Method Article

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les facteurs de transcription peuvent modifier l’expression de nombreux gènes cibles qui influencent une variété de processus en aval, ce qui en fait de bonnes cibles pour les thérapies anticancéreuses. Cependant, le ciblage direct des facteurs de transcription est souvent difficile et peut causer des effets secondaires indésirables si le facteur de transcription est nécessaire dans un ou plusieurs tissus adultes. Identifier les régulateurs en amont qui activent aberrantement les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses offre une alternative plus faisable, en particulier si ces protéines sont faciles à droguer. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour combiner les bibliothèques de lentiviral à moyenne échelle et un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Notre approche offre un moyen rapide, facile et peu coûteux de tester des centaines de gènes dans une seule expérience. Pour démontrer l’utilisation de cette approche, nous avons effectué un écran d’une bibliothèque RNAi lentiviral à la sélection contenant plusieurs régulateurs de protéines associées au Oui (YAP) et co-activateur transcriptionnel avec le motif de liaison PDZ (TAZ), deux co-activateurs transcriptionnels qui sont les effecteurs en aval de la voie Hippo. Toutefois, cette approche pourrait être modifiée pour dépister les organismes de réglementation de pratiquement n’importe quel facteur de transcription ou co-facteur et pourrait également être utilisée pour filtrer les bibliothèques CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de cet essai est d’utiliser des bibliothèques virales pour identifier les organismes de réglementation des facteurs de transcription d’une manière relativement rapide et peu coûteuse. L’activité transcriptionnelle aberrante est associée au cancer et aux métastases1,2,3,4,5,6, ainsi cibler des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses est une approche thérapeutique prometteuse. Cependant, les facteurs de transcription sont souvent difficiles à cibler pharmacologiquement7 et beaucoup sont nécessaires pour la fonction cellulaire normale dans les tissus adultes8,9,10. Cibler les voies associées au cancer qui activent aberrantement les facteurs de transcription pour conduire la maladie est une approche plus faisable avec le potentiel d’avoir des effets secondaires moins graves. La disponibilité commerciale des bibliothèques RNAi lentiviral et rétroviral à réseau, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF permet aux chercheurs de tester l’importance de nombreux gènes dans une seule expérience. Cependant, une lecture fiable pour l’activité transcriptionnelle altérée est exigée.

Ici, nous décrivons l’utilisation d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase et de bibliothèques lentiviral à la rangée pour identifier les protéines qui régulent les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Dans cet essai, les shARN qui ciblent les gènes cancéreux sont livrés aux cellules cancéreuses des mammifères par transduction lentivirale et les cellules sont sélectionnées pour une intégration stable à l’aide de puromycine. Les cellules sont ensuite transfected avec une construction de journaliste qui exprime la luciferase de luciole conduite par un promoteur spécifique au facteur de transcription qui est étudié et une construction de contrôle qui exprime Renilla luciferase d’un promoteur constitutivement actif qui n’est pas sensible au facteur de transcription à l’étude. Nous démontrons cette approche avec un écran de preuve de concept pour les régulateurs de YAP et TAZ, les effecteurs en aval critiques de la voie Hippo8,10,11. L’activité anormale de YAP et TAZ favorise plusieurs étapes de la cascade métastatique11 et est observée dans de nombreux cancers11,12,13. Cependant, la façon dont YAP et TAZ deviennent activés aberrantement dans certaines cellules cancéreuses n’est pas encore entièrement comprise. YAP et TAZ ne lient pas l’ADN, mais sont plutôt recrutés pour les promoteurs par d’autres facteurs de transcription. Les membres de la famille de facteurs de transcription du domaine TEA (TEAD) sont les principaux partenaires contraignants de YAP et de TAZ, et sont essentiels pour la plupart des fonctions dépendantes du YAP et de la TAZ. Notre construction reporter exprime luciferase luciole d’un promoteur YAP/TAZ-TEAD-sensible et des études précédentes ont démontré qu’il détecte fidèlement les changements dans YAP-TEAD et TAZ-TEAD activité transcriptionnelle2,14,15.

