Article de méthode

L’analyse de déplacement de la déformation mécanique myocardique (DIAMOND) révèle l’hétérogénéité segmentale de la fonction cardiaque chez le poisson zèbre embryonnaire

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DOI :

10.3791/60547

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6 février 2020

 , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles, 2Ronald Reagan UCLA Medical Center, 3Veterans Affairs West Los Angeles Medical Center

Dans cet article

Résumé

Le but de ce protocole est de détailler une nouvelle méthode pour l’évaluation de la fonction cardiaque segmentale chez le poisson zèbre embryonnaire dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Résumé

Les poissons zèbres sont de plus en plus utilisés comme organisme modèle pour les cardiomyopathies et la régénération. Les méthodes actuelles d’évaluation de la fonction cardiaque ne détectent pas de façon fiable la mécanique segmentaire et ne sont pas facilement réalisables chez les poissons zèbres. Nous présentons ici une méthode semi-automatisée et open source pour l’évaluation quantitative de la fonction cardiaque segmentaire en quatre dimensions (4D) : analyse de déplacement de la déformation mécanique myocardique (DIAMOND). Le poisson zèbre embryonnaire transgénique a été photographié in vivo à l’aide d’un système de microscopie à fluorescence par feuille de lumière avec synchronisation du mouvement cardiaque 4D. Les cœurs numériques 3D acquis ont été reconstruits à la fin-systole et au fin-diastole, et le ventricule a été segmenté manuellement en jeux de données binaires. Ensuite, le cœur a été réorienté et isotropically rééchantillonné le long du véritable axe court, et le ventricule a été divisé uniformément en huit parties (I-VIII) le long de l’axe court. En raison des différents plans et matrices de rééchantillonnage à la fin-systole et au diastole final, une matrice de transformation a été appliquée pour l’enregistrement d’image pour reconstituer la relation spatiale originale entre les matrices d’image systoliques et diastoliques rééchantillonnées. Après l’enregistrement de l’image, le vecteur de déplacement de chaque segment de la fin-systole au diastole final a été calculé en fonction du déplacement des centroïdes de masse en trois dimensions (3D). DIAMOND montre que les segments myocardiques basal adjacents au canal atrioventriculaire subissent la déformation mécanique la plus élevée et sont les plus sensibles aux lésions cardiaques induites par la doxorubicine. Dans l’ensemble, DIAMOND fournit de nouvelles perspectives sur la mécanique cardiaque segmentale dans les embryons de poissons zèbres au-delà de la fraction d’éjection traditionnelle (EF) dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

La toxicité cardiaque induite par la chimiothérapie et l’insuffisance cardiaque qui s’ensuit sont l’une des principales raisons de l’arrêt de la chimiothérapie1. Par conséquent, l’évaluation fonctionnelle cardiaque joue un rôle crucial dans l’identification de la toxicité cardiaque et, plus important encore, dans la prédiction des lésions cardiaques précoces après la chimiothérapie2. Cependant, les approches actuelles pour l’évaluation fonctionnelle cardiaque rencontrent des limitations. Des méthodes telles que la fraction d’éjection ventriculaire gauche (LVEF) ne fournissent que la mécanique cardiaque globale et souvent retardée après une blessure3,4. L’imagerie de Doppler tissu l’assure des informations segmentaires sur la déformation myocardique, mais souffre d’une variabilité intra-observateur et inter-observateur importante, en partie en raison de la dépendance à l’angle du faisceau d’ultrasons5. Le suivi bidimensionnel (2D) de la tache utilise le mode B de l’échocardiographie, qui élimine théoriquement la dépendance à l’angle, mais sa précision est limitée par le mouvement hors plan6. Par conséquent, une approche rigoureuse pour quantifier la fonction cardiaque segmentale fait défaut dans la recherche et les milieux cliniques.

Dans ce contexte, nous avons développé une méthode de quantification 4D pour l’analyse de la fonction cardiaque segmentale que nous avons appelée analyse de déplacement de la déformation mécanique myocardique (DIAMOND), afin de déterminer les vecteurs de déplacement des centroïdes de masse myocardiques dans l’espace 3D. Nous avons appliqué DIAMOND pour l’évaluation in vivo de la fonction cardiaque et de la toxicité cardiaque induite par la doxorubicine avec le poisson zèbre (Danio rerio) comme modèle animal, choisi en raison de leur myocarde régénératrice et de leurs gènes développementaux hautement conservés7. Nous avons en outre comparé le déplacement segmentaire de DIAMOND avec la détermination globale de fraction d’éjection (EF) et la souche 2D suivant le traitement de doxorubicine. En intégrant le déplacement DE DIAMOND à la microscopie fluorescente en feuille de lumière 4D (LSFM) acquise en matière de cœurs de poissons zèbres embryonnaires, DIAMOND montre que les segments myocardiques basaux adjacents au canal atrioventriculaire subissent la déformation mécanique la plus élevée et sont les plus sensibles aux lésions cardiaques de la doxorubicine aigue8.

