Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Summary

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Abstract

Les facteurs de transcription peuvent modifier l’expression de nombreux gènes cibles qui influencent une variété de processus en aval, ce qui en fait de bonnes cibles pour les thérapies anticancéreuses. Cependant, le ciblage direct des facteurs de transcription est souvent difficile et peut causer des effets secondaires indésirables si le facteur de transcription est nécessaire dans un ou plusieurs tissus adultes. Identifier les régulateurs en amont qui activent aberrantement les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses offre une alternative plus faisable, en particulier si ces protéines sont faciles à droguer. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour combiner les bibliothèques de lentiviral à moyenne échelle et un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Notre approche offre un moyen rapide, facile et peu coûteux de tester des centaines de gènes dans une seule expérience. Pour démontrer l’utilisation de cette approche, nous avons effectué un écran d’une bibliothèque RNAi lentiviral à la sélection contenant plusieurs régulateurs de protéines associées au Oui (YAP) et co-activateur transcriptionnel avec le motif de liaison PDZ (TAZ), deux co-activateurs transcriptionnels qui sont les effecteurs en aval de la voie Hippo. Toutefois, cette approche pourrait être modifiée pour dépister les organismes de réglementation de pratiquement n’importe quel facteur de transcription ou co-facteur et pourrait également être utilisée pour filtrer les bibliothèques CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.

Introduction

Le but de cet essai est d’utiliser des bibliothèques virales pour identifier les organismes de réglementation des facteurs de transcription d’une manière relativement rapide et peu coûteuse. L’activité transcriptionnelle aberrante est associée au cancer et aux métastases^1,2,3,4,5,6, ainsi cibler des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses est une approche thérapeutique prometteuse. Cependant, les facteurs de transcription sont souvent difficiles à cibler ph....

Protocol

REMARQUE : Un résumé schématique de ce protocole est présenté à la figure 1.

1. Préparation de la bibliothèque vectorielle lentiviral

REMARQUE : L’écran démontré a utilisé une bibliothèque de shRNA à bord achetée sous forme de stocks de glycérol dans des plaques de 96 puits, mais les bibliothèques peuvent également être assemblées manuellement en fonction d’une liste de candidats. Les contrôles appropriés doivent être pris en considération et inclus dans n’importe quelle bibliothèque. Cela comprend un shRNA de contrôle non-ciblage (shNTC), un shRNA de contrôle ciblant le facteur de tra....

Results

Notre construction de reporter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-49^2,14,15) contient un promoteur SV-49 minimal avec 5 répétitions de l’élément de liaison canonique TEAD (MCAT)¹⁵ conduisant le gène luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de la luciole(figure 1.......

Discussion

Dans cette étude, nous démontrons une approche pour le dépistage à débit moyen des bibliothèques virales de gamme en combinaison avec un essai de journaliste transcriptionnel à double base de luciferase qui peut être employé pour identifier et tester de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription. Il est essentiel de caractériser et d’optimiser le système de reporter pour chaque ligne cellulaire avant n’importe quel écran. Des expériences devraient être faites pour confirmer que le journaliste est sensible à l’act.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,0 ml Plaque de polypropylène à 96 puits profonds	USA Scientific	1896-2000	Pour mini-préparation bactérienne
Trypsine - 2,50 %	Gibco	15090-046	Composant de la trypsine-EDTA Plaque d’essai
blanche à fond plat à 96 puits	Corning	3922	double luciférase
Ampicilline - 100 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-10835242001-EA	Pour mini-préparation bactérienne
Bacto-tryptone - poudre	Sigma-Aldrich	95039	Composant du bouillon LB Système de
dosage à double rapporteur de luciférase, qui comprend le réactif LAR II (réactif A), Stop & substrat Glo (substrat réactif B) et Stop & Tampon Glo (tampon réactif B) - Kit	Promega	E1960	Pour dosage à double luciférase
saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium, magnésium et rouge de phénol - 9,6 g/L	Himedia	TS1006	Pour PBS
EDTA - 0,5 M	VWR	97061-406	Composant de la trypsine-EDTA
Éthanol - 100 %	Pharmco-AAPER	111000200	Pour mini-préparation bactérienne
Fœtale Sérum bovin - 100 %	VWR	97068-085	Composant du milieu de croissance complet
Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene) - 8 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-H9268	En cas d’infection virale
HyClone DMEM/Hyperglycémie - 4 mM L-Glutamine ; 4500 mg/L de glucose ; pyruvate de sodium	GE Healthcare life sciences	SH30243.01	Composant du milieu de croissance
complet I3-P/i3 Microplaque multimode/EA	Dispositifs moléculaires	Pour le dosage de la luciférase double
	BDH	BDH9286	Composant du bouillon LB
Spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop One Microvolume	Thermo scientific		Pour la mesure de la concentration d’ADN vectoriel
Opti-MEM (Tampon de transfection) - 100 %	Gibco	31985-062	Pour les transfections
Pénicilline Streptomycine - 10 000 Unité/ml (Pénicilline) ; 10 000 & micro ; g/ml (Streptomycine)	Gibco	15140-122	Composant d’un milieu de croissance complet
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit	Thermo Fisher Scientific	K210010	Pour mini-préparation bactérienne
Puromycine - 2,5 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-P7255	Pour la sélection d’antibiotiques après infection
TC20 compteur de cellules automatisé	Bio-Rad		Pour le comptage de cellules
Réactif de transfection d’ADN X-tremeGENE 9 (Réactif de transfection 1) - 100 %	Roche	6365787001	Pour l’emballage de virus
Extrait de levure - poudre	VWR	J850	Composant du bouillon LB
P3000 (Réactif de transfection 3) - 100 %	Life technologies	L3000008	Pour les transfections