Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

21.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/60575

⸱

29 janvier 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

Résumé

L'immunohistochimie est une technique largement utilisée pour explorer l'expression et la localisation des protéines pendant les états normaux de développement et de maladie. Bien que de nombreux protocoles d'immunohistochimie aient été optimisés pour les sections des tissus et des tissus des mammifères, ces protocoles nécessitent souvent une modification et une optimisation pour les organismes modèles non mammifères. Le poisson zèbre est de plus en plus utilisé comme système modèle dans la recherche fondamentale, biomédicale et translationnelle pour étudier les mécanismes moléculaires, génétiques et biologiques cellulaires des processus de développement. Le poisson zèbre offre de nombreux avantages en tant que système modèle, mais nécessite également des techniques modifiées pour une détection optimale des protéines. Ici, nous fournissons notre protocole pour l'immunohistochimie de fluorescence de montage entier dans les embryons et les larves de poissons-zèbres. Ce protocole décrit en outre plusieurs stratégies de montage différentes qui peuvent être utilisées et une vue d'ensemble des avantages et des inconvénients de chaque stratégie fournit. Nous décrivons également des modifications à ce protocole pour permettre la détection des substrats chromogéniques dans le tissu entier de montage et la détection de fluorescence dans le tissu larvaire sectionné. Ce protocole est largement applicable à l'étude de nombreux stades de développement et structures embryonnaires.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle puissant pour l'étude des processus biologiques pour plusieurs raisons, y compris le temps de génération court, le développement rapide, et l'agréabilité aux techniques génétiques. En conséquence, le poisson zèbre est couramment utilisé dans les écrans à haut débit de petites molécules pour la recherche toxicologique et la découverte de médicaments. Le poisson zèbre est également un modèle attrayant pour l'étude des processus de développement étant donné qu'une seule femelle peut régulièrement produire 50-300 œufs à la fois et les embryons optiquement clairs se développent à l'extérieur permettant une visualisation efficace des processus de développement. Cependant, les premières recherches se sont surtout appuyées sur des écrans génétiques avancés utilisant n-éthyle-N-nitrosourea (ENU) ou d'autres mutagènes en raison de difficultés à établir des techniques génétiques inversées. Il y a environ deux décennies, les morpholinos ont été utilisés pour la première fois chez le poisson zèbre pour éliminer les gènes ciblés1. Les morpholinos sont de petits oligonucléotides antisens qui inhibent la traduction de l'ARNm cible après la microinjection dans un embryon à un stade de développement précoce. Une faiblesse majeure des morpholinos est qu'ils sont dilués pendant que les cellules se divisent et perdent généralement l'efficacité par 72 heures après la fertilisation (hpf). Tandis que les morpholinos restent un outil puissant pour la perturbation de gène de poisson-zèbre, les nucléases d'effecteur de transcription-comme d'activateur (TALENs), les nucléases de zinc-doigt (ZFNs), et les groupés régulièrement interspaced courtes répétitions palindromic (CRISPRs) sont plus récemment employés pour cibler directement le génome de poisson zèbre2,3. Ces stratégies génétiques inversées, combinées à la génétique avancée et aux écrans à haut débit, ont établi le poisson zèbre comme un modèle puissant pour étudier l'expression et la fonction des gènes.

