Ici, nous présentons trois méthodes pour évaluer la migration et l’infiltration de neutrophiles in vivo et in vitro. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.
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Article de méthode
Détection de la migration et de l’infiltration des neutrophiles chez les souris
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les neutrophiles sont un membre important du système immunitaire inné et jouent un rôle central dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes et les réactions inflammatoires pathologiques. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de cytokines et de chemokines. L’infiltration écrasante des neutrophiles peut mener aux dommages aveugles de tissu, tels que dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les neutrophiles isolés de l’exsudation péritonéale répondent à un chimioattractant défini, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro dans les essais de chambre de Transwell ou de Zigmond. L’expérience de poche d’air peut être employée pour évaluer la chimiotaxis des neutrophiles vers le lipopolysaccharide (LPS) in vivo. Le modèle de souris de l’arthrite adjuvant-induite (AA) est fréquemment employé dans la recherche de RA, et la coloration immunohistochemical des sections articulaires avec des anticorps anti-myeloperoxidase (MPO) ou anti-neutrophile d’élastase (NE) est une méthode bien établie pour mesurer neutrophile infiltration. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.
Introduction
Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et représentent 50 à 70 % de l’ensemble de la population de globules blancs chez l’homme1. Les neutrophiles sont l’un des principaux intervenants pendant l’inflammation aigue. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de la direction des cytokines et des chimiokines libérées par les cellules de tissu-résident2,3,4, qui est médiée par les interactions entre les molécules d’adhérence cellulaire à la surface des neutrophiles et des cellules endothéli....
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales ont été examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine chinoise de Beijing.
REMARQUE : Des souris C57BL/6 (7-8 semaines) ont été employées.
1. Isolement de Neutrophile
- Acquisition de cellules exsudatrices péritonéaux
- Préparer la solution peptone protéose fraîche de 10% dans ddH2O. Calculez le volume nécessaire en fonction du nombre de souris.
REMARQUE : Définir le nombre de souris en tant que N, (2N-1) mL de solution doit être dissous et filtré à l’avance. - Vaporiser l’espace de ....
- Préparer la solution peptone protéose fraîche de 10% dans ddH2O. Calculez le volume nécessaire en fonction du nombre de souris.
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Résultats
Des cellules d’exsudat péritonéal ont été rassemblées du fluide de lavage des souris. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu complet RPMI-1640, superposées sur une double étape (54,8 %/70,2 %) gradient de densité discontinu (Figure 1A), et centrifugé à 1 500 x g pendant 30 min. Les neutrophiles (95 %, 1 x 107 neutrophiles/souris) ont été récupérés à partir de l’interface inférieure (
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Discussion
Des protocoles détaillés de neutrophiles hautement purifiés provenant du sang périphérique7, de la moelle osseuse et des tissus18 sont disponibles depuis longtemps. Ici nous adoptons une méthode d’isoler des neutrophiles du fluide péritonéal19 dans lequel les neutrophiles mûrs restent inactivés pour d’autres études anti-inflammatoires et antioxydantes.
