Article de méthode

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

DOI :

10.3791/60571

⸱

18 janvier 2020

 ,  , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Présenté ici est un protocole pour la génération d'une culture unicellulaire des cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales. Le protocole est simple, robuste, évolutif et adapté aux applications de dépistage des médicaments et de médecine régénérative.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires humaines (HESC) a transformé la capacité d'étudier le développement humain à la fois aux niveaux biologique et moléculaire et a fourni des cellules pour une utilisation dans des applications régénératrices. Les approches standard pour la culture hESC utilisant la culture de type colonie pour maintenir les HESC indifférenciés et le corps embryonnaire (EB) et la formation de rosette pour la différenciation en différentes couches germinales sont inefficaces et prennent du temps. Présenté ici est une méthode de culture unicellulaire en utilisant hESCs au lieu d'une culture de type colonie. Cette méthode permet le maintien des caractéristiques des HESC indifférenciés, y compris l'expression de marqueurs hESC à des niveaux comparables aux HESC de type colonie. En outre, le protocole présente une méthode efficace pour la génération de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de hESCs de type unicellulaire qui produit des PNJ dans un délai de 1 semaine. Ces cellules expriment fortement plusieurs gènes de marqueur de PNJ et peuvent se différencier en divers types de cellules neurales, y compris les neurones dopaminergiques et les astrocytes. Ce système de culture unicellulaire pour les HESC sera utile pour étudier les mécanismes moléculaires de ces processus, les études de certaines maladies et les écrans de découverte de médicaments.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales primaires, qui se différencient ensuite en diverses lignées cellulaires progénitrices multipotentes. Ces lignées donnent par la suite naissance à tous les types de cellules dans le corps humain. Les systèmes de culture hESC in vitro ont transformé la capacité d'étudier le développement embryonnaire humain et ont servi d'outil précieux pour obtenir de nouvelles connaissances sur la façon dont ces processus sont réglementés aux niveaux biologique et moléculaire. De même, les études sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) générées par la reprogrammation de cellules somatiques isolées de patients humains fournissent de nouvelles informations sur diverses maladies. En outre, l'ancêtre et les cellules différenciées dérivées des HESC peuvent être utiles pour la recherche impliquant la thérapie de cellules souches et le dépistage de drogue1,2,3,4.

Les hESC peuvent être induits pour se différencier en cellules progénitrices neurales (PNJ), qui sont des cellules multipotentielles avec une capacité d'auto-renouvellement étendue. Par la suite, ces cellules peuvent être différenciées en neurones, astrocytes, et oligodendrocytes5,6. Les PNJ offrent également un système cellulaire pour les études in vitro de la biologie neurodéveloppementale et de diverses maladies neurologiques. Cependant, les méthodes actuelles de culture de type colonie impliquant les HESC et leur différenciation en PNJ sont inefficaces et impliquent souvent la coculture ainsi que le corps embryonnaire (EB) et la formation de rosette5,7,8,9. Ces protocoles présentent des taux de survie plus faibles et une différenciation spontanée et prennent plus de temps.

Présenté ici est un système de culture amélioré et robuste qui est facilement évolutif et utilise la culture de type unicellulaire de haute densité de hESCs10. L'inclusion de l'inhibiteur de Roh-kinase (ROCK) a contribué à l'efficacité de survie sensiblement améliorée pendant la culture de type de cellule simple de hESC10,11,12,13,14. Dans ce système de culture, les HESC peuvent être facilement entretenus et étendus. En outre, le protocole présente une méthode efficace pour générer des PNJ à partir de la culture de type unicellulaire des HESC, qui permet la production de PNJ très purs. Inhibition des voies de signalisation BMP/TGMD/activine avec des inhibiteurs ALK induisent efficacement la différenciation des HCES de type unicellulaire en PNJ15,16, qui peuvent alors être induits à se différencier en lignées neuronales fonctionnelles, telles que les neurones dopaminergiques et les astrocytes.

