Article de méthode

Quantification de l’adhérence des cellules tumorales dans les cryosections des ganglions lymphatiques

DOI :

10.3791/60531

⸱

9 février 2020

 ,  ,  , 
1Molecular Oncology Center, Hospital Sírio-Libanês

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse qui permet la quantification des cellules adhésives de tumeur aux cryosections de ganglion lymphatique (LN). Les cellules de tumeur LN-adhérentes sont facilement identifiées par microscopie légère et confirmées par une méthode fluorescence-basée, donnant un index d’adhérence qui indique l’affinité de cellule-contraignante de tumeur au parenchyme de LN.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les ganglions lymphatiques drainant les tumeurs (LN) ne sont pas seulement des filtres de déchets tumoraux. Ils sont l’un des sites régionaux les plus communs de résidence provisoire des cellules de tumeur disséminées dans les patients présentant différents types de cancer. La détection de ces cellules tumorales LN-résidantes est un biomarqueur important lié au pronostic pauvre et aux décisions adjuvantes de thérapie. Des modèles récents de souris ont indiqué que les cellules tumorales LN-résidantes pourraient être une source substantielle de cellules malignes pour les métastases lointaines. La capacité de quantifier l’adhérence des cellules tumorales au parenchyme LN est une jauge critique dans la recherche expérimentale qui se concentre sur l’identification des gènes ou des voies de signalisation pertinentes pour la diffusion lymphatique/métastatique. Parce que les LN sont des structures 3D complexes avec une variété d’apparences et de compositions dans les sections tissulaires selon le plan de la section, leurs matrices sont difficiles à reproduire expérimentalement in vitro d’une manière entièrement contrôlée. Ici, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse qui permet la quantification des cellules adhésives de tumeur aux cryosections de LN. En utilisant des sections sériedes de la même LN, nous adaptons la méthode classique développée par Brodt pour utiliser des étiquettes non radioactives et comptons directement le nombre de cellules tumorales adhérant par surface ln. Les cellules tumorales adhérentes à LN sont facilement identifiées par microscopie légère et confirmées par une méthode basée sur la fluorescence, donnant un indice d’adhérence qui révèle l’affinité cell-contraignante au parenchyme de LN, qui est l’évidence suggestive des altérations moléculaires dans la liaison d’affinité des intégrines à leurs LN-ligands corrélés.

Introduction

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La métastes du cancer est la principale raison de l’échec du traitement et l’aspect dominant du cancer qui met la vie en danger. Comme postulé il y a 130 ans, la propagation métastatique résulte quand une élite de cellules tumorales disséminées (DTC, les « graines ») acquièrent des capacités biologiques spécifiques qui leur permettent d’échapper aux sites primaires et d’établir une croissance maligne à des sites éloignés (le « sol »)1. Récemment, plusieurs concepts nouveaux concernant les relations « semences et sols » ont vu le jour, tels que l’induction de niches prémétastatiques (conceptualisées comme « sol fertile » nécessaires à la croissance des « graines »), l’auto-ensemencement des tumeurs primaires par les DTC, la dormance des « graines » dans les organes secondaires et le modèle de progression parallèle de la métastase2.

Pour la plupart des tumeurs malignes solides, les DTC peuvent résider et être détectés dans de nombreux organes mésenchymales, tels que la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques (LN) chez les patients atteints ou sans preuve de métastes cliniques. Puisque les LN de tumeur-vidant sont le premier emplacement de la propagation régionale des DTCs, le statut de LN est un indicateur pronostique important et est souvent associé aux décisions adjuvantes de thérapie3. Pour certains types de tumeurs, la corrélation entre l’état LN et les pires résultats est forte, y compris la tête et le cou4,5, sein6, prostate7, poumon8, gastrique9, colorectal10,11 et les cancers de la thyroïde12.