Notre approche est rapide, à débit moyen, et ne nécessite pas d’installations de dépistage, de robots automatisés ou de séquençage profond des bibliothèques mises en commun. Les coûts sont relativement bas et il y a de nombreuses bibliothèques disponibles dans le commerce à choisir. L’équipement et les réactifs requis sont également relativement standard dans la plupart des laboratoires. Il peut être utilisé pour dépister les régulateurs de pratiquement n’importe quel facteur de transcription si un journaliste basé sur la luciferase existe ou est généré. Nous utilisons cette approche pour dépister les shARN dans les cellules cancéreuses, mais toute lignée cellulaire qui peut être transfected avec une efficacité raisonnable pourrait être utilisé avec n’importe quel type de bibliothèque à réseau.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Un résumé schématique de ce protocole est présenté à la figure 1.

1. Préparation de la bibliothèque vectorielle lentiviral

REMARQUE : L’écran démontré a utilisé une bibliothèque de shRNA à bord achetée sous forme de stocks de glycérol dans des plaques de 96 puits, mais les bibliothèques peuvent également être assemblées manuellement en fonction d’une liste de candidats. Les contrôles appropriés doivent être pris en considération et inclus dans n’importe quelle bibliothèque. Cela comprend un shRNA de contrôle non-ciblage (shNTC), un shRNA de contrôle ciblant le facteur de transcription à l’étude, et si possible, un shRNA ciblant luciferase de luciole de pompier.

  1. Ajouter 1,3 ml de Luria Broth (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% d’extrait de levure, 1% de NaCl, pH 7,5) contenant 100 g/mL d’ampicilline à chaque puits d’une plaque de puits de 96 puits de profondeur. Inoculer chaque puits avec 2 L de bouillon de glycérol et croître à 37 oC pendant la nuit avec agitation constante à 225 tr/min.
  2. Transférer chaque culture bactérienne dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml et pelleter les bactéries par centrifugation à 21 000 x g à 4 oC pendant 10 min.
  3. Purifiez chaque vecteur à l’aide d’un mini-kit de mini-préparation bactérien en suivant le protocole du fabricant.
  4. Déterminer la concentration de chaque vecteur à l’aide d’un spectrophotomètre.
  5. Rangez les plasmides à -20 oC.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Emballage de la bibliothèque lentiviral à la brochette

REMARQUE : Tous les travaux impliquant le lentivirus, y compris l’emballage, l’infection et la culture subséquente des cellules infectées devraient suivre strictement les règles et règlements institutionnels de biosécurité.