En résumé, le protocole de culture de type unicellulaire utilisant les CSSH offre un modèle attrayant pour étudier la différenciation de ces cellules en différentes lignées, y compris les PNJ. Ce protocole est facilement évolutif et donc adapté pour générer des cellules pour la recherche impliquant la thérapie régénérative et le dépistage des médicaments.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation des plaques enduites de matrice de membrane de sous-sol hESC-qualifiées

  1. Décongeler lentement la membrane de membrane du sous-sol qualifiée par le HESC (voir Table of Materials)solution à 4 oC pendant au moins 2 à 3 h ou pendant la nuit pour éviter la formation d'un gel.
  2. Pour préparer les plaques recouvertes de matrice de membrane de sous-sol, diluez la matrice dans le DMEM/F12 froid à une concentration finale de 2%. Bien mélanger et enrober chaque puits d'une plaque de 6 puits avec 1 ml de la solution de matrice diluée.
  3. Incuber les plaques recouvertes de matrice séminatoire séminante au sous-sol à température ambiante (RT) pendant au moins 3 h ou à 4 oC pendant la nuit.
    REMARQUE : Les plaques munie d'une matrice membranaire du sous-sol peuvent être entreposées à 4 oC pendant 1 semaine avant que la solution de matrice ne soit enlevée et que les plaques ne soient utilisées.

2. Adaptation des HESC de type Colonie à la culture hESC unicellulaire

  1. Pour passer les cultures sans mangeoire de type de colonie H9 (WA09) hESCs cultivés sur la matrice de membrane de sous-sol, aspirer le milieu des puits (Figure 1A)9.
  2. Laver 1x avec 1 ml de DPBS. Ajouter 1 ml de solution de dispase (1 U/mL) par puits et incuber à 37 oC pendant 20 min.
  3. Retirer le dispase, laver les cellules 1x doucement avec 2 ml de DMEM/F12, retirer le milieu, et ajouter 2 mL de DMEM/F12 à chaque plaque.
  4. Détachez délicatement les colonies en tirant doucement de haut en bas et transférez-les dans un tube de 15 ml.
  5. Centrifuger les granulés pendant 2 min à 370 x g et aspirer le milieu.
  6. Pour dissocier les granulés cellulaires en cellules individuelles, ajouter 2 ml de solution de détachement cellulaire (1x concentration, voir Table of Materials) et couver à 37 oC pendant 10 min.
  7. Centrifugeuses cellules pendant 2 min à 370 x g et retirez la solution de détachement.
  8. Ajouter le milieu ESC humain mTeSR1 frais et dissocier les cellules en cellules simples en faisant un tuyauterie doux de haut en bas.
  9. Pour adapter les HESC de type colonie à une culture de type monocellulaire, plaquez environ 1,5 à 2,0 x 106 HESC dans chaque puits de la membrane du sous-sol enduit 6 plaques de puits dans 2 mL de mTeSR1 contenant 10 'M inhibiteur de ROCK pendant 24 h (Figure 1A).
  10. Après 24 h, remplacer le milieu hESC par du mTeSR1 frais sans inhibiteur ROCK et permettre aux HESC de se développer en tant que type monocellulaire pendant 3 jours. Changer le milieu tous les jours.
  11. Le jour 4, lorsque les cultures atteignent près de 100% de confluence, dissocier les cellules dans la solution de détachement, puis replate comme décrit à l'étape 2.6.
    REMARQUE : L'inhibiteur de ROCK améliore la survie de cellules pendant les 24 h initiaux de la culture hESC de type unicellulaire.

3. Formation et différenciation du corps embryonnaire en trois couches germinales (Figure 2)

  1. Pour former des EB, d'abord resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu mTeSR1 avec un inhibiteur de 10 M ROCK pendant les 24 premiers h, puis incuber toute la nuit dans des plats à attachement bas de 60 mm dans un incubateur de 37 oC pour permettre l'agrégation.
  2. Après 24 h, les petits EB sont transférés dans un tube de 15 ml. Laisser les EB s'installer au fond du tube et retirer délicatement le milieu à l'eau avec une pipette. Transférer les EB dans le milieu EB (knockout-DMEM complété par 20% de remplacement de sérum knock-out, 1x supplément de glutamine [voir Tableau des matériaux], 1% NEAA [acides aminés non essentiels; voir Tableau des matériaux], et 0,2% de mercaptoéthanol) et leur permettre de se développer dans les plats à faible attachement pendant 7 jours. Le médium peut être changé tous les deux jours comme décrit ci-dessus (Figure 2A).
  3. Le jour 7, collectez les EB dans les plats et transférez-les dans un tube de 15 ml. Retirez délicatement le milieu à l'eau avec une pipette et transférez les EB dans une plaque de 6 puits recouverte de membrane du sous-sol.
  4. Laisser les EB se fixer à la plaque et couver pendant 12 jours dans le milieu EB, au cours de laquelle ils se différencieront en trois couches germinales (Figure 2B). Changez le médium tous les deux jours.
    REMARQUE : Pendant l'agrégation des cellules, le plat à faible attachement aide à éviter l'attachement EB.