La capacité d'étudier la fonction de gène exige généralement une évaluation de la distribution spatio-temporelle de l'expression de gène ou de produit de gène. Les deux techniques les plus couramment utilisées pour visualiser de tels modèles d'expression au début du développement sont l'hybridation in situ (ISH) et l'immunohistochimie de montage entier (IHC). L'hybridation in situ a été développée pour la première fois en 1969 et repose sur l'utilisation de sondes d'ARN antisens étiquetées pour détecter l'expression de l'ARNm dans un organisme4. En revanche, les anticorps étiquetés sont utilisés dans l'immunohistochimie pour visualiser l'expression des protéines. L'idée d'étiqueter les protéines pour la détection remonte auxannées 5 des années 1930 et la première expérience du CIH a été publiée en 1941 lorsque des anticorps étiquetés FITC ont été utilisés pour détecter les bactéries pathogènes dans les tissus infectés6. ISH et IHC ont évolué et amélioré de manière significative au cours des décennies suivantes et sont maintenant à la fois couramment utilisés dans le laboratoire de recherche moléculaire et diagnostique7,8,9,10,11. Bien que les deux techniques présentent des avantages et des inconvénients, le CSI offre plusieurs avantages par rapport à l'ISH. Pratiquement, le CSI prend beaucoup moins de temps qu'ISH et est généralement moins coûteux en fonction du coût de l'anticorps primaire. En outre, l'expression de l'ARNm n'est pas toujours une mesure fiable de l'expression des protéines, car il a été démontré chez les souris et les humains que seulement environ un tiers de la variation de l'abondance des protéines peut être expliquée par l'abondance de l'ARNm12. Pour cette raison, IHC est un supplément important pour confirmer les données ISH, si possible. Enfin, le CSI peut fournir des données subcellulaires et de co-localisation qui ne peuvent pas être déterminées par ISH13,14,15. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour détecter de façon fiable des protéines par immunohistochimie dans les embryons et les larves de poissons zèbres de monture entière. Le but de cette technique est de déterminer l'expression spatiale et temporelle d'une protéine d'intérêt dans l'embryon entier. Cette technologie utilise des anticorps primaires spécifiques à l'antigène et des anticorps secondaires étiquetés fluorescents. Le protocole est facilement adaptable pour une utilisation sur les sections de tissu montés sur la diapositive et pour une utilisation avec des substrats chromogéniques au lieu de la fluorescence. Utilisant ce protocole, nous démontrons que le développement du muscle squelettique de poisson zèbre exprime des récepteurs ionotropic de glutamate, en plus des récepteurs d'acétylcholine. Les sous-unités de récepteur de glutamate de type NMDA sont détectables sur le muscle longitudinal à 23 hpf.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Les procédures de travail avec les adultes reproducteurs de poissons zèbres et les embryons décrits dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'État de Murray.

1. Collection d'embryons et fixation

  1. Préparer les réservoirs de frai en plaçant des paires ou des groupes mixtes de poissons-zèbres adultes dans des réservoirs avec un maillage ou une doublure à fentes remplies d'eau du système pendant la nuit.
  2. Aux lumières allumées, modifiez l'eau du réservoir de frai pour l'eau fraîche du système afin d'éliminer les excréments. Utilisez un cycle sombre clair de 14 h/10 h avec des lumières qui s'allument à 9 h.
  3. Une fois les œufs pondus, retournez les adultes dans des réservoirs à la maison.
  4. Recueillir les œufs en les dessinant à l'aide d'une tuyauterie de transfert ou en les versant dans une passoire en maille.
  5. Transférer les œufs dans des plats Petri remplis à mi-chemin avec le milieu embryonnaire (comme 30% Danieau ou E2 embryon moyen avec 0,5 mg/L bleu méthylène), limitant le nombre d'embryons par plat à 50.
  6. Enlever les œufs morts ou qui ne se divisent pas.
    REMARQUE : Les embryons morts peuvent être facilement identifiés car ils deviennent opaques et semblent souvent « nuageux ». Si le bleu de méthylène est ajouté au milieu embryonnaire, les embryons morts prennent une apparence bleu foncé.
  7. Incuber les plats d'œufs à 28,5 oC jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade désiré. Pour cette expérience, élever les embryons jusqu'à 23 hpf.
  8. Facultatif) Transférer les embryons à 24 hpf à 200 M 1-phényl 2-thiourea (PTU) dans le milieu embryonnaire pour prévenir la mélanogenèse16,17. Alternativement, les embryons d'eau de Javel après fixation (voir la section 5 en option).
  9. Changer l'embryon moyen ou PTU moyen tous les jours.
  10. Déchorionate embryons non éclos à l'aide de forceps ultra-fin-tip sous un stéréomicroscope. Alternativement, déchorionate chimiqueembryons en couvant dans 1 mg/mL Pronase dans le milieu d'embryon pendant plusieurs minutes à température ambiante. Retirer les embryons de Pronase et les laver trois fois avec le milieu embryonnaire.
  11. Les embryons déchorions s'en tiendront au plastique. Conservez-les dans des plats Petri en verre ou en plastique recouverts d'agarose de 1 à 2 % dissous dans un milieu embryonnaire. Déplacer les embryons déchorions à l'aide de pipets Pasteur polis au feu pour minimiser les dommages.
  12. Transférer les embryons dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml à l'aide d'une tuyauterie en plastique ou polie par le feu.
  13. Retirer le milieu embryonnaire à l'eclec. Ne laisser que suffisamment de liquide pour couvrir les embryons après chaque changement de liquide.
  14. Préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x salin tamponné par phosphate (PBS) dans une hotte chimique à fumée.
    CAUTION: PFA est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez-les des liquides et des solides contaminés dans les zones désignées.
  15. Fixer les embryons en 4% PFA pour 1-2 h avec bascule douce à température ambiante. Alternativement, fixer les embryons de 4 h à la nuit à 4 oC.
  16. Laver trois fois en 1x PBS et 1% De Triton-X (PBTriton) pendant 5 min.
  17. Utilisez les embryons immédiatement ou entreposez-les à 4 oC jusqu'à 1 semaine.
  18. Pour le stockage à long terme, déshydrater les embryons dans 100% méthanol (MeOH) 2 h ou pendant la nuit à -20 oC. Conserver les embryons à -20 oC à MeOH pendant plusieurs mois.
    CAUTION: MeOH est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez-les des liquides et des solides contaminés dans les zones désignées.