  1. Étendre les cellules 293FT à l’aide de supports de croissance complets (du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4 mM L-glutamine, 4 500 mg/L de glucose et de pyruvate de sodium, complétés par un sérum bovin fœtal de 10 % (FBS), 100 unités/mL de pénicilline, un antibiotique de streptomycine de 100 g/mL et une lf-glutamine de 2 mM).
  2. Pour chaque vecteur de la bibliothèque de l’étape 1.4, semez un puits de 24 ans avec 1 x 105 cellules 293FT.
    REMARQUE : Il est recommandé que certains puits supplémentaires d’un vecteur viral de contrôle soient emballés et utilisés pour tester le titer du virus avant de passer à l’étape 3 (voir ci-dessous).
  3. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
    REMARQUE : Un protocole général pour l’emballage lentivirus qui a été décrit précédemment14 a été réduit à 24 puits pour ce protocole. Il utilise psPAX2 pour l’emballage lentiviral et VSVG comme protéine de couche. Si le virus ectropique est désiré, un vecteur de livraison Eco peut être utilisé au lieu de VSVG. Il est fortement recommandé que ce protocole soit optimisé pour atteindre un titer viral qui donne entre 30%-70% d’efficacité d’infection des cellules cibles (voir Discussion). Voir le tableau supplémentaire 1 pour une liste de tous les vecteurs utilisés.
  4. Configurez un mélange de transfection pour chaque vecteur viral de l’étape 1.4 tel que décrit ci-dessous. Chaque transfection doit contenir 250 ng du vecteur viral, 125 ng de psPAX2, 125 ng de VSVG, 1,25 l de réagent transfection 1 et 23,75 l de tampon transfection (voir Tableau des matériaux).
    1. Diluer chaque vecteur lentiviral à 50 ng/L avec de l’eau sans nucléase, puis transférer 5 L (250 ng) dans un puits d’une plaque PCR de 96 puits.
    2. Faire le super mélange transfection en mélangeant 1,25 L X de réagement transfection 1 et 23,75 L -L de tampon transfection pré-réchauffé où "X" est le nombre total de transfections plus plusieurs extras pour tenir compte de la perte de volume pendant le tuyautage.
    3. Incuber le super mélange transfection à température ambiante pendant 5 min.
    4. Ajoutez 125 ng X de psPAX2 et 125 ng - X de VSVG au tube de super mix transfection de l’étape 2.4.3 et doucement pipet de haut en bas pour mélanger. Procédez rapidement à l’étape 2.4.5.
    5. Alocalisez immédiatement le mélange de l’étape 2.4.4 dans chaque tube d’une bande PCR, puis utilisez la pipette multicanal pour transférer le mélange de 25 ll dans chaque vecteur viral contenant un puits de l’étape 2.4.1.
    6. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
    7. Transférer les 30 L de chaque puits de 96 à partir de l’étape 2.4.6 dans un puits de 24-puits contenant 293 cellules FT de l’étape 2.3.
  5. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h, puis remplacer les médias dans chaque puits de la plaque de 24 puits avec 500 l de nouveaux supports de croissance complète. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour un autre 24 h.
  6. À l’aide d’une pipette multicanal, collectez le supernatant viral de chaque puits et aliquot 220 L (assez pour 1 infection dans l’étape 3 plus un peu de volume supplémentaire) en deux 96 puits chacun. Ce sont les plaques virales supernatants.
  7. Rangez les plaques supernatantes virales à -80 oC.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Il est également recommandé de tester une partie du virus de contrôle supplémentaire qui a été emballé (voir ci-dessus) sur les cellules à infecter avant de passer à l’étape 3. Il s’agit de s’assurer que le titer est suffisant pour atteindre au moins 30% d’efficacité d’infection.

3. Infection des cellules pour l’écran

REMARQUE : Des cellules humaines de mélanome (A375) ont été employées pour démontrer cette approche, mais cette méthode peut être appliquée à toutes les cellules adhérentes qui infectent avec le lentivirus. Cependant, la culture cellulaire et les conditions de placage doivent être optimisées pour chaque lignée cellulaire (voir Discussion).

  1. Étendre les cellules à être infectées dans les médias de croissance complète.
  2. Graines plaques de 24 puits avec 1 x 105 cellules dans 0,5 ml de support de croissance complète par puits. Le premier puits de semence pour chaque vecteur viral doit être testé (y compris les contrôles) et inclure un puits supplémentaire qui ne sera pas infecté qui servira de contrôle pour la sélection des médicaments à l’étape 3.7.
  3. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
  4. Infectez chaque puits de l’étape 3.2 avec un supernatant viral différent du supernatant lentiviral à la broche congelée comme suit.
    1. Préparer un support de croissance complet qui contient 20 g/mL polybrene.
    2. Décongeler les supernatants de bibliothèque lentiviral à la carte de l’étape 2.7 à la température ambiante.
    3. Aspirez les supports de croissance des plaques de 24 puits de l’étape 3.2 et ajoutez immédiatement 200 L de supports de croissance contenant du polybrene à chaque puits.
    4. À l’aide d’une pipette multicanal, transférez 200 L de supernatant viral de chaque puits 96 de l’étape 3.4.2 aux 24 puits de l’étape 3.4.3.
  5. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 - 48 h.
    REMARQUE : Certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter plus de 24 h pour exprimer les shARN et devenir résistantes à la puromycine. Le vecteur viral utilisé ici délivre un Turbo-GFP-IRES-puroR avec un shRNA miR30 dans le 3'UTR de puroR (Figure 1). L’efficacité et l’expression de l’infection du gène de résistance de puromycine et du shRNA ont été surveillées par protéine fluorescente verte.
  6. Préparer un support de croissance complet qui contient 2,5 g/mL puromycine.
    REMARQUE : La concentration de sélection de puromycine varie d’une lignée cellulaire à l’autre. Il est recommandé qu’une courbe antibiotique de tuer soit effectuée pour chaque lignée cellulaire à être analysée avant l’écran.
  7. Aspirez les médias de chaque puits et remplacez par 500 L de puromycine contenant un support de croissance complète.
    REMARQUE : Assurez-vous également d’ajouter de la puromycine à un puits de contrôle non infecté qui peut être utilisé dans les étapes suivantes pour s’assurer que la sélection de puromycine est terminée.
  8. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 48 h.
    REMARQUE : Il est préférable de sélectionner pour 48 h, de sorte que la densité de placage et le titer viral doivent être optimisés de sorte que les cellules ne sont pas trop influentes avant 48 h.
  9. Assurez-vous que les cellules infectées sont vertes sous le microscope fluorescent, et que les cellules d’un contrôle non infecté bien traités par puromycine sont toutes mortes avant de passer à l’étape 4.