Les LN sont de petits organes ovoïdes du système lymphatique, qui sont couverts de cellules réticulaires et enfermés avec des vaisseaux lymphatiques. Ces organes sont absolument nécessaires au fonctionnement du système immunitaire13. Les LN agissent comme des plates-formes d’attraction pour les cellules flottantes immunitaires, rassemblant les lymphocytes et les cellules antigènes-présentant ensemble14. Cependant, les LN attirent également les cellules tumorales circulantes. Au fil des décennies, les LN ont été représentés comme des voies passives de transport pour les cellules tumorales métastatiques. Cependant, des études récentes ont indiqué que les cellules tumorales peuvent également être guidées vers les LN par des indices chimiothérapeutiques (chemokines) et/ou haptotactiques (éléments de matrice extracellulaire) sécrétés par l’endothélium lymphatique15. À titre d’exemples, la surexpression du récepteur CCR7 dans les cellules tumorales facilite le guidage des cellules métastatiques du mélanome vers les LN drainant la tumeur16. En outre, les protéines lN extracellulaires fournissent un échafaudage adhésif pour le recrutement et la survie des cellules tumorales circulantes17. En fait, les LN drainant les tumeurs fournissent un sol fertile pour l’ensemencement des DTC, qui peuvent être maintenus dans des états proliférants ou dormants par des signaux microenvironnementaux LN spécifiques18. Le sort final de ces DTC résidant en LN est controversé; certains travaux suggèrent que ces cellules sont des indicateurs passifs de progression métastatique19, tandis que d’autres proposent qu’elles sont plus susceptibles d’être les fondateurs de la résistance (en auto-ensemencement des sites primaires) et / ou agissent comme réservoirs cellulaires pour les métastases (propagation de «graines» pour la croissance du cancer tertiaire)20,21. Récemment, à l’aide de modèles précliniques, il a été démontré qu’une fraction de ces DTC résidant en LN ont activement envahi les vaisseaux sanguins, sont entrés dans la circulation sanguine et ont colonisé les poumons21.

Considérant que la présence de cellules cancéreuses dans les LN est un marqueur pour l’agressivité et l’invasivité de cancer, dans cette étude, nous avons optimisé une méthode classique développée par Brodt22 pour mesurer quantitativement l’adhérence de cellules de tumeur aux LNs in vitro. L’utilisation d’un test à base de fluorescence nous a permis de développer un protocole peu coûteux, rapide, sensible et respectueux de l’environnement (non radioactif) pour la détection des altérations adhésives entre les cellules tumorales et les cryosections LN. Utilisant les cellules de cancer du sein de MCF-7 exprimant différents niveaux de l’expression de gène de NDRG4 et des sections congelées de rat LN pour illustrer la méthode, nous avons prouvé que ce protocole a permis une bonne corrélation entre l’adhérence de cellules de tumeur aux LNs in vitro et métastasis de LN observés dans les patients de cancer du sein24.

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Protocole

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Des LN ont été récupérés des carcasses fraîches des rats adultes sains de Wistar sacrifiés par la dislocation cervicale. Nous avons suivi les Lignes directrices des NIH pour la douleur et la détresse chez les animaux de laboratoire et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique et de recherche animale de l’Institut de recherche et d’éducation de l’hôpital de Sorio-Libanês (CEUA P 2016-04).

REMARQUE : Tous les tissus congelés frais sont considérés comme biodangereux et doivent être manipulés en utilisant les précautions de biosécurité appropriées.