Nous avons utilisé l’expérience de poche d’air pour explorer l’infiltra.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 81430099 et 31500704), international Cooperation and Exchange Projects (numéro de subvention 2014DFA32950), et le programme de recherche de l’Université de médecine chinoise de Beijing ( numéros de subvention BUCM-2019-JCRC006 et 2019-JYB-TD013).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,1 % Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transférer 20 mg de grene rapide FCF dans un flacon dans un autre bécher de 100 mL. Ajouter 20 ml de H2O dans le bécher et dissoudre la coloration en remuant pour obtenir une solution verte rapide à 0,1 %, puis la filtrer à l’aide d’un filtre Nalgene PES 75 mm |
| 0,1 % Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transférer 20 mg de coloration Safranine O dans un flacon dans un bécher de 100 ml. Ajouter 20 mL de H2O dans le bécher et dissoudre la coloration en agitant pour obtenir une solution de coloration à 0,1 % de safranine O, et la filtrer à l’aide d’un filtre Nalgene PES 75 mm |
| 0,5 M Solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 8,0 | Sigma | 324506 | |
| Stérile 100 % éthanol | Chemical Works | ||
| 100 % méthanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Tube de centrifugation conique en polypropylène | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 g x 1 1/4 » Aiguille | BD | 305120 | |
| 26 g x 3/8 » Aiguille | BD | 305110 | |
| 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) | Dissoudre 0,3 g BSA dans 10 mL de PBS | ||
| 3 % H2O2 | Mélanger 1 mL 30 % H2O2 avec du méthanol avec 9 mL de méthanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Aiguille | BD | 305106 | |
| 30 % H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Seringue | BD | Z683574 | |
| 50 mL Tube de centrifugation conique en polypropylène | Falcon | 14-432-22 | |
| d’éthanol | 500 mL 100 % dH2O | ||
| 54,8 % Mélange Percoll | 2,74 mL SIP avec 2,26 mL 1× ; PBS, statique | ||
| 70 % Ethanol Mix | 700 mL 100 % éthanol avec 300 mL dH2O | ||
| 70,2 % Percoll | Mix 3,51 mL SIP avec 1,49 mL 1× ; PBS, statique | ||
| Mélange d’éthanol | 800 mL 100 % éthanol avec 200 mL dH2O | ||
| Mélange d’éthanol | 950 mL 100 % éthanol avec 50 mL dH2O | ||
| Alcool acide Solution de différenciation ultra-rapide | Beyotime | C0165S | |
| ANTICORPS | |||
| Anticorps anti-myéloperoxydase | Abcam | ab208670 | |
| Anticorps anti-élastase neutrophile | Abcam | ab21595 | |
| Analyseur automatique d’hématologie | Sysmex | XS-800i | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Adjuvant complet de Freund, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Jauge d’épaisseur de cadran | Mitutoyo | 7301 | |
| Microtubes Eppendorf, 1,5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Système d’anesthésie gazeuse | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Chèvre Anti-Lapin IgG H& L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | Il s’agit de l’anticorps secondaire utilisé dans la coloration immunohistochimique. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 02-016-1A | Solution |
| de coloration à l’hématoxyline | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MILIEUX ET SUPPLÉMENTS | |||
| Kit de coloration du cartilage Modified Safranin O-fast Green FCF | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Pénicilline Streptomycine Solution, 100× ; | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Gradient de densité milieu |
| perméabilisation | Mix 100 &mu ; L Triton X-100 avec 1 L dH2O pour obtenir 0,01 | ||
| solution saline tampon phosphate Triton X-100 (PBS), 1& fois ; | Mélanger 90 % de ddH2O avec 10 % (v/v) 10&fois ; PBS, | ||
| de phosphate salin autoclavé (PBS), 10× ; | Dissoudre 16 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 2,88 g de Na2HPO4· ; 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (anhydre) dans 200 mL de ddH2O, ajuster le pH 7,4, autoclavé | ||
| ARTICLES ET ÉQUIPEMENTS | |||
| Protéose Peptone | Oxoïde | 1865317 | |
| Tampon | de récupérationMélanger 18 mL de tampon de récupération A avec 82 mL de tampon de récupération B, ajouter dH2O à 1000 mL, ajuster le pH à 6,0 | ||
| Tampon de récupération A Stock pour IHC | Dissoudre 4,2 g d’acide citrique (C6H5O7· ; H2O) dans 200 mL dH2O | ||
| Tampon de récupération B Stock pour IHC | Dissolve 5,88 g de citrate trisodique dihydraté (C6H5Na3O7· ; 2H20) dans 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 moyen | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Milieu | RPMI-1640 est complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine. | ||
| Shu Rui U40 Aiguille d’injection d’insuline stérile jetable 1 mL | BD | 328421 | |
| Lame | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonique Percoll (SIP) | Mélanger 90 % (v/v) de percoll avec 10 % (v/v) 10&fois ; PBS, rester immobile pendant 20 min | ||
| Tampon de lavage dans la poche d’air Diluer | 0,5 M EDTA à 10 mM avec HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
Références
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. A....
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