Microarrays de bioparticules pour l’analyse chimiotaxique et moléculaire de l’ésaimage humaine de neutrophile in vitro

Résumé

Ce protocole génère des microréseaux de bioparticules qui fournissent un essaim de neutrophile contrôlé spatialement. Il permet un accès facile aux médiateurs qui neutrophiles libèrent pendant la migration et permet une analyse d’imagerie quantitative.

Résumé

L’essaimage de neutrophile est un processus coopératif par lequel les neutrophiles scellent un site d’infection et favorisent la réorganisation des tissus. L’essaimage a été classiquement étudiée in vivo dans des modèles animaux montrant des modèles caractéristiques de migration cellulaire. Cependant, les modèles in vivo ont plusieurs limites, y compris les médiateurs intercellulaires qui sont difficiles d’accès et d’analyse, ainsi que l’incapacité d’analyser directement les neutrophiles humains. En raison de ces limitations, il est nécessaire d’avoir une plate-forme in vitro qui étudie le grouillage de neutrophiles humains et facilite l’accès aux signaux moléculaires générés pendant l’essaimage. Ici, un processus de micro-amactinage en plusieurs étapes est utilisé pour générer un microréseau de bioparticules qui stimule l’essaimage en imitant une infection in vivo. Le microarray de bioparticules induit des neutrophiles à essaimer d’une manière contrôlée et stable. Sur le microarray, les neutrophiles augmentent en vitesse et forment des essaims stables autour des grappes de bioparticules. En outre, le supernatant généré par les neutrophiles a été analysé et 16 protéines ont été découvertes pour avoir été exprimées différemment au cours de l’essaimage. Cette plate-forme d’essaimage in vitro facilite l’analyse directe de la migration des neutrophiles et de la libération de protéines d’une manière reproductible et contrôlée spatialement.

Introduction

Neutrophiles, le globule blanc le plus abondant dans la circulation sanguine¹, attirent l’attention en tant que cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles^2,3 parce qu’ils peuvent être impliqués dans une variété de conditions médicales, y compris la goutte⁴, sepsis³, traumatisme^5,6, cancer^1,7,8, et diverses maladies auto-immunes^5,

Protocole

Les auteurs reconnaissent les volontaires en bonne santé qui ont gentiment donné leur sang. Des échantillons de sang ont été obtenus après le consentement éclairé du volontaire selon le protocole de la commission d’examen institutionnel (CISR) #2018H0268 examiné par le Comité des sciences biomédicales de l’Université d’État de l’Ohio.

1. Microfabrication de microréseau de bioparticules

1. À l’aide de procédures photolithographie standard, générer la plaquette de silicium maître.
   1. Générez une preuve de la conception souhaitée à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD), puis envoyez à un fabricant de phot....

Résultats

Lorsque des neutrophiles sont ajoutés au microréseau de bioparticules, les neutrophiles qui contactent les grappes de bioparticules s’activent et déclenchent la réponse de l’essaimage. Le microréseau de bioparticules a été validé à l’aide d’une microscopie fluorescente en accéléré pour suivre la migration des neutrophiles vers les grappes de bioparticules (Vidéo S1). La migration des noyaux neutrophiles individuels est suivie lorsqu’ils migrent vers le groupe de bioparticules. Lorsque les neutrophiles at.......

Discussion

Nous avons développé une plate-forme de micro-ampillage pour générer des réseaux uniformes de bioparticules pour stimuler l’essaimage in vitro de neutrophiles. La nature in vitro de notre plate-forme nous permet de contourner les complications qui surgissent avec les expériences d’essaimage in vivo, à savoir la faible capacité d’analyser les médiateurs libérés par les neutrophiles grouillant s’agitent⁵. En outre, les modèles in vivo sont généralement effectués chez les rongeurs^11.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aimant EasySep « The Big Easy »	STEMCELL Technologies	18001	Aimant à utiliser avec le kit d’isolement de neutrophiles
Incubateur de cellules	Okolab	777057437 / 77057343	Incubateur à cage Okolab pour le contrôle de la température et du CO2
Kit d’isolement des neutrophiles humains EasySep	STEMCELL Technologies	17957	Kit pour la sélection immunomagnétique négative des neutrophiles humains
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	Microscope de recherche inversé
Escherichia coli (souche K-12) BioParticles Texas Red Conjugate	Invitrogen	E2863	Poudre de bioparticules, se dissoudre dans l’eau avant d’être ajoutée au réseau Zetag® ;
Harris Uni-Core 8-mm poinçon de biopsie	Sigma Aldrich	Z708925	Pour couper les tampons PDMS
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	Agent d’agrégation d’érythrocytes pour séparer la couche leucocytaire des globules rouges dans le sang humain frais
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Nucleus fluorescent
stain Human L1000 Array	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4	Réseau haute densité pour détecter 1000 protéines humaines
Albumine sérique humaine (HSA)	Sigma Aldrich	A5843	HSA à faible teneur en endotoxines, pour préparer des solutions à 2 % dans l’IMDM pour les neutrophiles isolés
Iscove’s Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053	Pour remettre en suspension les neutrophiles isolés
Tubes K2-EDTA	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	Tubes pour prélèvement sanguin
Masque photo chromé à faible réflectivité	Masque photo Front Range	N/A	Dimensions 5 » x 5 » x 0,09 » (L x l x P)
Scanner de microréseaux	Perkin Elmer	ASCNGX00	Lecteur de fluorescence de microdomaines à motifs protéiques Logiciel d’analyse d’images
de microscopie - Imaris	Bitplane	9.3.0	Logiciel pour l’analyse
automatique du suivi cellulaireNiS Elements Advanced Research Software Package	Nikon Instruments	MQS31100	Logiciel pour l’imagerie automatique de cellules vivantes et le calcul de la taille d’essaim
Isothiocyanate de poly-L-lysine fluorescéine (PLL-FITC)	Sigma Aldrich	P3069-10MG	30 000 - 70 000 MW PLL marqué avec FITC, utilisé pour le marquage par fluorescence CP solution
SecureSeal Espaceur d’imagerie à 8 puits	Grace Bio-Labs	654008	8 puits, 9 mm de diamètre, entretoise d’imagerie adhésive
Plaquette de silicium	University Wafer	590	Silicium 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &mu ; m SSP test
Spin Coater	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	Utilisé pour filer un 40-µ ; m couche de photorésine sur plaquette de silicium
SU-8 2025	MicroChem	2025	Photorésine négative pour fabriquer une plaquette maîtresse de silicium
SU-8 Développeur	MicroChem	Y020100	Photoresist. Retirer le SU-8 2025 non réticulé de la plaquette de silicium
Sylgard 184 (polydiméthylsiloxane, PDMS)	Dow	1673921	kit en 2 parties en élastomère de silicone pour la fabrication de microtampons et de puits PDMS Système de
masquage d’exposition UV	Kloé ;	UV-KUB 2	Utilisé pour la réticulation de la photorésine sur une plaquette de silicium à travers un masque chromé avec une lumière UV
Eau Thermo	Fisher Scientific	A1287303	Eau de haute qualité pour diluer les bioparticules
Zetag 8185	BASF	8185	Polyélectrolyte cationique (CP), poudre, copolymère d’acrylamide et de monomère cationique quaternisé, forme une « solution d’encrage » pour le micro-estampage lorsqu’il est dissous dans l’eau
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugué	Invitrogen	Z2843	Bioparticule poudre, dissous dans l’eau avant d’être ajouté au réseau Zetag