 4 dans le sens de la chute et appuyez soigneusement sur le tube. Ensuite, incuber les embryons à 40 oC pendant 15 min. Laver les embryons en 0,2x SSCT 3x pendant 15 minutes chacun à RT.
  6. Contre-détention et microscopie
    1. Retirez la solution SSCT et ajoutez 50 L de DAPI à chaque tube. Incuber les embryons pendant la nuit à 4 oC.
    2. Laver les embryons avec PBST et les préparer à l’imagerie à l’aide d’une solution de 1% faible point de fusion (LMP) solution (1 g de LMP dissous dans 100 mL de dH2O) dans un plat Petri rempli de PBST.
    3. Utilisez un kit de substrat peroxidase DAB pour tacher le spécimen. Ajouter les réactifs de couleur A, B et C (50 ll chacun) à 1 ml d’eau distillée et bien mélanger pour obtenir un fluide de travail DAB complet. Ajouter le liquide au spécimen et couvrir pendant 10 min.
    4. Laver le spécimen à fond avec PBST après la coloration.
    5. Utilisez un microscope optique avec une fonction photographique pour l’imagerie des échantillons.
      REMARQUE: Si vous prenez des images plus tard, les tubes doivent être enveloppés dans du papier d’aluminium et stockés à 4 oC.

2. Essai de formation de tube

REMARQUE: Les eng ECs mutants et wildtype (contrôle) ont été différenciés des iPSC dérivés d’un patient HHT (ici, un patient féminin de 62 ans présentant des épistaxis récurrents depuis 22 ans, le saignement gastro-intestinal, les malformations artérioveineuses pulmonaires, portant une mutation d’eng de manque de sens en position c.88T’gt;C d’exon 2) et un donneur sain (sans mutation d’eng), qui ont été fournis par l’hôpital médical de Pékin Union avec l’approbation du comité d’éthique de recherche de collège.

  1. Cultures cellulaires de contrôle et de HHT iPSC
    1. Ajoutez un certain volume de matrice de membrane de sous-sol (p. ex., Matrigel) à une plaque de culture cellulaire de 6 puits pour couvrir le fond du puits et incuber les plaques pendant 1 h à 37 oC.
      REMARQUE: Lors de l’utilisation de la matrice de membrane du sous-sol stockée à -20 oC, incuber sur la glace ou dans un réfrigérateur sans gel de 4 oC jusqu’à ce qu’il soit décongelé. Ensuite, diluer à 1:100 dans DMEM/F12, puis distribuer le diluant dans des tubes de 200 L contenant 100 L chacun. Conserver les tubes à -20 oC et éviter la congélation et le décongélation répétées. Lors de l’ajout de la matrice de membrane diluée sous-sol, ne créez pas de bulles. Après avoir ajouté la matrice diluée de membrane de sous-sol, serrez la plaque de puits 6 doucement à la main de sorte qu’elle couvre uniformément le fond.
    2. Après avoir recouvert la plaque, retirez la solution de matrice de membrane du sous-sol utilisée des puits. Ensuite, ajouter 2 ml de mTeSR1 milieu dans chaque puits, et plaquer les iPSCs récoltés du dernier passage à environ 1 x 106 par puits.
  2. Génération et expansion des CE À partir d’iPSC
    1. Après environ 4 jours de culture iPSC, échangez le milieu de culture avec le milieu BEL complété par l’activin A (25 ng/mL), le BMP4 (30 ng/mL), le VEGF165 (50 ng/mL) et le CHIR99021 (1,5 M). Développer les cellules pendant 3 jours pour générer des cellules de mésoderm.
    2. Remplacer le milieu décrit à l’étape 2.2.1 avec le milieu BEL complété par VEGF (50 ng/mL) et SB431542 (10 m) pendant 4 jours pour étendre les CE vasculaires. Traiter les cellules avec le même milieu et la même culture pendant encore 3-4 jours.
    3. Utilisez des CD31-dynabeads pour purifier les EC vasculaires matures : consultez les instructions du kit CD31-dynabeads, qui relie l’anticorps CD31 humain aux perles magnétiques pour combiner les molécules de CD31 exprimées sur les CE, puis collectez les cellules CD31-positives par tampon d’éléution. Maintenir et étendre les CE purifiés dans le milieu EC-SFM contenant VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) et FBS (1 %).
  3. Placage des cellules endothéliales sur les plaques enduites de Matrigel et la microscopie
    1. Ajouter 10 l de matrice de membrane de sous-sol par puits pour enrober les plaques d’angiogenèse (voir tableau des matériaux) et incuber à 30 min à 37 oC.
    2. Récoltez les cellules endothéliales après avoir vérifié les marqueurs endothéliaux CD31 et VE-cadherin avec la coloration d’immunofluorescence et les ressuspendent dans le milieu de croissance endothéliale 2 en pipetting à plusieurs reprises. Ajouter 50 L de suspension cellulaire (2 x 105 cellules/mL) par puits sur la matrice solidifiée et incuber les cellules de 3 à 5 h à 37 oC.
      REMARQUE: Avant l’expérience de formation de tube, les marqueurs endothéliaux doivent être vérifiés pour s’assurer que le phénotype approprié des cellules endothéliales fonctionnelles. 1 x 104 cellules par puits est un nombre idéal pour la formation de tube. Trop ou trop peu de cellules ne sont pas propices à la formation de tubes. Ajouter les cellules du côté du plat et ne pas toucher la matrice de membrane du sous-sol. Utilisez le microscope léger dans le champ de grossissement élevé pour vérifier les cellules et prendre des photos.
  4. Résultats quantitatifs de la formation de tubes
    1. Observez les résultats avec un microscope à haute résolution et prenez des photos d’au moins 10 zones pour que chaque groupe obtienne des statistiques fiables sur les données.
    2. Examiner la formation de tubes endothéliaux : estimer l’étendue de la formation du tube en inspectant la longueur globale du tube, le numéro du tube et les points de branche. Évaluer et compter le nombre et la longueur des succursales à l’aide du logiciel ImageJ.