4. Différenciation des HESC de type unicellulaire en PNJ (Figure 3)

  1. Pour induire la différenciation du PNJ, dissocier les HESC de type unicellulaire avec 1 ml de solution de détachement (1x) et incuber pendant 10 min à 37 oC.
  2. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 370 x g et enlever le supernatant de solution de détachement. Ajouter 1 ml de DMEM/F12 et resuspendre les cellules par pipetage doux.
  3. Cellules de plaque sur une matrice de membrane de sous-sol enduite 6 plaque de puits à une densité de 2 x 105 cellules/puits dans 2 mL de mTeSR1 contenant 10 'M inhibiteur de ROCK.
  4. Après 24 h, remplacer le milieu de culture par un milieu d'induction neuronale (DMEM avec 1% B27 moins vitamine A) complété par 1 m de dorsomorphine et 5 M SB431542.
  5. Changer le médium tous les deux jours pendant les 4 premiers jours de l'induction neuronale, puis tous les jours jusqu'à atteindre la confluence au jour 7 (Figure 3B).
    REMARQUE : (1) La dorsomorphine inhibe la voie BMP en ciblant les récepteurs ALK2,3,6 et inhibe également l'AMPK; SB431542 est un inhibiteur de la voie TGFD/Activin en ciblant ALK5,7. (2) Le même protocole a été testé avec une autre ligne ESC (WA01), qui a donné des résultats similaires à WA0916. (3) Nous avons généralement utilisé Matrigel pour la matrice de membrane de sous-sol ; cependant, les cellules peuvent être cultivées sur Geltrex, puis différenciées en PNJ avec des résultats très similaires comme l'indique l'expression de plusieurs marqueurs PNJ(figure 4D,E). Manipulez Geltrex de la même manière que Matrigel (voir la section 1).

5. Expansion et cryoconservation de PNJ

  1. Après 7 jours d'induction neuronale, dissocier les cellules avec 1 ml de solution de détachement (1x) et incuber pendant 10 min à 37 oC.
  2. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 370 x g et enlever le supernatant de solution de détachement. Ajouter 1 ml de milieu d'expansion du PNJ (voir Tableau des matériaux)et resuspendre les cellules par tuyauterie douce.
  3. Plaque 1 x 105 cellules dans 2 ml de milieu d'expansion de PNJ sur la matrice de membrane de sous-sol-enduit 6 plaques de puits.
  4. Les PNJ de passage plusieurs fois, si nécessaire, lorsque les cultures atteignent près de 90% de confluence. Au cours des premiers passages de 3 à 4, ajouter 10 'M inhibiteur ROCK pendant les 24 h initiaux pour prévenir la mort cellulaire. Après ces passages, les cellules peuvent être passages et cultivées sans inhibiteur ROCK. Changer le support tous les deux jours pendant l'expansion.
  5. Cryopreserve PNJ lorsque les cultures atteignent la confluence.
    1. Pour la cryoconservation, dissocier les cellules en 1 ml de solution de détachement (1x) pendant 5 min à 37 oC, puis la suspension centrifugeuse pendant 2 min à 370 x g pour enlever la solution de détachement.
    2. Ajouter la solution de congélation cellulaire (voir Tableau des matériaux) aux PNJ dissociés à 1 x 106 cellules/mL et distribuer 1 mL d'aliquots aux cryovials.
    3. Placer les cryovials dans un contenant de congélation et les conserver toute la nuit dans un congélateur de -80 oC.
  6. Conserver les cryovials dans l'azote liquide.

