Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

Summary

Présenté ici est un protocole pour la génération d'une culture unicellulaire des cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales. Le protocole est simple, robuste, évolutif et adapté aux applications de dépistage des médicaments et de médecine régénérative.

Abstract

La différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires humaines (HESC) a transformé la capacité d'étudier le développement humain à la fois aux niveaux biologique et moléculaire et a fourni des cellules pour une utilisation dans des applications régénératrices. Les approches standard pour la culture hESC utilisant la culture de type colonie pour maintenir les HESC indifférenciés et le corps embryonnaire (EB) et la formation de rosette pour la différenciation en différentes couches germinales sont inefficaces et prennent du temps. Présenté ici est une méthode de culture unicellulaire en utilisant hESCs au lieu d'une culture de type colonie. Cette méthode permet le maintien des caractéristiques des HESC indifférenciés, y compris l'expression de marqueurs hESC à des niveaux comparables aux HESC de type colonie. En outre, le protocole présente une méthode efficace pour la génération de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de hESCs de type unicellulaire qui produit des PNJ dans un délai de 1 semaine. Ces cellules expriment fortement plusieurs gènes de marqueur de PNJ et peuvent se différencier en divers types de cellules neurales, y compris les neurones dopaminergiques et les astrocytes. Ce système de culture unicellulaire pour les HESC sera utile pour étudier les mécanismes moléculaires de ces processus, les études de certaines maladies et les écrans de découverte de médicaments.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales primaires, qui se différencient ensuite en diverses lignées cellulaires progénitrices multipotentes. Ces lignées donnent par la suite naissance à tous les types de cellules dans le corps humain. Les systèmes de culture hESC in vitro ont transformé la capacité d'étudier le développement embryonnaire humain et ont servi d'outil précieux pour obtenir de nouvelles connaissances sur la façon dont ces processus sont réglementés aux niveaux biologique et moléculaire. De même, les études sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) générées par la repro....

Protocol

1. Préparation des plaques enduites de matrice de membrane de sous-sol hESC-qualifiées

1. Décongeler lentement la membrane de membrane du sous-sol qualifiée par le HESC (voir Table of Materials)solution à 4 oC pendant au moins 2 à 3 h ou pendant la nuit pour éviter la formation d'un gel.
2. Pour préparer les plaques recouvertes de matrice de membrane de sous-sol, diluez la matrice dans le DMEM/F12 froid à une concentration finale de 2%. Bien mélanger et enrober chaque puits d'une plaque de 6 puits avec 1 ml de la solution de matrice diluée.
3. Incuber les plaques recouvertes de matrice séminatoire séminante au sous-sol à températu....

Results

Présenté ici est un protocole amélioré pour le maintien et l'expansion de la culture de type unicellulaire des HESC et leur différenciation efficace en cellules progénitrices neurales, qui se différencie par la suite en diverses lignées neuronales en aval, y compris les neurones dopaminergiques et les astrocytes.

Les images de contraste de phase représentative montrent la morphologie cellulaire à différentes étapes au cours de l'adaptation des HESC de type colonie à la culture de type unicellu.......

Discussion

Des méthodes évolutives et efficaces pour la différenciation des HESC en diverses lignées et la génération d'un nombre suffisant de cellules différenciées sont des critères importants pour le dépistage des médicaments et la thérapie par cellules souches. Diverses méthodes de passage unicellulaire ont été publiées, dans lesquelles les cellules sont cultivées en présence d'inhibiteur syUP Ou d'autres petites molécules pour améliorer la survie, mais les produits finaux de ces méthodes de culture sont le type de colonie hESC.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antennes M de 35 mm	ibidi	81156	Antenne parabolique
6 puits Corning		3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Solution de détachement cellulaire
Activin A	R& D system	338-AC-050
Acide ascorbique	Sigma Aldrich	A4403
B27 supplément	Thermo Fisher	17504044
supplément B27 (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Applied Biological Materials	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
Centrifugeuse	Incubateur CO2 DAMON/ICE	428-6759
	Thermo Fisher	4110
Matrice certifiée hESC de Corning (Magrigel)	354277	Corning	(utilisée pour la plupart du protocole ici)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Solution de congélation cellulaire
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphine	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Sérum de veau fœtal	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	Matériaux biologiques appliqués	Z101705
GDNF	Matériaux biologiques appliqués	Z101057
matrice Geltrex	Thermo Fisher	A1569601	matrice de membrane basale
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	supplément de glutamine, 100X
H9 (WA09) lignée de cellules souches embryonnaires humaines	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout DMEM	Thermo Fisher	10829018
Knockout Sérum de remplacement	Thermo Fisher	10828028
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC milieu de culture
N2 supplément	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poly-L-ornithine	Sigma Aldrich	P3655
Inhibiteur de ROCK	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Matériaux biologiques appliqués	Z200617
Milieu de progéniteur neural	Stemcell Technologies	5833	Milieu d’expansion NPC