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Article de méthode

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

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DOI :

10.3791/60551

⸱

28 novembre 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología y Desarrollo Celular, Instituto Nacional de Perinatología, 2Biotecnología Médica y Farmacéutica CONACYT, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), 3Departamento de Inmunobioquímica, Instituto Nacional de Perinatología, 4Instituto de Neurobiología, UNAM

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l'isolement des cellules épithéliales de différentes régions anatomiques de la membrane amniotique humaine pour déterminer leur hétérogénéité et leurs propriétés fonctionnelles pour l'application possible dans les modèles cliniques et physiopathologiques.

Résumé

Plusieurs protocoles ont été rapportés dans la littérature pour l'isolement et la culture des cellules épithéliales amniotiques humaines (HAEC). Cependant, ceux-ci supposent que l'épithélium amniotique est une couche homogène. L'amnion humain peut être divisé en trois régions anatomiques : réfléchie, placentaire et ombilicale. Chaque région a des rôles physiologiques différents, tels que dans des conditions pathologiques. Ici, nous décrivons un protocole pour disséquer le tissu humain d'amnion dans trois sections et le maintenir in vitro. Dans la culture, les cellules dérivées de l'amnion réfléchi ont montré une morphologie cuboïde, alors que les cellules des régions placentaires et ombilicales étaient squamous. Néanmoins, toutes les cellules obtenues ont un phénotype épithélial, démontré par l'immunodétection de l'E-cadherin. Ainsi, étant donné que les régions placentales et réfléchies in situ diffèrent dans les composants cellulaires et les fonctions moléculaires, il peut être nécessaire que les études in vitro tiennent compte de ces différences, car elles pourraient avoir des implications physiologiques pour l'utilisation de l'AOHC dans biomédecine et l'application prometteuse de ces cellules en médecine régénérative.

Introduction

Les cellules d'épithélium amniotique humaine (HAEC) proviennent des premiers stades du développement embryonnaire, à environ huit jours de postfertilisation. Ils proviennent d'une population de cellules épithéliales squameuses de l'épiblaste qui dérivent de la couche la plus interne de la membrane amniotique1. Ainsi, HAEC sont considérés comme des restes de cellules pluripotentes de l'épiblaste qui ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales de l'embryon2. Au cours de la dernière décennie, divers groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour isoler ces cellules de la membrane amniotique à la période de gestation afin de caractériser leurs propriétés présomptives liées à la pluripotence dans un modèle culturel in vitro3,4.

En conséquence, il a été constaté que HAEC caractéristiques caractéristiques des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC), tels que les antigènes de surface SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; le noyau des facteurs de transcription de pluripotence OCT4, SOX2, et NANOG ; et le marqueur de prolifération KI67, suggérant qu'ils sont auto-renouvellement5,6,7. En outre, ces cellules ont été contestées en utilisant des protocoles de différenciation pour obtenir des cellules positives pour les marqueurs spécifiques à la lignée des trois couches germinales (ectoderm, mesoderm et endoderm)4,5,8, ainsi que dans les modèles animaux des maladies humaines. Enfin, HAEC exprime E-cadherin, qui démontrent qu'ils conservent une nature épithéliale un peu comme le HPSC5,9.

En dehors de leur origine embryonnaire, HAEC ont d'autres propriétés intrinsèques qui les rendent adaptés à différentes applications cliniques, telles que la sécrétion de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes10,11, facteurs de croissance et la libération de cytokine12, aucune formation de tératomes quand ils sont transplantés dans des souris immunodéficientes en contraste avec HPSC2, et la tolérance immunologique parce qu'ils expriment HLA-G, qui diminue le risque de rejet après transplantation13.

Cependant, les rapports précédents ont supposé que l'amnion humain est une membrane homogène, sans considérer qu'il peut être anatomiquement et physiologiquement divisé en trois régions : placentaire (l'amnion qui couvre le basalis de cidua),ombilical (la partie qui enveloppe le cordon ombilical), et réfléchi (le reste de la membrane non attachée au placenta)14. Il a été démontré que les régions placentales et réfléchies de l'amnion présentent des différences dans la morphologie, l'activité mitochondriale, la détection des espèces réactives d'oxygène15, l'expression miRNA16, et l'activation des voies de signalisation17. Ces résultats suggèrent que l'amnion humain est intégré par une population hétérogène avec des fonctionnalités différentes qui devraient être considérées pour d'autres études menées dans des modèles in situ ou in vitro. Alors que d'autres laboratoires ont conçu des protocoles pour l'isolement de HAEC de toute la membrane, notre laboratoire a établi un protocole pour isoler, culturer et caractériser les cellules de différentes régions anatomiques.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de l'Instituto Nacional de Perinatologa à Mexico (numéro d'enregistrement 212250-21041). Toutes les procédures effectuées dans le cours de ces études étaient conformes aux normes éthiques de l'Instituto Nacional de Perinatologa, de la Déclaration d'Helsinki et des lignes directrices énoncées dans la Norme officielle mexicaine du ministère de la Santé.

