Article de méthode

Protocoles de bioimpression 3D de Gelatin Methacryloyl Hydrogel Bioinks

DOI :

10.3791/60545

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21 décembre 2019

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1State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 2Key Laboratory of 3D Printing Process and Equipment of Zhejiang Province, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 3School of Mechanics and Safety Engineering, Zhengzhou University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Présenté ici est une méthode pour la bioimpression 3D de la gélatine methacryloyl.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelatin methacryloyl (GelMA) est devenu un biomatériau populaire dans le domaine de la bioimpression. La dérivation de ce matériau est la gélatine, qui est hydrolysée à partir de collagène de mammifère. Ainsi, les séquences d'acide arginine-glycine-aspartique (RGD) et les motifs cibles de la matrice metalloproteinase (MMP) restent sur les chaînes moléculaires, qui aident à atteindre l'attachement cellulaire et la dégradation. En outre, les propriétés de formation de GelMA sont polyvalentes. Les groupes de methacrylamide permettent à un matériau de se croiser rapidement sous l'irradiation de la lumière en présence d'un photoinitiateur. Par conséquent, il est très logique d'établir des méthodes appropriées pour synthétiser les structures tridimensionnelles (3D) avec ce matériau prometteur. Cependant, sa faible viscosité limite l'imprimabilité de GelMA. Présentés ici sont des méthodes pour effectuer la bioimpression 3D des hydrogels GelMA, à savoir la fabrication de microsphères GelMA, fibres GelMA, structures complexes GelMA, et gelMA à base de puces microfluidiques. Les structures résultantes et la biocompatibilité des matériaux ainsi que les méthodes d'impression sont discutées. On croit que ce protocole peut servir de pont entre les biomatériaux précédemment appliqués et GelMA ainsi que de contribuer à l'établissement d'architectures 3D basées sur GelMA pour des applications biomédicales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrogels sont considérés comme un matériau approprié dans le domaine de la biofabrication1,2,3,4. Parmi eux, la gélatine methacryloyl (GelMA) est devenue l'un des biomatériaux les plus polyvalents, initialement proposé en 2000 par Van Den Bulcke et al.,5. GelMA est synthétisé par la réaction directe de la gélatine avec l'anhydride methacrylique (MA). La gélatine, qui est hydrolysée par le collagène de mammifère, est composée de motifs cibles de matrice de metalloproteinase (MMP). Ainsi, les modèles de tissus tridimensionnels in vitro (3D) établis par GelMA peuvent idéalement imiter les interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) in vivo. En outre, les séquences d'acide arginine-glycine-aspartique (RGD), qui sont absentes dans certains autres hydrogels tels que les alginates, restent sur les chaînes moléculaires de GelMA. Cela permet de réaliser l'attachement des cellules encapsulées à l'intérieur des réseaux hydrogel6. En outre, la capacité de formation de GelMA est prometteuse. Les groupes de methacrylamide sur les chaînes moléculaires de GelMA réagissent avec le photoinitiateur dans des conditions de réaction douces et forment des liaisons covalentes lors de l'exposition à l'irradiation légère. Par conséquent, les structures imprimées peuvent être rapidement reliées entre elles pour maintenir les formes conçues d'une manière simple.

Sur la base de ces propriétés, une série de champs utilisent GelMA pour effectuer diverses applications, telles que l'ingénierie tissulaire, l'analyse cytologique de base, le dépistage des médicaments et la biodétection. En conséquence, diverses stratégies de fabrication ont également été démontrées7,8,9,10,11,12,13,14. Cependant, il est encore difficile de réaliser la bioimpression 3D basée sur GelMA, qui est due à ses propriétés fondamentales. Le GelMA est un matériau sensible à la température. Pendant le processus d'impression, la température de l'atmosphère d'impression doit être strictement contrôlée afin de maintenir l'état physique du bioink. En outre, la viscosité de GelMA est généralement plus faible que d'autres hydrogels communs (c.-à-d., alginate, chitosan, acide hyaluronique, etc.). Cependant, d'autres obstacles sont rencontrés lors de la construction d'architectures 3D avec ce matériau15.