2. Préparation d'embryons

  1. Réhydratez les embryons par incubations en série à température ambiante.
    1. Incuber en 75% MeOH/25% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.
    2. Incuber en 50% MeOH/50% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.
    3. Incuber en 25% MeOH/75% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.
    4. Incuber en 100% PBTriton pendant 5 min, à bascule.
  2. (Facultatif) Préparer une solution de travail nouvelle protéase K (10 g/mL en PBTriton) sur la glace en ajoutant 10 l de stock de protéase K fraîchement décongelé (10 mg/mL).
    1. Perméabilisez les embryons en digérant jusqu'à 30 min dans Proteinase K.
      REMARQUE : Le moment suggéré est de 24 hpf : pas de digestion ; 24 hpf : 15 min de digestion; et 7 jours: 30 min de digestion.
    2. Rincer les embryons perméabilisés dans PBTriton et re-fixer dans 4% PFA pendant 20 min à température ambiante.
    3. Laver les embryons trois fois en PBTriton pendant 5 min à température ambiante avec un léger basculement.

3. Incubation primaire d'anticorps

  1. Sélectionnez une solution de blocage commercial ou un sérum correspondant à l'espèce hôte d'anticorps secondaire (p. ex. 10 % de sérum de chèvre dans PBTriton) avec ou sans 2 mg/mL d'albumine bovine (BSA).
  2. Bloquer les embryons dans la solution de blocage pendant 1-3 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC pendant le basculement.
  3. Incuber dans l'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage ou 1% de sérum dans PBTriton pendant la nuit à 4 oC tout en se balançant. Dans cette expérience, les anticorps primaires utilisés étaient anti-NMDAR1, récepteur anti-pan-AMPA, et anti-phospho-Histone H3, chacun dilué à une concentration finale de 1:500 dans 1% de sérum de chèvre dans PBTriton.
  4. Laver cinq fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante tout en se balançant.

4. Incubation secondaire d'anticorps

  1. Sélectionnez un anticorps secondaire en fonction de l'espèce hôte de l'anticorps primaire et de la longueur d'onde désirée.
  2. Incuber dans un anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage ou 1 % de sérum pendant 2 h à température ambiante (ou pendant la nuit à 4 oC) pendant le basculement.
    REMARQUE : Les anticorps secondaires fluorescents sont sensibles à la lumière. Nous avons utilisé 1:500 chèvre-anti-souris Alexa488 dilué dans 1% sérum de chèvre dans PBTriton.
  3. Couvrez les tubes de papier d'aluminium ou couvrez-les d'une boîte de blocage de la lumière pour cette étape et toutes les étapes suivantes.
  4. Laver trois fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante tout en se balançant.
  5. Transférer les embryons à une solution de glycérol à 50 % dans le PBS sur un lit de 2 % d'agarose dans le milieu embryonnaire et procéder à la documentation ou procéder à d'autres étapes de traitement ci-dessous.