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Résultats

L’hybridation in situ de montage entière est basée sur un principe semblable au transfert d’énergie de résonance de fluorescence. Il est conçu pour améliorer à la fois la sensibilité et la spécificité dans le poisson zèbre ISH ainsi que d’amplifier les signaux spécifiques à la cible sans affecter le signal de fond.

Dans 24 embryons de poissons zèbres hpf, l’endoglin est fortement exprimé dans la veine cardinale postérie...

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Discussion

Ce protocole a appliqué une plate-forme d’analyse in situ améliorée de l’ARN à montage entier pour les essais de formation de poissons zèbres et de tubes sur iPSC-ECs dérivés d’un patient HHT. La méthode ISH traditionnelle nécessite un cycle expérimental plus long avec des étapes expérimentales supplémentaires. Le protocole a quelques améliorations importantes, l’utilisation de sondes Z doubles indépendantes et iPSCs dérivés d’un patient présentant HHT qui ont été appliqués dans les essais DE WISH et la formation de tube...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];the Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]; le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (CIFMS) [numéro de subvention 2016-I2M-4-003 (à Jun Yang)]; le PUMC Youth Found and the Fundamental Research Funds for the Central Universities [numéro de subvention 2017310013 (à Fang Zhou)].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
µ ;-Slide Angiogenèseibidi81506Ampli de culture cellulaire
1-FLACDSDSAmplification du signal
2-FLACDSDSAmplification du signal
Ampli 3-FLACDSDSAmplification du signal
4 Alt B-FLACDSDSAmplification
Corning Matrigel Matrix Corning354234Matrigel à facteur de croissance réduit DEPC
SigmaD5758Eau sans RNAase
Endothéliale humaine-SFMThermofisher11111044Culture cellulaire
ParaformaldéhydeSigma30525-89-4Embryons fixes
ParaformaldéhydeSigma30525-89-4Cellules fixes
Protéase KACDSDSDigest tissu
Citrate de sodiumSigma6132-04-3Solution SSCT : Tampon de lavage
VEGF-165STEMCELL Technologies78073Facteur de croissance
320852 320853 320854 320856 du signal 322337

Références

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Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire
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