Cet article résume plusieurs approches pour la bioimpression 3D de GelMA proposée par notre laboratoire et décrit les échantillons imprimés (c.-à-d., la synthèse des microsphères GelMA, des fibres DeGelMA, des structures complexes GelMA et des puces microfluidiques à base de GelMA). Chaque méthode a des fonctions spécialisées et peut être adoptée dans des situations différentes avec des exigences différentes. Les microsphères GelMA sont générées par un module électro-assisté, qui forme une force électrique externe supplémentaire pour réduire la taille des gouttelettes. En termes de fibres GelMA, ils sont extrudés par une buse coaxiale bioimpression à l'aide d'alginate visqueux de sodium. En outre, l'établissement de structures 3D complexes est réalisé avec un bioimprimeur numérique de traitement de lumière (DLP). Enfin, une stratégie de liaison croisée à deux reprises est proposée pour construire des puces microfluidiques à base de GelMA, combinant l'hydrogel GelMA et les puces microfluidiques traditionnelles. On croit que ce protocole est un résumé significatif des stratégies de bioimpression GelMA utilisées dans notre laboratoire et peut inspirer d'autres chercheurs dans des domaines relatifs.

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Protocole

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1. Culture cellulaire

  1. Préparer le milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) et 1 % de pénicilline/streptomycine, utilisé pour la culture des lignées humaines de cellules cancéreuses du sein (MDA-MB-231) et des lignées de cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC).
  2. Préparer le DMEM avec de la L-glutamine (DMEM/F-12), complétée par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine, utilisée pour la culture des lignées de cellules souches mésenchymales de moelle osseuse (BMSC).
  3. Définir l'environnement de culture à 37 oC et 5 % de CO2. Culture MDA-MB-231, HUVEC, et BMSC, et passer les cellules dans un rapport 1:2 lorsque la confluence de 90% est atteint.

2. Fabrication de microsphères GelMA

  1. Imprimez l'appareil comme figure 1A avec de l'acide polylactique (APL) sur une imprimante de modélisation de dépôt fusionnée (FDM). Placez deux électrodes d'anneau en métal dans l'appareil.
  2. Connectez les deux électrodes d'anneau métallique avec le sol et les poteaux positifs, respectivement. Placez la plaque métallique reliée à la haute tension sous l'électrode de l'anneau et placez un plat Petri avec de l'huile de silicium sur la plaque métallique comme récepteur de gouttelettes.
  3. Dissoudre le GelMA lyophilisé (5 % w/v) et le phényl au lithium-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP, 0,5 % w/v) dans la saline tamponnée en phosphate (DPBS) de Dulbecco sous forme de bioink (10 mL). Filtrer le bioink à travers un filtre de 0,22 m pour la stérilité et le chauffer dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.
  4. Détachez les cellules MDA-MB-231 avec 3 ml de trypsine de 0,25 % à 0,02 % pour 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules dans un tube centrifugeur de 15 ml à 100 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.
  5. Retirez le supernatant. Mélanger le granule de cellules avec 1 ml de bioink préparé en le piétiner lentement pour empêcher la production de bulles.
  6. Placer 1 ml de bioink (MDA-MB-231) dans une seringue stérile de 3 ml. Nourrir le bioink par la force de l'air comprimé (0,5 kPa). Mettez la seringue sur l'appareil.
    REMARQUE : L'environnement d'impression doit être strictement contrôlé à une température de 30 oC et une humidité de 50 %.
  7. Allumez la puissance à haute tension et fixez la tension en tant que 0-4 kV. Simultanément, allumez la lumière de longueur d'onde de 405 nm pour croiser les gouttelettes de GelMA dans 5 ml d'huile de silicium.
  8. Verser la plus grande partie de l'huile de silicium en décantant le plat Petri. Transférer l'huile de silicium restante et les microsphères GelMA dans un tube centrifuge de 15 ml à l'aide d'une cuillère.
  9. Ajouter 5 ml de DPBS et secouer le mélange uniformément. Centrifuger le tube à 100 x g pendant 5 min et retirer le liquide supernatant.
  10. Répétez l'étape 2.9 3x.
  11. Sortez les microsphères GelMA avec une cuillère et faites-les la culture dans DMEM dans un plat Petri à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 3 jours.
  12. Jeter le milieu et laver les microsphères avec DPBS. Fixer avec 2 ml de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % pendant 30 min à température ambiante (RT).
  13. Jetez le PFA et lavez les microsphères avec DPBS. Perméabilize avec 2 ml de 0,5% de surfactant nonionic (c.-à-d., Triton X-100) pendant 5 min à RT.
  14. Jeter le surfactant nonionic et laver les microsphères avec DPBS. Tachez-les avec 2 ml de tétramethylrhodamine (TRITC) phalloïdin pendant 30 min dans l'obscurité à RT.
  15. Jeter le TRITC et laver les microsphères avec DPBS. Taisez-les avec 2 ml de 4-, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pendant 10 min dans l'obscurité à RT.
  16. Jetez le DAPI et lavez les microsphères avec DPBS. Capturez la morphologie à l'isation au microscope à fluorescence confocale.