1. Lymphadenectomy et Cryosectioning

  1. Placer les carcasses fraîches de rats Wistar adultes (180-220 g) couchées dans un recumbency dorsal sur un tableau de dissection propre à température ambiante.
    REMARQUE : Les LN doivent être collectés jusqu’à 30 min après l’euthanasie.
  2. Vaporiser la carcasse du rat avec 70 % d’alcool isopropyl et utiliser des instruments stérilisés pour la récolte du LN.
  3. Soulevez la peau abdominale à l’aide d’une pince à épiler et ouvrez une cavité avec une incision médiale sans endommager le tissu sous-jacent, exposant les viscères abdominaux. Enlechez l’intestin et les LN thoraciques et abdominaux deviennent visibles (Figure 1).
  4. Excisez soigneusement les LN de chaque rat avec l’utilisation de ciseaux à pointe émoussée pour éviter de blesser l’artère mésentérique supérieure qui se trouve derrière.
    REMARQUE : Selon l’emplacement du ganglion lymphatique réséqué, il est nécessaire de nettoyer d’autres tissus qui y adhèrent, comme le tissu mésentérique.
  5. Récoltez les LN en tubes coniques de 15 ml contenant 5 ml de phosphate stérile tamponné salin (PBS).
  6. Jetez correctement les carcasses de rat.
  7. Retirer les LN frais du PBS, rouler et sécher le nœud sur un papier filtre sec. Placez-le dans un petit plat Petri et ajoutez une solution d’intégration pour les échantillons de tissus congelés (O.C.T.) pendant 2 min.
  8. Transférer et orienter le LN face vers le bas dans une position désirée dans la base d’un cryomold, avec juste assez d’O.C.T pour le couvrir. Évitez les bulles près du tissu. La surface de sectionnement est le fond du cryomold.
  9. Congelez immédiatement le cryomold dans une glacière en polystyrène avec de la glace sèche. Lorsqu’il y a encore une petite partie d’O.C.T. non congelé (20-35 s), transférez l’échantillon dans du papier d’aluminium et placez-le dans une glacière avec de la glace sèche tout en continuant à congeler d’autres échantillons. À la fin, entreposer tous les échantillons à -80 oC jusqu’à la section.
  10. Sectiondez le LN avec un cryostat ajustant l’épaisseur de la section à 5-8 m. Transférer les crysections sur des lames de microscope.
    REMARQUE : Avant de sectionner, retirer les échantillons congelés du congélateur de -80 oC et leur permettre d’alcaliniser à la température de la chambre microtome cryostat à -22 oC pendant environ 30 min. Les glissières contenant du LN peuvent être entreposées à -80 oC pendant un mois.

2. Étiquetage cellulaire avec colorants fluorescents

REMARQUE : Les colorants fluorescents sont largement utilisés en biologie cellulaire. Nous préférons utiliser l’étiquetage à longue chaîne dialkylcarbocyanines (DiI(C18), excitation 549 nm, Émission 565 nm) parce qu’ils sont lumineux, stables et peuvent être ajoutés directement aux milieux de culture, n’affecte pas la viabilité cellulaire ou les propriétés adhésives cellulaires25,26.

  1. Dissocier les cellules qui poussent dans des conditions idéales (c.-à-d. dans un milieu complet) et se resuspendre dans un milieu sans sérum à une densité de 106 cellules/mL.
  2. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire (106 cellules) à un tube conique de 15 ml et étiqueter avec Dil(C18) (2 g/mL) pendant 10 min à 37 oC.
    REMARQUE : Après 5 min, agiter doucement les tubes pour éviter la sédimentation cellulaire et la sous-coloration des cellules sédimentées. De plus grandes densités exigent des temps d’incubation plus longs pour la coloration uniforme. Un temps d’incubation optimal pour la coloration cellulaire varie selon la lignée cellulaire. Il peut être mieux quantifié à l’aide du canal de détection classique de cytométrie du débit FL2 (Figure 2A).
  3. Centrifuger les tubes de suspension étiquetés à 300 x g pendant 4 min.
  4. Retirer le supernatant et laver deux fois dans 10 ml de milieu sans sérum. Récupérer les cellules sous forme de granulés rouges. Resuspendre les cellules à 106 cellules/mL dans un milieu sans sérum avec 0,1% d’albumine bovine (BSA).

3. Préenduisez les plats avec la solution de poly-l-lysine ou BSA comme contrôle d’ensemencement (facultatif)

REMARQUE : Nous avons utilisé des plats de culture cellulaire précouchés avec du PLL comme surfaces de contrôle de chargement positives pour nous assurer que différents groupes expérimentaux de cellules tumorales étaient enseisés au même nombre, ainsi que des surfaces enduites de BSA comme contrôles négatifs.

  1. Dans des conditions stériles, pour préparer des puits enduits de PLL ou de BSA, ajouter 300 ll de PLL (0,1 % w/v en H2O) ou BSA (dilué à 2,5 % w/v en H2O) directement à la plaque de 24 puits et couver la nuit à 4 oC.
  2. Enlever la solution par aspiration, rincer délicatement la surface avec du PBS stérile et sécher à l’air la plaque à température ambiante dans le capuchon de culture tissulaire avant l’ensemencement cellulaire.
    REMARQUE : Les volumes finaux de PLL ou de BSA doivent être ajustés en fonction de la zone des différentes plaques de puits.