   

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UCLA (IACUC), et des expériences ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Bureau de recherche sur les animaux de l’UCLA.

1. Élevage de poissons zèbres Tg(cmlc2:mCherry) et de la collecte d’embryons

  1. Suivez les procédures de logement, d’élevage et de collecte d’embryons telles que décrites dans les pratiques d’élevage et d’élevage précédemment établies. Pour plus de détails, voir Messerschmidt et coll.9.
  2. Traiter les embryons recueillis avec 0,003% 1-phényl-2-thiourea (PTU) dans E3 moyenne 18 h postfertilization pour maintenir la transparence des embryons pour l’imagerie LSFM.

2. Traitement de la doxorubicine pour induire des lésions cardiaques

  1. À 3 jours de postfertilisation (dpf), traiter les embryons avec de la doxorubicine à une concentration de 10 M dans le milieu de l’eau de poisson E3. Après un traitement de 24 h à 4 dpf, remplacer le milieu de doxorubicine par un milieu E3 frais.
    CAUTION: La doxorubicine est un médicament de chimiothérapie. Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié est nécessaire et les déchets doivent être éliminés dans des contenants de déchets biorisques.

3. Modulation de voie d’entaille

  1. Traiter les embryons de poisson zèbre avec l’inhibiteur de la voie Notch (2S)-N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine 1,1-dimethylethyl ester (DAPT) à une concentration de 10 M dans le milieu d’eau de poisson E3 à partir de 3-6 dpf.
  2. Microinjectez les effecteurs en aval Notch Notch domaine intracellulaire (NICD) et Neuregulin-1 (Nrg-1) ARNm à des concentrations de 10 pg/nL et 5 pg/nL, respectivement, dans les embryons de poisson zèbre stade 1 cellule8,10.
    REMARQUE : La microinjection est effectuée au microscope avec le soutien d’une pompe à air pour contrôler avec précision le volume injecté. La microinjection d’ARNm dans la cellule se fait lorsque l’ovule fécondé est au premier stade cellulaire. Pour plus de détails sur la préparation et la séquence des ARNM, voir Chen et coll.8. Pour plus de détails sur la microinjection et la préparation des aiguilles d’injection, voir Rosen et coll.10.

4. Imagerie LSFM et synchronisation post-imagerie

  1. Pour les techniques d’imagerie LSFM et l’algorithme de synchronisation post-imagerie, voir les détails dans les publications précédentes9,11.
    REMARQUE : En bref, notre système utilise un laser à ondes continues comme source d’éclairage pour imager toutes les lignes transgéniques de poisson zèbre. Le module de détection est composé de deux caméras scientifiques complémentaires de semi-conducteurs à oxyde métallique (sCMOS) et de deux ensembles de filtres pour l’imagerie bicanal. Le module de détection est impuriculairement installé sur le plan d’éclairage. Chaque cadre LSFM est acquis dans un délai d’exposition de 20 msec, tandis que la puissance de résolution en section transversale est de 0,65 m et la taille de l’étape entre les images consécutives est de 2 m. Un laser de 589 nm a été utilisé pour exciter les signaux fluorescents mCherry.

5. Reconstruction du cœur systolique et diastolique 3D

  1. Ouvrez le dossier créé par l’algorithme de synchronisation post, puis ouvrez le dossier "Sortie". Sélectionnez le plan du milieu du cœur et chargez le dossier entier dans ImageJ. Trouvez la première phase diastolique et systolique et enregistrez le numéro d’image.
  2. Ouvrez le dossier "Sortie/par état" et trouvez les dossiers qui ont les mêmes numéros que les numéros d’image qui viennent d’être enregistrés. Convertissez les images du dossier en fichiers 3D TIFF (format de fichier d’image étiqueté) et nommez-les "diastole.tif" et "systole.tif".

6. Segmentation du ventricule

  1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux). Cliquer sur Le Fichier Données ouvertes, et charger "diastole.tif" et "systole.tif". Entrez la taille du voxel en fonction des paramètres d’imagerie.
    REMARQUE : Pour le système LSFM utilisé, la taille typique du voxel est de 0,65 m x 0,65 m x 2 m.
  2. Cliquez sur le panneau «SEGMENTATION» et segmentez manuellement la partie ventriculaire du cœur. L’outil intégré «Seuil» qui peut sélectionner toutes les régions au-dessus d’une certaine intensité peut faciliter ce processus. Le ventricule est la chambre plus épaisse avec une fluorescence plus forte.
    REMARQUE : Assurez-vous d’enlever le canal atrioventriculaire et le tractus sortant dans le ventricule segmenté, car cela affecte l’analyse de déplacement.
  3. Une fois la segmentation terminée, cliquez sur le panneau «Projet». Cliquez à droite sur lediastole. Labels.tif" et "systole. Labels.tif" onglets dans la console et cliquez sur "Export Data as" pour enregistrer les données que les fichiers TIFF 3D.