3. Fabrication de fibres GelMA

  1. Préparer une buse coaxiale comme le montre la figure 2A. Fixer une buse intérieure (25 G, OD 510 m, ID et 250 m) et une buse extérieure (18 G, OD et 1200 m, ID 900 m) avec soudure. Connectez un tube de verre (longueur de 50 mm, diamètre intérieur de 1,2 mm) à l'extrémité de la buse coaxiale.
  2. Dissoudre la poudre d'alginate de sodium (Na-Alg) qui est stérilisée sous la lumière ultraviolette (UV) pendant 30 min dans l'eau déionisée à 2% (w/v).
  3. Préparer une solution stérile de bioink après l'étape 2.3. Chauffer le bioink GelMA et la solution Na-Alg dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.
  4. Détachez les cellules de BMSCs avec 3 ml de 0,25% trypsine-0,02% solution EDTA pendant 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules dans un tube centrifugeur de 15 ml à 100 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.
  5. Retirez le liquide supernatant. Mélanger le granule de cellules avec 2 ml de bioink GelMA préparé en le pipetting lentement pour empêcher la production de bulles.
  6. Placer 2 ml de bioink (BMSCs) dans une seringue de 10 ml. Placer 2 ml de solution Na-Alg dans une autre seringue (10 ml). Nourrissez-les avec deux pompes à seringues, respectivement (ici, bioink à 50 m/min et solution Na-Alg à 350 m/min).
    REMARQUE : L'environnement d'impression doit être strictement contrôlé à une température de 30 oC et une humidité de 50 %.
  7. Allumez la lumière de longueur d'onde de 405 nm pour irradier le tube transparent pour croiser les fibres de GelMA. Utilisez un plat Petri avec DPBS pour recevoir les fibres.
  8. Sortez les fibres GelMA avec une cuillère de DPBS et la culture pendant 3 jours dans le DMEM /F-12 préparé en 37 oC et 5% CO2.
  9. Suivez les étapes 2.12-2.16 pour préparer les fibres de GelMA pour l'observation morphologique avec un microscope à fluorescence confocale.

4. Fabrication de structures complexes 3D GelMA

REMARQUE : La figure 3A montre l'esquisse de fabrication des structures complexes 3D GelMA.

  1. Essuyez le bioimprimeur DLP (Figure 3E) avec 75% d'alcool et exposez-le à l'irradiation UV pendant 30 min pour la stérilité.
  2. Dissoudre le GelMA lyophilisé (10 % w/v) et le LAP (0,5 % w/v) dans DPBS. Ajouter le pigment comestible magenta dans la solution (3% v/v) pour améliorer la précision de l'impression.
  3. Filtrer la solution à l'intérieur d'un filtre de 0,22 m pour la stérilité et la chauffer dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.
  4. Construisez les modèles 3D avec un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD). Importer les documents du modèle au logiciel supérieur (EFL) du bioimprimeur DLP appliqué.
  5. Ajouter 10 ml de bioink préparé dans l'auge du bioimprimeur DLP.
  6. Définiz les paramètres d'impression dans le logiciel supérieur comme suit : intensité lumineuse de 12 mW/cm2,durée d'irradiation de 30 s, et hauteur de tranche de 100 m. Commencez à imprimer.
  7. Retirez la structure imprimée du bioimprimeur et plongez-la dans dPBS dans un plat Petri.
  8. Détachez les cellules MDA-MB-231s avec 3 ml de 0,25% trypsine-0,02% solution EDTA pendant 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules à 100 x g pendant 5 min dans un tube de 15 ml pour obtenir une pastille cellulaire.
  9. Retirer le liquide supernatant et mélanger la pastille cellulaire avec 2 ml de DMEM.
  10. Ajouter 100 l de suspension cellulaire sur les structures imprimées. Culture eux pendant 3 jours dans le DMEM préparé à 37 oC et 5% CO2.
  11. Suivez les étapes 2.12-2.16 pour préparer les structures 3D complexes pour l'observation morphologique avec un microscope à fluorescence confocale.

5. Fabrication de puces microfluidiques à base de GelMA

REMARQUE : La figure 4A montre l'esquisse de fabrication de la puce microfluidique à base de GelMA.