4. Ensemencement de cellules tumorales étiquetées fluorescentes sur des cryosections LN ou des puits recouverts de PLL/BSA

REMARQUE : En tant que témoins expérimentaux, nous avons utilisé (1) des plats de culture cellulaire précouchés de PLL ou de BSA et (2) des sections consécutives de la même LN par expérience (voir ce détail dans la figure 2D), où ce dernier minimisera les variations régionales dans la composition de la matrice extracellulaire (ECM) de chaque section LN, qui à son tour peut dicter le taux d’adhérence cellulaire. Pour l’adhérence de cellules tumorales suivante, sélectionnez cryosections LN de haute qualité et séquentielles.

  1. Laver délicatement les cryosections deux fois avec du PBS et réhydrater avec du PBS pendant 15 min à température ambiante.
  2. Bloquer l’adhérence non spécifique à la cryosection avec 2,5 % de BSA pendant 30 min à 37 oC. Utilisez des chambres de lavage immunohistochimiques et des berceaux lamina pour s’assurer que l’ensemble de l’O.C.T a été enlevé pendant les lavages et les incubations.
  3. Égoutter l’excès de BSA sur un essuie-tout sec, sécher le contour des sections LN avec un coton-tige et encercler les sections à l’aide d’un stylo PAP.
  4. Pour l’adhérence des cellules tumorales, ajoutez 100 ll de suspension cellulaire (à partir de l’étape 2.4) à chaque section LN encerclée ou bien dans les plaques enduites de 24 puits De PLL et placez-la dans un support de chambre humidifié pendant 1-2 h à 37 oC dans l’incubateur conventionnel de culture cellulaire.
    REMARQUE : Le volume final de la suspension cellulaire doit être ajusté en fonction de la zone des différents LN encerclés.
  5. Laver délicatement les cellules non adhérentes quatre fois avec du PBS. Fixer les cellules fluorescentes adhérentes restantes avec 3,7 % de formaldéhyde en PBS pendant 15 minutes à température ambiante.

5. Quantification manuelle de l’indice adhésif

REMARQUE : L’indice adhésif (c.-à-d. les cellules tumorales/LN mm2) a été atteint à l’aide d’un objectif 10X et en comptant manuellement le nombre de cellules tumorales, facilement identifiée par microscopie légère et confirmée par une microscopie à fluorescence (figure 2D), par ganglions lymphatiques de plusieurs domaines indépendants (obtenu à l’aide du logiciel ImageJ/FIJI de l’Institut national de la santé).

  1. Utilisez un microscope fluorescent avec un objectif 10x pour prendre des images TIFF séparées dans deux canaux correspondant aux champs lumineux et rouge-fluorescent (Figure 2D). Nommez et enregistrez systématiquement ces images.
  2. Démarrer ImageJ/FIJI, ouvrir les images et définir la balance. Il est nécessaire d’utiliser une échelle d’étalonnage (p. ex., une règle micrométrique de 1 mm) (figure 2C).
  3. Ouvrez la photo de la règle micrométrique (ou un micromètre de scène), sélectionnez l’outil straight line et tracez une ligne droite qui définit une distance connue.
  4. Dans le menu Analysez, sélectionnez Échelle de définir. La distance en pixels sera remplie en fonction de la longueur (en pixels) de la ligne tracée à l’étape 5.3. La distance connue sera remplie de la distance réelle (dans ce cas, en millimètres) et de l’unité de longueur dans le champ de l’unité de longueur (dans ce cas, en millimètres).
  5. Cliquez sur Global (cet étalonnage s’applique à toutes les images ouvertes dans cette session ImageJ/FIJI) et appuyez sur OK.
  6. Quantification de la zone des ganglions lymphatiques : Sélectionnez l’outil Wand et en cliquant deux fois, ouvrez les paramètres de l’outil Wand. Définir le mode à 8 connectés. Cliquez sur la photo et définir la tolérance jusqu’à ce que sélectionner tous les ganglions lymphatiques dans la photo et appuyez sur OK. Pour mesurer la zone, ouvrez Analyze Mesure (CTRL et M). La zone est exprimée dans les unités fixées plus tôt.
  7. Quantification des cellules tumorales : Ouvrez les images de microscopie/fluorescence légère dans le logiciel FIJI. Sélectionnez Plugins Analyser Compteur de cellules (en anglais) Compteur de cellules. Cliquez sur la photo pour être quantifiée et appuyez sur le bouton Initialize dans la fenêtre du comptoir cellulaire. Sélectionnez le type de compteur (1-8) et cliquez sur les cellules de la photo. Pour initialiser la photo suivante, appuyez sur le bouton Reset dans la fenêtre du comptoir cellulaire, ouvrez la nouvelle photo et répétez toutes les étapes.
    REMARQUE : L’indice d’adhérence de LN est exprimé en tant que nombre de cellules de tumeur adhérentes par secteur couvert de LN (cellules/mm2).