6. Préparation des plaques enduites de poly-L-ornithine (PLO) et de Laminin

  1. Pour préparer les plaques enduites d'OLP/laminin, diluer la solution de stock de l'OLP dans le PBS ou l'eau à une concentration finale de 10 g/mL. Bien mélanger et enrober chaque puits d'une assiette de 6 puits avec 1 ml de solution PLO diluée.
  2. Incuber pendant au moins 2 h à 37 oC ou toute la nuit à 4 oC.
  3. Lavez-vous chaque puits avec du PBS.
  4. Diluer la solution de stock de laminindansdanse froide ou de l'eau à 10 g/mL. Bien mélanger la solution de laminin. Retirer le PBS et enrober immédiatement chaque puits de 1 ml de la solution de laminin. Conserver les assiettes à 4 oC et les utiliser dans la semaine. Laver avec PBS et ajouter immédiatement le milieu de culture.
    REMARQUE : Ne laissez pas sécher les plaques enduites d'OLP/laminin.

7. Différenciation des PNJ dérivés du HESC dans les neurones dopaminergiques (Figure 6A)

  1. Les PNJ de plaque dans les plats enrobés d'OLP/laminin dans le milieu d'expansion de PNJ à une densité d'environ 50%.
  2. Après 24 h, changer le milieu vers le milieu DA1 (milieu neurobasal contenant 2 mM de supplément de glutamine, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/mL SHH, et 100 ng/mL FGF8) et changer le milieu tous les deux jours.
  3. Les cultures de passage quand elles atteignent la confluence. Dissocier les cellules avec 1 ml de solution de détachement (1x) et couver pendant 10 min à 37 oC.
  4. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 370 x g et enlever le supernatant de solution de détachement. Ajouter 1 ml de milieu DA1 et resuspendre les cellules par pipetting douce.
  5. Plaque 1 x 105 cellules dans 2 ml de milieu DA1 sur 6 plaques de puits enduites d'OLP/laminin.
  6. Après 10 jours, changer au milieu DA2 (milieu neurobasal contenant 2 mM de supplément de glutamine, 1x NEAA, 1x B27, 200 'M acide ascorbique, 20 ng/mL BDNF, et 20 ng/mL GNDF) et changer de milieu tous les deux jours pendant 20 jours supplémentaires (Figure 6A).
    REMARQUE : Ajouter de l'acide ascorbique frais tous les jours au milieu DA2. Dans les 14 premiers jours, les cellules différenciées doivent être transmises lorsqu'elles atteignent 90 % de confluence, mais plus après.

8. Différenciation des PNJ dérivés de l'ESC en Astrocytes

  1. Cellules progénitrices neurales de plaque sur des plaques PLO/laminin-enduites dans le milieu d'expansion de PNJ à une densité d'environ 50%.
  2. Après 24 h, changer le milieu à l'astrocyte moyen (DMEM/F12 moyen comprenant 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/mL IGF, 10 ng/mL activin A, 10 ng/mL heregulin -1, et 8 ng/mL bFGF) et changer le médium tous les deux jours.
  3. Les cultures de passage quand elles atteignent la confluence. Dissocier les cellules avec 1 ml de solution de détachement (1x) et couver pendant 10 min à 37 oC.
  4. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 370 x g et enlever le supernatant de solution de détachement. Ajouter 1 ml de milieu astrocyte et resuspendre les cellules par pipetting douce.
  5. Assiette 1 x 105 cellules dans 2 ml de milieu astrocyte sur l'OLP/laminin-enduit 6 plats de puits.
  6. Permettre que la différenciation se poursuive pendant un total de 5 à 6 semaines(figure 6B).

9. Staining immunofluorescence

  1. Cellules de culture dans les plats de 35 mm comme décrit ci-dessus pour chaque type de cellule. Aspirer le milieu et ajouter 1 ml de solution PFA de 4 % par plat et incuber pendant 20 min à RT.
  2. Laver 2x pendant 5 min avec PBS.
    REMARQUE : Une fois les cellules fixées, les plaques d'analyse peuvent être scellées avec du parafilm et stockées à 4 oC. Tache avec un anticorps dans un délai de 1 semaine après fixation.
  3. Ajouter 300 l de solution de blocage (sérum de chèvre ou d'âne en PBS) par plat et incuber à RT pendant 30 à 60 min.
  4. Laver le plat 2x avec PBS pendant 5 min.
  5. Ajouter 300 l de solution d'anticorps primaires(tableau 1) (dilué dans la solution de blocage) et incuber à RT pendant 1,5 h ou toute la nuit à 4 oC.
  6. Laver 2x avec PBS pendant 10 min.
  7. Ajouter 300 l d'anticorps secondaire conjugué saillage (tableau 1) dans la solution de blocage et incuber dans l'obscurité pendant 1 h à RT.
  8. Laver les cellules 2x pendant 10 min avec DU PBS.
  9. Ajouter la solution de coloration Hoechst (1 m de concentration finale en PBS) pour tacher les noyaux. Incuber les cellules dans l'obscurité pendant 5 min à RT.
  10. Laver les cellules 1x avec PBS pendant 5 min, puis ajouter 500 'L de PBS. Gardez la vaisselle dans l'obscurité, puis observez la fluorescence à l'intérieur d'un microscope confocal(Figure 2B, Figure 5C, Figure 6Aet Figure 7B).