4. Cellules d’ensemencement pour la transfection du journaliste dual-luciferase

REMARQUE : Une transfection d’essai doit être effectuée pour déterminer la densité optimale d’ensemencement pour chaque nouvelle lignée cellulaire.

  1. Trypsinize chaque puits de l’étape 3.9 et transférer environ 1 x 105 cellules dans des puits à la position correspondante sur la nouvelle plaque de 24 puits comme suit.
    REMARQUE : Ce protocole est conçu pour le dépistage des bibliothèques avec des centaines de shRNAs de sorte qu’il n’est pas possible de compter tous les puits de cellules infectées. Par conséquent, les étapes ci-dessous ont été utilisées pour estimer le nombre de cellules dans chaque puits pour aider à assurer une densité de placage à peu près égale.
    1. Regroupez les puits de l’étape 3.9 en 3 - 4 groupes de telle sorte que tous les puits d’un groupe ont une densité cellulaire similaire.
    2. Trypsinize 1 représentant bien de chaque groupe avec 200 L de trypsin-EDTA (1x PBS complété avec 0,5 mM EDTA et 0,1% trypsin) pour 5 min à 37 oC. Ensuite, neutralisez la trypsine-EDTA en ajoutant 400 L de puromycine contenant des supports de croissance complets.
    3. Comptez chaque représentant bien pour déterminer le nombre total de cellules et diluer la suspension cellulaire de chaque puits représentatif à 2 x 105 cellules/mL de l’utilisation de supports de croissance complète.
    4. Graine de 0,5 mL (1 x 105 cellules) de chaque puits de l’étape 4.1.3 dans la position correspondante sur une nouvelle plaque de 24 puits et incuber cette nouvelle plaque de 24 puits à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
    5. Pour chaque groupe de l’étape 4.1.1, utilisez le nombre total de cellules déterminé dans l’étape 4.1.3 pour calculer le volume de trypsin-EDTA à ajouter à chaque puits de sorte que la suspension cellulaire résultante sera de 1 x 106 cellules/mL.
    6. Ajouter le volume approprié de trypsin-EDTA à chaque puits et incuber pendant 5 min à 37 oC.
      REMARQUE : Pour un écran plus grand, il est recommandé que les plaques de 24 puits soient trypsinisées et republiées en groupes plutôt que toutes à la fois pour assurer la viabilité des cellules.
    7. Pendant l’incubation ci-dessus, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 400 L de puromycin contenant des supports de croissance complète aux puits correspondants sur une nouvelle plaque de 24 puits.
    8. Transférer 100 L de suspension cellulaire (environ 1 x 105 cellules) de chaque puits à la position correspondante sur les nouvelles plaques de 24 puits préparées dans l’étape 4.1.7.
    9. Répétez les étapes 4.1.6 à 4.1.8 pour toutes les plaques de puits groupés de l’étape 4.1.1, une plaque à la fois.
  2. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.