1. Préparation

  1. Préparer une solution de 1x PBS avec EDTA. Pour ce faire, ajouter 500 oL de 0,5 M de stock EDTA dans 500 ml de 1x PBS pour une concentration finale de 0,5 mM EDTA.
  2. Préparer le milieu de culture pour HAEC. Prendre 450 ml de glucose-DMEM élevé, le compléter avec 5 ml de pyruvate de sodium (100 mM), 50 ml de sérum bovin fœtal inactif qualifié pour les cellules souches, 5 mL d'acides aminés non essentiels (100x), 5 mL d'antibiotique-antimycotique (100x), 5 mL de L-glutamine (200 mM), et 500 l de mercaptoéthanol (1 000x).
  3. Stériliser les conteneurs pour le transport et le traitement du tissu: un récipient en acier inoxydable avec un couvercle pour transporter l'ensemble du placenta de la salle d'opération au laboratoire, un plateau (20 cm x 30 cm x 8 cm) pour laver et enlever le sang de l'ensemble du placenta avant la dissection de la membrane amniotique, et une planche à découper en plastique pour séparer la membrane amniotique dans les trois régions.
  4. Stériliser les instruments chirurgicaux (scalpels, ciseaux, forceps et pinces), les béchers de 500 ml, les gazes de coton et la solution saline.

2. Obtenir le tissu placentaire

REMARQUE : Les membranes amniotiques ont été obtenues des femmes à la gestation à terme (37-40 semaines), sous l'indication de l'accouchement césarienne, sans aucune évidence du travail actif, et aucune caractéristique microbiologique de l'infection. Les procédures complètes d'isolement et de culture ont été effectuées au sein d'un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles.

  1. Dans la salle d'opération, serrer le cordon ombilical pour empêcher le flux sanguin vers le reste du tissu. Recueillir le placenta entier avec le cordon ombilical serré dans le récipient stérile.
  2. Ajouter 500 ml de solution saline au récipient pour hydrater le placenta.
  3. Fermer le contenant et transporter le tissu au laboratoire à température ambiante.
  4. Placez le récipient avec le placenta à l'intérieur de l'armoire de biosécurité.
    REMARQUE : Dans le cas où la dissection n'est pas effectuée dans les 15 minutes suivant la collecte du placenta, entreposez le contenant avec le placenta sur la glace jusqu'au traitement. Évitez plus de 1 h de temps écoulé entre l'obtention du placenta et le début de la dissection.

3. Séparation mécanique par région de la membrane amniotique

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles et à température ambiante.

  1. Retirer le placenta entier du récipient et le placer sur le plateau avec le cordon ombilical orienté vers le haut.
  2. À l'aide d'une gaze de coton stérile, nettoyer les caillots sanguins de la surface du chorion-amnion qui recouvre le placenta.
  3. Identifier les trois régions de la membrane : l'amnion ombilical enveloppant le cordon ombilical, l'amnion placentaire recouvrant la décidua basalis, et la région réfléchie, qui est le reste de l'amnion qui n'est pas attaché au placenta (Figure 1).
  4. Disséquer la région de l'amnion ombilical (figure 2A).
    1. À l'aide de forceps disséquants, maintenez la partie de la membrane amnion qui recouvre la jonction du placenta et du cordon ombilical.
    2. À l'effile, disséquer la région qui entoure le cordon tout en s'étirant pour le séparer du chorion.
    3. Déposer le tissu séparé dans un bécher étiqueté avec 100 ml de solution saline.
  5. Disséquer la région de l'amnion placentaire (figure 2B).
    1. À l'effigie de coton stérile, retirer les caillots sanguins de la surface du chorion-amnion qui recouvre le placenta.
    2. Maintenez la membrane sur la bordure entre le placenta et la région réfléchie avec des forceps disséquants.
    3. Couper le long de la circonférence du placenta avec le scalpel.
    4. Séparer l'amnion placentaire du chorion, en prenant soin de ne pas couper les navires du placenta.
    5. Placer le tissu séparé dans un autre bécher étiqueté avec 300 ml de solution saline.
  6. Séparer le reste de la membrane amniotique qui n'est pas attaché au placenta (c.-à-d. la partie réfléchie) du chorion (figure 2C).
    1. Recueillir la région réfléchie dans un autre bécher étiqueté avec 300 ml de solution saline.
      REMARQUE : Ajoutez la solution saline continuellement pendant la dissection pour empêcher le tissu de sécher.

