Article de méthode

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

DOI :

10.3791/60582

⸱

27 mars 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Dans cet article

Résumé

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Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Résumé

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Les facteurs de transcription peuvent modifier l’expression de nombreux gènes cibles qui influencent une variété de processus en aval, ce qui en fait de bonnes cibles pour les thérapies anticancéreuses. Cependant, le ciblage direct des facteurs de transcription est souvent difficile et peut causer des effets secondaires indésirables si le facteur de transcription est nécessaire dans un ou plusieurs tissus adultes. Identifier les régulateurs en amont qui activent aberrantement les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses offre une alternative plus faisable, en particulier si ces protéines sont faciles à droguer. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour combiner les bibliothèques de lentiviral à moyenne échelle et un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Notre approche offre un moyen rapide, facile et peu coûteux de tester des centaines de gènes dans une seule expérience. Pour démontrer l’utilisation de cette approche, nous avons effectué un écran d’une bibliothèque RNAi lentiviral à la sélection contenant plusieurs régulateurs de protéines associées au Oui (YAP) et co-activateur transcriptionnel avec le motif de liaison PDZ (TAZ), deux co-activateurs transcriptionnels qui sont les effecteurs en aval de la voie Hippo. Toutefois, cette approche pourrait être modifiée pour dépister les organismes de réglementation de pratiquement n’importe quel facteur de transcription ou co-facteur et pourrait également être utilisée pour filtrer les bibliothèques CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.

Introduction

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Le but de cet essai est d’utiliser des bibliothèques virales pour identifier les organismes de réglementation des facteurs de transcription d’une manière relativement rapide et peu coûteuse. L’activité transcriptionnelle aberrante est associée au cancer et aux métastases1,2,3,4,5,6, ainsi cibler des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses est une approche thérapeutique prometteuse. Cependant, les facteurs de transcription sont souvent difficiles à cibler ph....

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Protocole

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REMARQUE : Un résumé schématique de ce protocole est présenté à la figure 1.

1. Préparation de la bibliothèque vectorielle lentiviral

REMARQUE : L’écran démontré a utilisé une bibliothèque de shRNA à bord achetée sous forme de stocks de glycérol dans des plaques de 96 puits, mais les bibliothèques peuvent également être assemblées manuellement en fonction d’une liste de candidats. Les contrôles appropriés doivent être pris en considération et inclus dans n’importe quelle bibliothèque. Cela comprend un shRNA de contrôle non-ciblage (shNTC), un shRNA de contrôle ciblant le facteur de tra....

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Résultats

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Notre construction de reporter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contient un promoteur SV-49 minimal avec 5 répétitions de l’élément de liaison canonique TEAD (MCAT)15 conduisant le gène luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de la luciole(figure 1.......

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Discussion

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Dans cette étude, nous démontrons une approche pour le dépistage à débit moyen des bibliothèques virales de gamme en combinaison avec un essai de journaliste transcriptionnel à double base de luciferase qui peut être employé pour identifier et tester de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription. Il est essentiel de caractériser et d’optimiser le système de reporter pour chaque ligne cellulaire avant n’importe quel écran. Des expériences devraient être faites pour confirmer que le journaliste est sensible à l’act.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Emily Norton et Mikaelan Cucciarre-Stuligross d’avoir participé à la préparation des vecteurs de shRNA. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention Susan G. Komen Career Catalyst qui a été décernée à J.M.L. (#CCR17477184).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,0 ml Plaque de polypropylène à 96 puits profondsUSA Scientific1896-2000Pour mini-préparation bactérienne
Trypsine - 2,50 %Gibco15090-046Composant de la trypsine-EDTA Plaque d’essai
blanche à fond plat à 96 puitsCorning3922double luciférase
Ampicilline - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAPour mini-préparation bactérienne
Bacto-tryptone - poudreSigma-Aldrich95039Composant du bouillon LB Système de
dosage à double rapporteur de luciférase, qui comprend le réactif LAR II (réactif A), Stop & substrat Glo (substrat réactif B) et Stop & Tampon Glo (tampon réactif B) - KitPromegaE1960Pour dosage à double luciférase
saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium, magnésium et rouge de phénol - 9,6 g/LHimediaTS1006Pour PBS
EDTA - 0,5 MVWR97061-406Composant de la trypsine-EDTA
Éthanol - 100 %Pharmco-AAPER111000200Pour mini-préparation bactérienne
Fœtale Sérum bovin - 100 %VWR97068-085Composant du milieu de croissance complet
Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268En cas d’infection virale
HyClone DMEM/Hyperglycémie - 4 mM L-Glutamine ; 4500 mg/L de glucose ; pyruvate de sodiumGE Healthcare life sciencesSH30243.01Composant du milieu de croissance
complet I3-P/i3 Microplaque multimode/EADispositifs moléculairesPour le dosage de la luciférase double
BDHBDH9286Composant du bouillon LB
Spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop One MicrovolumeThermo scientificPour la mesure de la concentration d’ADN vectoriel
Opti-MEM (Tampon de transfection) - 100 %Gibco31985-062Pour les transfections
Pénicilline Streptomycine - 10 000 Unité/ml (Pénicilline) ; 10 000 & micro ; g/ml (Streptomycine)Gibco15140-122Composant d’un milieu de croissance complet
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - KitThermo Fisher ScientificK210010Pour mini-préparation bactérienne
Puromycine - 2,5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Pour la sélection d’antibiotiques après infection
TC20 compteur de cellules automatiséBio-RadPour le comptage de cellules
Réactif de transfection d’ADN X-tremeGENE 9 (Réactif de transfection 1) - 100 %Roche6365787001Pour l’emballage de virus
Extrait de levure - poudreVWRJ850Composant du bouillon LB
P3000 (Réactif de transfection 3) - 100 %Life technologiesL3000008Pour les transfections
Pour le dosage de la Solution L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Composant du milieu de croissance complet Lipofectamine 3000 (Réactif de transfection 2) - 100 %Life technologies L3000008 Pour les transfections Biologie moléculaire Eau - 100 %VWR 02-0201-0500 Pour la dilution du vecteur shRNA pour l’emballage du virus NaCl - poudre

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al.

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Mots-clés

Biblioth ques lentivirales en plaquesrapporteur double lucif raser gulation de YAP TAZcriblage de la voie Hippocriblage de biblioth que ARNiproduction de vecteurs virauxdosage de l activit lucif rases lection la puromycine

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