5. Transfection du journaliste dual-luciferase

  1. Transfect chaque puits de l’étape 4.2 avec le journaliste dual-luciferase construit comme suit.
    REMARQUE : La quantité totale d’ADN et le rapport optimal du vecteur de la luciferase de luciferase de luciferase pour commander le vecteur de rennière luciferase doivent être déterminés avant de commencer cet essai. Ici, 400 ng d’un mélange d’ADN qui contient 20 pièces de luciferase journaliste luciferase et 1 partie de contrôle Renilla luciferase a été utilisé.
    1. Faire le mélange de dilution transfection (Tube A) et le mélange de dilution reporter (Tube B) en mélangeant les volumes indiqués de chaque réactif(tableau 1) multiplié par le nombre total de transfections (plus plusieurs extras).
      REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour le réactif transfection 2 (voir Tableau des matériaux). Si un réactif transfection différent est utilisé, la transfection doit être optimisée avant cette étape.
    2. Mélanger le mélange de dilution transfection (Tube A) avec le mélange de dilution reporter (Tube B) et incuber à température ambiante pendant 15 minutes pour produire le mélange transfection.
    3. Pendant l’incubation ci-dessus, rincez chaque puits de 24 puits à partir de l’étape 4.2 avec 0,25 ml de saline tampon de phosphate (PBS), et ajoutez 447 L de support de croissance complète à chaque puits.
    4. Après l’incubation de 15 min, utilisez une pipette multicanal pour distribuer 53 L de mélange transfection à chaque puits des plaques de 24 puits.
  2. Incuber les cellules à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.