  1. Dissoudre le GelMA lyophilisé 10% (w/v) et LAP (0.5% w/v) dans DPBS. Filtrer la solution GelMA à l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 m pour la stérilité.
  2. Stérilisez la poudre de gélatine sous la lumière UV pendant 30 min et ajoutez-la à la solution GelMA-LAP préparée à l'étape 5.1 à une concentration finale de gélatine de 5 % (w/v). Chauffer le mélange dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.
  3. Concevoir un groupe de moules (Figure 4B,C) avec un logiciel CAO et les fabriquer avec de la résine photopolymère sur une imprimante DLP.
  4. Remplir les moules entièrement avec le bioink préparé.
  5. Mettre les moules dans un réfrigérateur de 4 oC pour croiser la gélatine pendant 30 min.
  6. Retirez les moules et démoulez avec une lame les feuilles d'hydrogel partiellement (physiquement) croisées des moules.
  7. Combinez les deux feuilles d'hydrogel désmolées et liez-les à l'aide de GelMA en irradiant à 405 nm pendant 1 min.
  8. Détachez les cellules HUVECs avec 3 ml de 0,25% trypsine-0,02% solution EDTA pendant 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules dans un tube centrifugede de 15 ml pour obtenir une pastille cellulaire à 100 x g pendant 5 min.
  9. Retirer le liquide supernatant et mélanger la pastille cellulaire avec 2 ml de DMEM.
  10. Remplissez complètement le microcanal en injectant la suspension cellulaire avec une buse et une seringue.
  11. Retournez la puce à l'envers toutes les 15 minutes pendant les 3 prochaines heures pour obtenir un ensemencement cellulaire uniforme et complet. Culture les croustilles dans le plat Petri pendant 3 jours dans le DMEM préparé à 37 oC et 5% CO2.
  12. Suivez les étapes 2.12-2.16 pour préparer les puces microfluidiques pour l'observation morphologique avec un microscope à fluorescence confocale.

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Résultats

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Lors de la fabrication des microsphères GelMA, les gouttelettes de GelMA ont été séparées par la force de champ électrique externe. Lorsque les gouttelettes sont tombées dans l'huile de silicium qui recevait, elles sont demeurées de forme sphéroïde standard sans queues. C'est parce que les gouttelettes GelMA étaient dans une phase aqueuse, tandis que l'huile de silicium était dans une phase d'huile. La tension de surface qui s'est formée entre les deux phases a causé les gouttelettes de GelMA pour maintenir une forme sph...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit plusieurs stratégies pour fabriquer des structures 3D de GelMA, à savoir des microsphères de GelMA, des fibres de GelMA, des structures complexes de GelMA, et des puces microfluidiques GelMA-basées. GelMA a une capacité prometteuse de biocompatibilité et de formation et est largement utilisé dans le domaine de la biofabrication. Les structures de microsphère conviennent à la libération contrôlée de drogue, à la culture de tissu, et à l'injection dans des organismes pour la thérapie plus loin

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été parrainé par le National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000), la National Nature Science Foundation of China (No.U1609207, 81827804), le Science Fund for Creative Research Groups of the National Natural Science Fondation de la Chine (No. 51821093).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 &mu ; Membrane filtranteMillipore
2-(4-amidinophényl)-6-chlorhydrate d’indolecarbamidine (DAPI)Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine
Bio-imprimante 3DSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
Lumière de longueur d’onde 405nmSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
buse coaxialeSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
Microscope confocal à fluorescenceOLYMPUS FV3000
bio-imprimanteSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
Imprimante DLPSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco avec L-glutamine (DMEM/F-12)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine
EFL SoftwareSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
Sérum fœtal bovin (FBS)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine
gélatineSigma-Aldrich, Shanghai, Chine
gélatine méthacryloyle (GelMA)SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
énergie haute tensionSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
phényl-2, 4, 6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP)SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine
paraformaldéhydeTangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine
pénicilline/streptomycineTangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine
alginate de sodium (Na-Alg)Sigma-Aldrich, Shanghai, Chine
TRITC phalloidinYeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine
Triton X-100Solarbio Co., Ltd., Shanghai, Chine
lithium

Références

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Mots-clés

Hydrogel de GelMABio impression 3DPr paration de bio encreFabrication assist e par lectro stimulationMicroscopie confocaleCulture cellulairePuces microfluidiquesFibres de GelMAMicrosph res de GelMABio imprimante DLP

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