Étapes facultatives

5. Blanchiment

  1. Préparer la solution d'eau de Javel dans un tube de 1,5 ml en ajoutant 810,7 l de ddH2O, 89,3 l de 2 M KOH, et 100 oL de 30 % H2O2.
  2. Inverser le tube trois fois pour mélanger.
  3. Pipette 1 ml de direction de solution d'eau de Javel aux embryons.
  4. Ouvrez le bouchon du tube embryonnaire pour permettre au gaz de s'échapper. Appuyez doucement sur le tube sur le banc pour déloger les bulles.
  5. Surveiller le processus de blanchiment (utiliser un microscope si nécessaire) et arrêter la réaction lorsque le pigment est suffisamment enlevé (environ 5 min pour 24 hpf ou 10 min pour 72 hpf).
  6. Retirez soigneusement la solution de blanchiment à l'égard d'une micropipette et rincez les embryons trois fois en 1 ml de PBTriton.
    REMARQUE: Les embryons sont collants dans cette étape.
  7. Passez à la documentation ou à d'autres étapes de traitement ci-dessous.

6. Dissection d'embryon et dedeyolking

  1. Pour enlever le jaune, transférer une petite quantité (200 l ou assez pour couvrir complètement l'embryon, mais assez restrictive pour limiter l'endroit où il peut flotter) de 1x PBS à une glissière de dépression ou une glissière en verre ordinaire.
  2. Utilisez un tuyau de transfert en plastique pour déplacer 1 ou plusieurs embryons vers la gouttelette PBS.
  3. Utilisez des forceps ultra-fins et 00 broches d'insectes pour briser le jaune et gratter très doucement les granules de jaune de la surface ventrale de l'embryon (voir aussi Cheng et al., 2014)18.
  4. Retirer les granules de jaune et reconstituer le PBS au besoin.
  5. Répéter l'opération jusqu'à ce que l'embryon soit suffisamment exempt de jaune.

7. Montage plat sur diapositives

  1. Transférer les embryons deyolked sur une lame de verre chargée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 1 ml avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement). Orientez comme désiré avec une pointe micropipette de 200 l ou une goupille d'insecte.
  2. Wick loin excès PBS avec une lingette Kim ou essuie-tout.
  3. Ajouter 2-3 gouttes de support de montage à la diapositive et coverslip.
  4. Sécher à l'air pendant environ 5 à 10 min.
  5. Scellez le verre de couverture sur la glissière avec du vernis à ongles transparent.
    REMARQUE : Les bords du verre de couverture doivent être complètement recouverts d'une fine couche continue de vernis à ongles.
  6. Laisser sécher environ 10 minutes avant l'imagerie.

8. Montage à Agarose

  1. Préparer 1 % d'agarose dans le milieu embryonnaire en ajoutant 0,5 g d'agarose à 50 ml de milieu embryonnaire dans un flacon ou un bécher allant au micro-ondes d'au moins 3 fois plus grand que désiré.
  2. Chauffer au micro-ondes, en tourbillonnant tous les 30 s, jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute.
  3. Faire 1 mL d'aliquots dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml. Conserver les aliquots à température ambiante.
  4. Couvrir les bouchons de tube avec des serrures de capuchon avant le chauffage.
  5. Placer les tubes d'agarose dans un support de tube flottant dans un bécher à moitié rempli d'eau.
  6. Cuire au micro-ondes le bécher avec des tubes flottants pendant 2-3 min, ou jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondue.
  7. Transférer un embryon sur la glissière pontée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 200 l avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement).
  8. Placez l'embryon sur une couverture rectangulaire à l'aide d'épingles d'insectes et ajoutez environ 20 agarose fondue l'année directement à l'embryon.
  9. Orientez rapidement la région d'intérêt la plus proche de la couverture à l'aide de 00 broches d'insectes.
    REMARQUE : Il s'agit d'une monture à l'envers.
  10. Remettre le tube d'agarose dans le flotteur du tube d'eau chaude entre chaque utilisation et micro-ondes au besoin.
  11. Image à l'aide d'un microscope lorsque l'agarose durcit. Gardez l'embryon monté à l'envers pour être utilisé sur un microscope inversé. Retournez la couverture (de sorte que l'agarose est sous la couverture) pour une utilisation sur les microscopes droits.