4. Laver les membranes

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles à température ambiante.

  1. Jeter la solution saline de chaque région membranaire séparément.
  2. Ajouter 100 ml de solution saline fraîche à la région ombilicale.
  3. Ajouter 300 ml de solution saline fraîche aux régions placentaires et réfléchies respectivement.
  4. Remuer les membranes à l'aide de la disséquer les forceps pour enlever les résidus sanguins.
  5. Jetez la solution saline.
  6. Répétez les lavages et l'agitation au moins 3x jusqu'à ce que les membranes soient translucides.
  7. Placez et étendez les membranes sur la planche pour nettoyer à l'œil stérile les caillots de sang qui n'ont pas été enlevés avec les lavages.
    REMARQUE : Il est très important d'enlever autant d'érythrocytes que possible, car leur présence affecte la fonction de trypsine et la viabilité des cultures cellulaires suivantes.

5. Digestion enzymatique des membranes de différentes régions

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles.

  1. Couper les régions réfléchies et placentales en deux ou trois fragments.
  2. Ne coupez pas la région ombilicale.
  3. Placer les fragments de chaque région dans des tubes de centrifugeuse. Ajouter 20 mL de trypsine/EDTA de 0,5 % aux régions réfléchies et placentales et 5 ml de 0,5 % de trypsine/EDTA à la région ombilicale, respectivement.
    REMARQUE : Il est important de couper les régions réfléchies et placentales en petits morceaux parce qu'elles doivent être complètement immergées dans la solution de trypsine.
  4. Agiter légèrement les tubes de centrifugeuse pendant 30 s. Jeter la trypsine.
  5. Ajoutez 30 mL de nouvelle trypsine/EDTA de 0,5 % aux régions réfléchies et placentales et 15 ml de nouvelle trypsine/EDTA de 0,5 % à la région ombilicale, respectivement.
  6. Placer les tubes dans un rotateur à l'intérieur de l'incubateur.
  7. Incuber à la rotation (20 tr/min) pendant 40 min à 37 oC.
    REMARQUE : Si un rotateur de tube n'est pas disponible, secouez les tubes manuellement toutes les 10 minutes.
  8. Transférer les solutions trypsine/cellule de chaque région dans de nouveaux tubes de centrifugeuse.
  9. Ajouter 2 fois le volume de la maréchette haeC préréchauffé à 37 oC par tube pour inactiver l'enzyme.
  10. Conserver la première digestion sur la glace.
  11. Répétez les étapes 5.6-5.8 pour une deuxième période de digestion.
  12. Pour chaque région, tenir une extrémité de la partie amnion à l'aide de forceps disséquants, et avec une autre paire presser le long du tissu pour enlever les rangées de cellules épithéliales qui n'ont pas complètement décoller au cours des périodes d'incubation précédentes.
  13. Recueillir la deuxième digestion dans un autre ensemble de tubes centrifugeurs et inactiver avec 2x le volume de médias HAEC.
  14. Jeter les membranes digérées dans un récipient de biorisque.

6. Isolement de l'ACI

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles.

  1. Centrifugetous les tubes à 200 x g pendant 10 min à 4 oC.
  2. Jeter le supernatant et ajouter 10 ml de support HAEC préchauffé (à 37 oC) par tube et pipet doucement pour désagréger chaque granule.
  3. Combiner les suspensions cellulaires des deux digestions dans un tube individuel pour chaque région membranaire.
  4. Filtrer les suspensions cellulaires à l'aide de passoires cellulaires de 100 m pour enlever les débris de matrice extracellulaire et obtenir des cellules uniques.
  5. Préparer trois aliquots avec 90 oL de bleu trypan dans un tube de microcentrifuge.
  6. Ajouter 10 L de chaque suspension cellulaire par région membranaire dans les tubes de microcentrifuge et mélanger.
  7. Comptez les cellules avec un hémocytomètre sous un microscope de champ léger.

7. Culture de HAEC

  1. Ensemencer le HAEC des trois régions séparément à une densité de 3 à 104 cellules/cm2 avec des supports HAEC préchauffés, complétés par 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain (EGF).
    1. Ensemencez les cellules dans des plaques de 100 mm pour les maintenir in vitro ou dans 24 plaques de puits pour l'analyse immunochimique.
  2. Incuber les plats à 37 oC dans des conditions normoxiques (5 % de CO2) dans un incubateur humidifié.
  3. Ajouter eGF tous les jours et changer le médium tous les trois jours.
    REMARQUE : Les cellules deviendront confluentes après 4 à 6 jours.
  4. Utilisez les cellules pour l'immunohistochimie conventionnelle, l'analyse du tri cellulaire, la cryoconservation, l'extraction de l'ARN et des protéines, ou pour poursuivre le passage.