7. Création de parallélépipèdes rectangulaires pour l’enregistrement d’images

  1. Exécuter "prepImage_1.m" dans l’environnement de programmation (voir Tableau des matériaux). Ouvrez "prepImage_1.m", "ImPath" en ligne 5 afin que le dossier contienne les fichiers TIFF originaux et segmentés, et changez "tranche" en ligne 4 au nombre de tranches des fichiers tif 3D.
  2. Après l’exécution du code, il générera cinq nouveaux fichiers TIFF 3D ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif", et "sysLabel200.tif") ainsi que deux nouveaux dossiers ("resample_dia" et "resample_sys").

8. Rééchantillonner les coeurs 3D systoliques et diastoliques le long du plan à axe court

  1. Importer les cinq fichiers TIFF 3D dans le logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : La taille du voxel est inchangée.
  2. Rendez-vous sur le panneau MULTIPLANAR. Choisissez "diastole_200.tif" comme données primaires. Alignez l’axe X (la ligne verte du plan XY) avec l’axe vertical long du ventricule, et alignez l’axe Z (la ligne rouge dans le plan YZ) avec l’axe horizontal long du ventricule.
    REMARQUE : L’axe vertical long est déterminé en trouvant l’axe le plus long reliant l’apex et le tractus sortant dans le plan XY, et l’axe horizontal long est déterminé en trouvant l’axe le plus long reliant l’apex et le tractus sortant dans le plan YZ. Faites pivoter l’axe en plaçant le curseur à l’extrémité de l’axe.
  3. Choisissez trois points aléatoires à partir du plan YZ oblique (le plan à axe court) dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et enregistrez leurs coordonnées de position 3D.
    REMARQUE : Assurez-vous que les points sont choisis dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
  4. Répétez les étapes 8.2 et 8.3 pour "systole_200.tif".
  5. Cliquez sur le panneau "PROJECT". Créez un objet "Slice" pour "diastole_200.tif" en cliquant à droite sur "diastole_200.tif" et en recherchant "Slice" objet. Cliquez à gauche sur l’objet Slice qui vient d’être créé, et dans le panneau Propriétés Options, vérifier "Set Plane" et choisir trois points dans "Plane Definition". Entrez les coordonnées des trois points à partir de l’étape 7.3.
  6. Répétez l’étape 8.5 pour "systole_200.tif".
    REMARQUE: L’objet de tranche créé doit avoir le nom "Slice 2".
  7. Cliquez à droite sur "diastole_200.tif" et recherchez "Resample Transformed Image" et créez l’objet. Dans le panneau Propriétés, choisissez "Slice" comme "Référence" et cliquez sur Appliquer. Cela devrait générer un objet nommé "diastole_200.transformé".
  8. Cliquez à droite "diastole_200.transformé" et recherchez "Resample" et créez l’objet. Choisissez "Voxel Size" comme le "Mode" et changez "Voxel Size" pour être x 1, y et 1, et z 1 dans le panneau Propriétés.
  9. Cliquez sur "Appliquer". Cela devrait générer un objet nommé "diastole_200.resampled". Cliquez à droite "diastole_200.resampled" et enregistrez-le sous forme de fichier TIFF 3D.
  10. Répétez la même étape pour "diaLabel.tif" et "test.tif". Enregistrer "diaLabel.resampled" et "test.resampled" comme fichiers TIFF 3D. Répétez la même étape pour "systole_200.tif", "sysLabel.tif", et "test.tif" en utilisant "Slice 2" comme référence, et enregistrez "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", et "test2.resampled" comme fichiers TIFF 3D.
    REMARQUE : Assurez-vous qu’il y a un total de six fichiers TIFF enregistrés dans cette étape.

9. Division du cœur rééchantillonné

  1. Importer les six fichiers rééchantillonnés de l’étape 8 à ImageJ. Sélectionnez une tranche de "systole_200.resampled" dans laquelle le canal atrioventriculaire est clairement visualisé. Enregistrez le nombre de la tranche.
    1. Utilisez l’image " Transformer Rotation" fonction de ImageJ de sorte que le canal atrioventriculaire est vertical. Appliquez la même rotation à tous les fichiers. Fermez toutes les fenêtres et enregistrez tous les changements.
    2. Déplacer "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled", et "test.resampled" to the "resample_dia" folder, et déplacer "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", et "test2.resampled" to the "resample_sys" folder.
  2. Ouvert "divider_2_8_pieces.m". Changement "ImPath" dans la ligne 5 et "ImPath" dans la ligne 395 au répertoire d’image. Changer la variable "Moyen" dans la ligne 22 et la ligne 411 pour les nombres de tranches où le canal atrioventriculaire est clairement visualisé en " systole_200.resampled" et "diastole_200.resampled".
  3. Exécutez le code, et dans les fenêtres incitées cliquez une fois au centre du ventricule et cliquez une fois au centre du canal atrioventriculaire. Cela doit être fait deux fois pour les images systole et diastole.