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Résultats

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Nous illustrons l’analyse en évaluant le potentiel adhésif LN des cellules fluorescentes rouges de cancer du sein MCF-7 exprimant différents niveaux du gène NDRG4 (appelé cellules NDRG4-positives et NDRG4-négatives), un modulateur négatif du clustering bêta1-intégrine à la surface cellulaire24,en examinant les fractions des cellules tumorales de Rat LN-adhérents. Des exemples d’images brutes de ce protocole sont présentés à la figure 2...

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Discussion

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La dissémination du système lymphatique des cellules cancéreuses nécessite une variété d’événements complexes dirigés par des cellules. Ils commencent avec le détachement cellulaire de la tumeur primaire et le remodelage de l’architecture extracellulaire de matrice (ECM), et sont soutenus par la chimiotaxis persistante et la migration active par les lymphatiques afférents en route aux LNs sentinelles. Si les cellules cancéreuses adhèrent et survivent dans les LN, elles peuvent facilement se propager à d’autres organes se...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous remercions le Dr Rosana De Lima Pagano et Ana Carolina Pinheiro Campos pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de: FAPESP - Fondation de recherche de Sao Paulo (2016/07463-4) et Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
15 mL Tubes coniquesCorning352096
2-propanolMerck109634
Benchtop Laminar FlowEsco Bac de culture
pour disqueLeica14020139126
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA9647-100
Flacon de culture cellulaire T-25 cm2Corning430372
CryostatLeicaCM1860
avec aimantLeica14018340426
DiIC18 Cell Traker DyeMolecular ProbesV-22885
Fetal Bovin Serum (FBS)Life Technologies12657-029
Microscope à fluorescenceNikon Eclipse 80
Forma Series II Incubateur CO2Thermo Scientific
FormaldéhydeSigma-Aldrich252549
Rasoir jetable à profil élevéLeica14035838926
Incubation Cube (IHC)KASVIK560030
Microscope inverséOlympusCKX31
Isofluran 100 mLCristá ; lia
Liquid Bloquer Super Pap PenAbcam, Life Science Reagentsab2601
Température de coupe optimale Composé « OCT »Sakura4583
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Life Technologies70011-044
Poly-L-lysineSigma-AldrichP8920
RPMIGibco31800-022
Pipettes sérologiques 1 mLJet BiofilGSP010001
Pipettes sérologiques 10 mLJet BiofilGSP010010
Pipettes sérologiques 2 mLJet BiofilGSP010002
Pipettes sérologiques 5 mLJet BiofilGSP010005
Pipettes sérologiques 50 mLJet BiofilGSP010050
Pipette sérologique Easypet 3Eppendorf
Tissue-Tek cryomoldSakura4557
Trypan Blue 0.4 %InvitrogenT10282
TrypsinInstituto Adolfo LutzATV
cellulaire Cryostat-Brush UV

Références

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Mots-clés

Indice d adh sionMicroscopie fluorescenceCompteur de cellulesMarquage au DiICoupe au cryostatLavage au PBSFixation au formald hydeDiss mination m tastasique

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