9. Montage sur des glissières pontées

  1. Pour faire des diapositives pontées, collez les couvertures carrées à la glissière en verre à l'aide d'un petit point de superglue.
    REMARQUE : Il devrait y avoir un creux d'au moins 5 mm de large entre les couvertures. Deux #1 des couvertures élevées sont généralement appropriées pour les embryons de 24 à 48 hpf, tandis que trois couvertures élevées peuvent être nécessaires pour 72 hpf.
  2. Transférer 1-2 embryons deyolked à la glissière pontée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 200 l avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement).
  3. Éliminez l'excès de liquide avec une lingette Kim ou une serviette en papier.
  4. Ajouter une goutte de glycérol de 80 % directement à l'embryon.
  5. Couvrir d'un verre de couverture rectangulaire. La gouttelette de glycérol doit toucher le verre de couverture.
  6. Ajouter plus de glycérol à l'espace entre le verre de couverture et glisser au besoin pour couvrir complètement l'embryon avec une marge de glycérol sur les côtés de l'embryon.
  7. Faites glisser doucement le verre de couverture rectangulaire pour rouler l'embryon en position pour l'imagerie.

10. DAB Staining

REMARQUE : Cette section commence après l'étape 4.2 ci-dessus et remplace le reste de l'étape 4.

  1. Incuber les embryons dans une solution de blocage à l'aide d'un anticorps secondaire conjugué à la peroxidase pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC pendant le basculement.
  2. Laver trois fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante.
  3. Transférer les embryons dans une plaque de culture ou une glissière de dépression avec une pipette de transfert.
  4. Mélanger 50 'L de 1% de DAB (3,3'-diaminobenzidine) dissous en ddH2O et 50 'L de 0,3% de peroxyde d'hydrogène et porter à 1 ml avec PBS.
    CAUTION: DAB est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez les liquides et les solides contaminés par le DAB dans les zones désignées.
  5. Couvrez les embryons souillés hrP avec la solution DAB préparée ci-dessus et surveillez le développement des couleurs (généralement 1-5 min) au microscope.
  6. Après avoir atteint le niveau souhaité de développement des couleurs, rincez brièvement les embryons dans PBS.
  7. Transférer les embryons dans un tube de 1,5 ml avant la fixation.
  8. Refixez les embryons de 15 à 20 min en 4 % de PFA à température ambiante.
  9. Laver les embryons trois fois en PBTriton pendant 5 min.
  10. Passez à la documentation.

11. Protocole modifié pour la coloration des tissus sectionnés qui est monté sur des diapositives

  1. Encerclez le tissu à souir avec un stylo pap.
  2. Transférer les toboggans dans une chambre humide.
  3. Ajouter 1 mL de PBS directement sur la diapositive.
  4. Incuber 7 min à température ambiante pour enlever le milieu d'intégration.
  5. Verser PBS en inversant la glissière.
  6. Réhydratez 1 min dans jusqu'à 1 ml de tampon TNT (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween20).
  7. Bloquer jusqu'à 1 ml de solution de blocage (commercial ou sérum de 10% et 2% BSA) pendant 1 h à température ambiante.
  8. Incuber toute la nuit dans un anticorps primaire dilué dans 1 % de sérum ou une solution de blocage à 4 oC.
  9. Laver cinq fois dans jusqu'à 1 ml de tampon TNT à température ambiante.
  10. Incuber dans un anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC. Couvrir la chambre de papier d'aluminium ou utiliser un couvercle foncé.
  11. Laver cinq fois en TNT à température ambiante. Verser le dernier lavage.
  12. Monter avec 2-3 gouttes de milieu de montage et de coverslip. Laisser s'asseoir 5-10 min.
  13. Scellez le verre de couverture sur la lame à l'aide de vernis à ongles transparent. Laisser sécher complètement avant l'imagerie.

12. Documentation

  1. Enregistrez la procédure complète et toutes les déviations dans un cahier de laboratoire.
  2. Enregistrez la concentration, le nom, le numéro de catalogue, le fabricant et le numéro de lot de l'anticorps primaire.
  3. Placez l'échantillon correctement monté sur l'étape de microscope. Localiser la région d'intérêt.
  4. Sélectionnez un exemple relativement lumineux. Définir l'exposition de la caméra et de gain de sorte que le signal est suffisamment lumineux sans saturer.
  5. Comparez l'intensité de coloration d'une même région d'intérêt en utilisant les mêmes paramètres d'exposition en comparant les embryons expérimentaux étiquetés par anticorps et les embryons d'anticorps témoins (ex. IgG).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L'immunohistochimie de montage entier emploie des anticorps pour détecter le modèle spatial de l'expression de protéine dans l'animal intact. Le flux de travail de base de l'immunohistochimie (représenté à la figure 1) consiste à élever le poisson zèbre, à élever et à préparer des embryons, à bloquer les antigènes non spécifiques, à utiliser un anticorps primaire spécifique à l'antigène pour cibler la protéine d'intérêt, à détecter cet anticorps primaire avec...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L'immunohistochimie est un outil polyvalent qui peut être utilisé pour caractériser l'expression spatio-temporelle de pratiquement n'importe quelle protéine d'intérêt dans un organisme. L'immunohistochimie est utilisée sur une grande variété de tissus et d'organismes modèles. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation chez le poisson zèbre. L'immunohistochimie chez différentes espèces peut nécessiter différentes techniques de fixation et de manipulation, bloquant les solutions selon les espèces et la présence de pe...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucune information à divulguer.