8. Passage de HAEC

  1. Retirez le support HAEC et lavez 2x avec la solution PBS/EDTA 0.01M.
  2. Incuber avec une solution PBS/EDTA 0,01M pendant 15 min à 37 oC.
  3. Retirez le PBS/EDTA et ajoutez 1,5 ml de trypsine/EDTA de 0,5 %.
  4. Incuber de 5 à 8 min à 37 oC.
  5. Inactiver l'enzyme avec deux volumes de médias HAEC.
  6. Recueillir la solution mixte et la centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
  7. Comptez les cellules et continuez avec les passages suivants ou utilisez les cellules pour une analyse plus approfondie.

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Résultats

HAEC ont été isolés de chacune des trois régions anatomiques de la membrane amniotique et individuellement cultivés in vitro. Après 48 h de culture, les cellules avec un phénotype épithélial ont adhéré à la surface de la plaque, bien que le milieu ait également contenu des débris de cellules et des cellules flottantes, qui ont été enlevés une fois que le milieu a été changé (figure 3).

Pendant le traitement de la culture primaire (passage zéro, P0), certaines comp...

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Discussion

Nous avons mis en œuvre un nouveau protocole pour isoler HAEC des membranes à terme. Il diffère des rapports précédents en ce que chaque membrane a été divisée en ses trois régions anatomiques avant l'isolement pour analyser des cellules de chacun.

Une des étapes les plus critiques dans le protocole est le lavage de la membrane pour enlever tous les caillots sanguins, car ils peuvent interférer avec l'activité de la trypsine lors de la séparation des cellules épithéliales. Le défaut d'exécuter...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nos recherches ont été soutenues par des subventions de l'Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 et 21081) et du CONACYT (A1-S-8450 et 252756). Nous remercions Jessica Gonzalez Norris et Lidia Yuriria Paredes Vivas pour le soutien technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
culture forts
2-MercaptoéthanolThermo Fisher Scientific/Gibco 2198502355 mM
Exempt d’animaux Recombinant humain EGFPeprotechAF-100-15
Antibiotique-antimycotiqueThermo Fisher Scientific/Gibco15240062100X
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific/Gibco12430054Supplémenté en glucose élevé et HEPES
EDTAThermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G0,5 M
Cellule souche embryonnaire FBS, qualifiéeThermo Fisher Scientific/Gibco10439024
Acides aminés non essentielsThermo Fisher Scientific/Gibco11140050100X
Paraformaldéhyden’importe quelle marque
de pyruvate de sodiumThermo Fisher Scientific/Gibco11360070100 mM
de trypsine/EDTA 0,05 %Thermo Fisher Scientific/Gibco25300054
Matériel jetable
100 & micro ; m Filtre à cellulesCorning/Falcon352360
100 mm Plat de culture traité TCCorning430167
24 puits Transparent traité TC Plaques à puits multiplesCorning/Costar3526
Plaques à puits multiples traitées TC à 6 puits clairsCorning/Costar3516
Tube à centrifuger stérile non pyrogènede toute marqueavec cône fond
Pointes stériles non apyrogènes de 1 000 & micro ; l, 200 et micro ; l et 10 µ ;l.
Gazes de coton stériles
de toute marque
Équipement
Armoire
Micropipettes
Pipette motorisée Remplisseuse/Distributrice
Béchers stériles de 500 mL
Planche
Scalpels, ciseaux, pinces, pinces stériles
Récipient
plateau
MaCSmix
Anticorps et kitsAntibody ID
Anti-E-cadhérineBD Biosciences 610181RRID :AB_3975
Anti-KI67Santa Cruz23900RRID :AB_627859)
Anti-NANOGPeprotech500-P236RRID :AB_1268274
Anti-OCT4AbcamAB19857RRID :AB_44517
Anti-SOX2MilliporeAB5603RRID :AB_2286686
Signalisation cellulaireanti-SSEA-44755RRID :AB_1264259
Signalisation cellulaireanti-TRA-1-604746RRID :AB_2119059
Chèvre Anti-souris Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11029RRID :AB_2534088
Chèvre Anti-Lapin Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11036RRID :AB_10563566
Tunel Kit de dosageAbcam66110
de solution saline tamponnée au phosphate Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X (chlorure de sodium 0,9 %)n’importe quelle marque Pipettes sérologiques stériles de 5, 10 et 25 mL de toute marque Gants chirurgicaux stériles de sécurité biologique Centrifugeuse de pipettesà découper en plastique stérile stérile en acier inoxydableRotateur de tube à stérile

Références

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