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Résultats

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Présenté ici est un protocole amélioré pour le maintien et l'expansion de la culture de type unicellulaire des HESC et leur différenciation efficace en cellules progénitrices neurales, qui se différencie par la suite en diverses lignées neuronales en aval, y compris les neurones dopaminergiques et les astrocytes.

Les images de contraste de phase représentative montrent la morphologie cellulaire à différentes étapes au cours de l'adaptation des HESC de type colonie à la culture de type unicellu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des méthodes évolutives et efficaces pour la différenciation des HESC en diverses lignées et la génération d'un nombre suffisant de cellules différenciées sont des critères importants pour le dépistage des médicaments et la thérapie par cellules souches. Diverses méthodes de passage unicellulaire ont été publiées, dans lesquelles les cellules sont cultivées en présence d'inhibiteur syUP Ou d'autres petites molécules pour améliorer la survie, mais les produits finaux de ces méthodes de culture sont le type de colonie hESC...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Carl D. Bortner (NIEHS) pour son aide dans l'analyse du FACS. Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros de l'Institut national des sciences de la santé environnementale, les National Institutes of Health, Z01-ES-101585 à amJ.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Antennes M de 35 mmibidi81156Antenne parabolique
6 puits Corning3516
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104-500Solution de détachement cellulaire
Activin AR& D system338-AC-050
Acide ascorbiqueSigma AldrichA4403
B27 supplémentThermo Fisher17504044
supplément B27 (-Vit A)Thermo Fisher12587010
BDNFApplied Biological MaterialsZ100065
bFGFPeprotech100-18C
CentrifugeuseIncubateur CO2 DAMON/ICE428-6759
Thermo Fisher4110
Matrice certifiée hESC de Corning (Magrigel)354277Corning(utilisée pour la plupart du protocole ici)
Cryostor CS 10Stemcell Technologies7930Solution de congélation cellulaire
DispaseStemcell Technologies7923
DMEMThermo Fisher10569-010
DMEM/F12Thermo Fisher10565-018
DorsomorphineTocris3093
EGFPeprotechAF-100-16A
Sérum de veau fœtalFisher ScientificSH3007003HI
FGF8Matériaux biologiques appliquésZ101705
GDNFMatériaux biologiques appliquésZ101057
matrice GeltrexThermo FisherA1569601matrice de membrane basale
GlutaMaxThermo Fisher35050061supplément de glutamine, 100X
H9 (WA09) lignée de cellules souches embryonnaires humainesWiCellWA09
Heregulin b-1Peprotech100-3
IGFPeprotech100-11
Knockout DMEMThermo Fisher10829018
Knockout Sérum de remplacementThermo Fisher10828028
LamininSigma AldrichL2020
mTeSR1Stemcell Technologies85850hESC milieu de culture
N2 supplémentThermo Fisher17502001
NEAAThermo Fisher11140050
NeurobasalThermo Fisher21103049
Poly-L-ornithineSigma AldrichP3655
Inhibiteur de ROCKTocris1254
SB431542Tocris1614
SHHMatériaux biologiques appliquésZ200617
Milieu de progéniteur neuralStemcell Technologies5833Milieu d’expansion NPC
Matrice à membrane basale

Références

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Human Embryonic Stem CellsSingle Cell CultureNeural Progenitor CellsEmbryoid Body FormationROCK InhibitorNeural Induction MediumDopaminergic NeuronsAstrocyte DifferentiationFACS AnalysisQuantitative PCR

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