Remerciements

Financement de la subvention des NIH 8P20GM103436 14.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseFisher ScientificBP160-100
Feuille d’aluminium, usage intensifKirklandToute marque peut être substituée
Anticorps anti-NMDAMillipore SigmaMAB363
Anti-phospho-histone H3 (Ser10), clone RR002Millipore Sigma05-598
Récepteur anti-pan-AMPA (GluR1-4)Millipore Sigma
Albumine sérique bovine (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Nitrate de calcium [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
Tubes à centrifuger, 1,5 mLAxygenMCT150C
Vernis à ongles transparentSally HansonTout vernis à ongles ou durcisseur peut être remplacé
Dépression (concavité) lameElectron Miscroscopy Sciences71878-01
DiaminobenzidineThermo Scientific1855920
Milieu embryonnaire, Danieau, 30%17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES dans de l’eau ultrapure.
Milieu embryonnaire, E27,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 &mu ; M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L bleu de méthylène
Porte-tube flottantThermo Scientific59744015
Microscope composé à fluorescenceLeica BiosystemsDMi8
Stéréomicroscope à fluorescenceLeica BiosystemsM165-FC
Lamelles en verre 18 mm x 18 mmCorning284518
Lamelles en verre 22 mm x 60 mmThermo Scientific22-050-222
Lames en verreFisher Scientific12-544-4
GlycérolFisher ScientificBP229-1
Chèvre anti-souris IgG Alexa 488InvitrogenA11001
HEPES solutionSigma AldrichH0887
Chambre humide avec couvercleSimportM920-2
Peroxyde d’hydrogène, 30 %Fisher ScientificH325-500
Immunedge pap penVector labsH-4000
Épingles à insectes, taille 00Stoelting5213323
Sulfate de magnésium (MgSO4 · ; 7H2O)Sigma Aldrich63138
Filtre à maillesOneida N’importequelle marque peut être substituée
MéthanolSigma Aldrich34860
Bleu de méthylèneSigma AldrichM9140
Serrure à capuchon de micro-tubeResearch Products International145062
Four à micro-ondesToastmaster
Mouse IgGSigma AldrichI8765
Sérum de chèvre normalMillipore SigmaS02L1ML
Mélangeur à nutationFisher Scientific88-861-044
ParaformaldéhydeFisher Scientific04042-500
Pipettes PasteurFisher Scientific13-678-20C
PBTriton1 % TritonX-100 en 1x PBS
Permount support de montageFisher ChemicalSP15-500
Boîte de Pétri (verre)Pyrex3160100
Boîte de Pétri (plastique)Fisher ScientificFB0875713
1-phényle 2-thiouréeAcrosOrganics 207250250
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10x, pH 7,4Gibco70011-044
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x1x fabriquée à partir de 10x de stock dilué dans dH2
O Chlorure de potassium (KCl)Sigma AldrichP9333
Hydroxyde de potassium (KOH)FisherP250-500
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PronaseSigma Aldrich10165921001
Proteinase KInvitrogenAM2544
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma AldrichS7653
Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)Sigma AldrichS7907
Réservoir de reproduction avec couvercle et insertAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + diapositivesFisher Scientific12-550-15
Superglue gel3M Scotch
TNT100 mM Tris, pH 8,0 ; 150 mM de NaCl ; 0,1 % préadolescents20 ; fabriqué en dH2O
Pipette de transfertFisher13-711-7M
Acide trichloracétique (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris BaseFisherScientific S374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
Pince ultrafineFisher Scientific16-100-121
Eau, ultrapure/double distillationFisher ScientificW2-20
MABN832

Références

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376(2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991(2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713(2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Expression protéiquemicroscopie confocalemarquage aux anticorpsfixation des tissussolution de blocageanticorps secondairestratégies de montagedétection de la fluorescence
Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.