6. Quantification de l’activité dual-luciferase

  1. Mesurez l’activité de luciferase à l’aide d’un lecteur de plaque et d’un kit d’analyse double-luciferase reporter tel que décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour le kit d’analyse du journaliste indiqué (voir tableau des matériaux) et suit le protocole recommandé par le fabricant.
    1. Préparer suffisamment de tampon de lyse passive 1x pour tous les puits plus plusieurs extras (75 l est nécessaire par puits) en diluer 5x tampon de lyse passive (fourni en kit) 1 à 5 avec de l’eau déionisée. Dégelez également le réactif A et le réactif B Buffer (fourni en kit, 100 l’un de chacun est nécessaire pour chaque puits).
    2. Aspirez les médias de chaque puits de la plaque de 24 puits de l’étape 5.2.
    3. Ajouter 75 L de tampon de lyse passive de 1x à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes avec des secousses occasionnelles.
    4. Préparer le réactif B en dilant le substrat B de 50x (fourni en kit) 1:50 avec tampon de réactif B décongelé.
    5. Ajouter 30 L de tampon de lyse passive de 1x à 4 puits pour l’effacement (voir tableau supplémentaire 2).
    6. Transférer 30 L de lysate de l’étape 6.1.3 dans des puits en double d’une plaque d’essai blanche à fond plat de 96 puits.
    7. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 L de réactif A à chaque puits et lisez le signal de luciferase de la luciole avec un lecteur de plaque.
    8. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 L de réactif B de l’étape 6.1.4 à chaque puits et lisez le signal renmélement luciferase avec un lecteur de plaque.
  2. Traiter les données brutes comme suit (pour une description détaillée, voir tableau supplémentaire 2).
    1. Exclure les échantillons avec le signal très faible de renilla luciferase car de faibles valeurs indiquent que la construction virale était toxique ou que trop peu de cellules transfected ont été analysées.
      REMARQUE : Comme expliqué dans la discussion, le signal de luciferase de Renilla de manière significative « faible » peut avoir comme conséquence des résultats anormaux. Ici, les puits dans lesquels le signal de la luciferase renillailla était plus d’un écart standard inférieur à la moyenne ont été exclus (voir tableau supplémentaire 2). Ceci a été basé sur des études précédentes exécutées utilisant ce système de reporter dans ces cellules14, mais peut différer dans d’autres lignées cellulaires.
    2. Normaliser la valeur luciferase de luciferase brute de chaque puits à la valeur brute Renilla luciferase du même puits pour obtenir le rapport luciole/Renilla.
    3. Moyenne des rapports luciole /Renilla de tous les puits de contrôle de reproduction, puis diviser le rapport luciole /Renilla de tous les autres bien par ce nombre pour obtenir un changement de pli.
    4. Attribuez l’échantillon de contrôle et définissez sa valeur de rapportfirefly/Renilla à 1.
    5. Moyenne des rapports luciole/Renilla des puits en double et de la parcelle avec l’écart standard.
      REMARQUE : L’écart standard n’est pas utilisé pour l’analyse statistique, mais plutôt comme un moyen d’identifier les puits où les répliques diffèrent considérablement.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Notre construction de reporter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contient un promoteur SV-49 minimal avec 5 répétitions de l’élément de liaison canonique TEAD (MCAT)15 conduisant le gène luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de la luciole(figure 1...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous démontrons une approche pour le dépistage à débit moyen des bibliothèques virales de gamme en combinaison avec un essai de journaliste transcriptionnel à double base de luciferase qui peut être employé pour identifier et tester de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription. Il est essentiel de caractériser et d’optimiser le système de reporter pour chaque ligne cellulaire avant n’importe quel écran. Des expériences devraient être faites pour confirmer que le journaliste est sensible à l’act...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Emily Norton et Mikaelan Cucciarre-Stuligross d’avoir participé à la préparation des vecteurs de shRNA. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention Susan G. Komen Career Catalyst qui a été décernée à J.M.L. (#CCR17477184).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,0 ml Plaque de polypropylène à 96 puits profondsUSA Scientific1896-2000Pour mini-préparation bactérienne
Trypsine - 2,50 %Gibco15090-046Composant de la trypsine-EDTA Plaque d’essai
blanche à fond plat à 96 puitsCorning3922double luciférase
Ampicilline - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAPour mini-préparation bactérienne
Bacto-tryptone - poudreSigma-Aldrich95039Composant du bouillon LB Système de
dosage à double rapporteur de luciférase, qui comprend le réactif LAR II (réactif A), Stop & substrat Glo (substrat réactif B) et Stop & Tampon Glo (tampon réactif B) - KitPromegaE1960Pour dosage à double luciférase
saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium, magnésium et rouge de phénol - 9,6 g/LHimediaTS1006Pour PBS
EDTA - 0,5 MVWR97061-406Composant de la trypsine-EDTA
Éthanol - 100 %Pharmco-AAPER111000200Pour mini-préparation bactérienne
Fœtale Sérum bovin - 100 %VWR97068-085Composant du milieu de croissance complet
Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268En cas d’infection virale
HyClone DMEM/Hyperglycémie - 4 mM L-Glutamine ; 4500 mg/L de glucose ; pyruvate de sodiumGE Healthcare life sciencesSH30243.01Composant du milieu de croissance
complet I3-P/i3 Microplaque multimode/EADispositifs moléculairesPour le dosage de la luciférase double
BDHBDH9286Composant du bouillon LB
Spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop One MicrovolumeThermo scientificPour la mesure de la concentration d’ADN vectoriel
Opti-MEM (Tampon de transfection) - 100 %Gibco31985-062Pour les transfections
Pénicilline Streptomycine - 10 000 Unité/ml (Pénicilline) ; 10 000 & micro ; g/ml (Streptomycine)Gibco15140-122Composant d’un milieu de croissance complet
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - KitThermo Fisher ScientificK210010Pour mini-préparation bactérienne
Puromycine - 2,5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Pour la sélection d’antibiotiques après infection
TC20 compteur de cellules automatiséBio-RadPour le comptage de cellules
Réactif de transfection d’ADN X-tremeGENE 9 (Réactif de transfection 1) - 100 %Roche6365787001Pour l’emballage de virus
Extrait de levure - poudreVWRJ850Composant du bouillon LB
P3000 (Réactif de transfection 3) - 100 %Life technologiesL3000008Pour les transfections
Pour le dosage de la Solution L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Composant du milieu de croissance complet Lipofectamine 3000 (Réactif de transfection 2) - 100 %Life technologies L3000008 Pour les transfections Biologie moléculaire Eau - 100 %VWR 02-0201-0500 Pour la dilution du vecteur shRNA pour l’emballage du virus NaCl - poudre

References

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