10. Enregistrement des matrices d’images systoliques et diastoliques

  1. Ouvrez "register_3.m" et changez "ImPath" dans la ligne 4 sur le chemin du dossier d’image. Il peut prendre 5 à 20 minutes pour exécuter ce code en fonction de la puissance de calcul du système.
    REMARQUE : Les parallélépipèdes rectangulaires créés artificiellement à l’étape 7 sont utilisés pour l’enregistrement rigide en 3D qui préserve la distance entre deux points et les angles souscrits par trois points. Lorsque le parepiped rectangulaire fin-diastole (rouge) est enregistré au paraléphat rectangulaire fin-systole (vert), l’emplacement 3D discrepant qui s’ensuit permet la dérivation d’une matrice unique de transformation rigide consistant en rotation et traduction de la matrice de la tordeur à la matrice de fin-systole (Figure 1H). Nous effectuons l’enregistrement et la minimisation de l’énergie pour débruitner la matrice après la transformation à l’aide d’une boîte à outils de traitement d’image (voir Tableau des matériaux). Pour une description mathématique détaillée, veuillez consulter Chen et coll.8.

11. Sortie des vecteurs de déplacement

  1. Ouvrez "displacement_4.m" et changez "ImPath" dans la ligne 4 sur le chemin du dossier d’image.
  2. Exécutez "displacement_4.m", qui génère un fichier " vector8.txt " dans le dossier " vecteurs ". Une fois que le fichier "vector8.txt" est ouvert, il y aura une matrice 8 x 4. Chaque rangée de la matrice a quatre nombres, qui sont les magnitudes de la composante X, composant Y, composant Z, et l’ampleur SUM du vecteur de déplacement d’un segment spécifique du ventricule.
    REMARQUE : Le vecteur de déplacement est obtenu en calculant le déplacement du centroïde de masse de chaque segment dans l’espace 3D. Nous calculons les coordonnées de centroïde de figure-protocol-1 masse 3D (PS et PD)(où k indique la coordonnées X, Y ou Z, respectivement) de chaque segment (I-VI) dans le jeu de données de segmentation de systole à diastole (Figure 1J). Nous définissons le figure-protocol-2 centroïde de masse dans l’espace 3D comme suit :
    figure-protocol-3
    où Cx x, Cy , Y, Y, et Cz, Z, Mi - la masse de chaque segment (I i 'VI), m - le nombre de voxels de chaque segment, et la fonction de densité comme la région segmentée est de 1 alors que le reste est de 0. La norme L2 des vecteurs de sous-déplacement le long des axes X, Y et Z et le vecteur de déplacement de somme sont calculés pendant le cycle cardiaque. Il y a un total de huit lignes dans la matrice. La première rangée et la huitième rangée contiennent le canal atrioventriculaire et sont donc ignorées dans notre analyse. Les segments I à VI sont représentés par la deuxième rangée à la septième rangée.

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Résultats

Le processus par lequel DIAMOND a été développé pour évaluer la fonction cardiaque segmentaire 3D est présenté à la figure 1. Après l’acquisition et la reconstruction d’images LSFM en 3D du cœur embryonnaire de poisson zèbre (Figure 1A), le véritable plan à axe court a été déterminé comme le plan perpendiculaire aux axes longs verticaux et horizontaux, qui sont tous deux déterminés dans un visualiseur multiplan (Figure 1

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Discussion

Une stratégie rigoureuse pour quantifier la fonction myocardique segmentaire est essentielle pour évaluer la mécanique cardiaque au-delà de l’EF traditionnel, connu pour être un indicateur insensible et retardé de la lésion myocardique1,4,12. Par conséquent, il y a eu un intérêt croissant dans des marqueurs des changements myocardiques tôt, et un corps croissant de littérature soutient des paramètres de déformation myocardique c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Les travaux actuels ont été financés par les subventions de l’American Heart Association 16SDG30910007 et 18CDA34110338, et par les subventions HL083015, HL111437, HL118650 et HL129727.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Amira6FEILogiciel d’analyse d’images
DAPTMillipore SigmaD5942-5MG
Chlorhydrate de doxorubicineMillipore SigmaD1515-10MG
Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonateMillipore SigmaE10521-10GTricaïne
MATLABMathWorksEnvironnement de programmation
Boîte à outils de traitement d’images MATLAB Boîte à outilstraitement d’imagesMathWorks
de

Références

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Mots-clés

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