Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Summary

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Abstract

Le développement du système nerveux vertébré nécessite une coordination précise des comportements cellulaires complexes et des interactions. L’utilisation de techniques d’imagerie in vivo à haute résolution peut fournir une fenêtre claire sur ces processus dans l’organisme vivant. Par exemple, la division des cellules et de leur progéniture peut être suivie en temps réel au fur et à mesure que le système nerveux se forme. Ces dernières années, les progrès techniques dans les techniques multicolores ont élargi les types de questions qui peuvent être étudiées. L’approche multicolore Brainbow peut être utilisée non seulement pour distinguer entre les cellules comme, mais aussi pour code couleur plusieurs clones différents de cellules connexes que chacun dérive d’une cellule progénitrice. Cela permet une analyse de lignée multiplexe de nombreux clones différents et leurs comportements simultanément pendant le développement. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow sur le temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement. Ceci est particulièrement utile pour suivre les interactions cellulaires entre les cellules comme, qui sont difficiles à étiqueter différentiellement en utilisant des couleurs traditionnelles axées sur les promoteurs. Notre approche peut être utilisée pour suivre les relations de lignée entre plusieurs clones différents simultanément. Les grands ensembles de données générés à l’aide de cette technique fournissent des informations riches qui peuvent être comparées quantitativement à travers les manipulations génétiques ou pharmacologiques. En fin de compte, les résultats générés peuvent aider à répondre à des questions systématiques sur la façon dont le système nerveux se développe.

Introduction

Dans les premières phases du développement, les pools de cellules progénitrices spécialisées se divisent à plusieurs reprises dans les zones de prolifération, produisant divers éventails de cellules filles. Les cellules nées au cours de cette période de développement se différencieront alors et se déplaceront pour former les organes naissants. Dans le système nerveux, les ancêtres tels que les gliales radiales donnent lieu à des neurones immatures dans les zones ventriculaires. Comme les neurones migrent loin des ventricules et mûrissent, le tissu en expansion forme finalement les structures très complexes du cerveau^1,

Protocol

Les procédures relatives aux sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Lewis and Clark College.

1. Microinjection d’embryons de poissons zèbres

1. Installez le type sauvage, le poisson zèbre adulte dans les cuves d’accouplement sex-ségréguées l’après-midi avant d’effectuer des microinjections^39,40.
2. Préparer la solution d’ADN le matin des microinjections. Dilute hsp:Zebrabow¹¹ plasmid DNA to a concentration of '10 ng/'l in 0.1 mM KCl, along with 2.5% phenol red and ....

Results

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus à l’aide de l’approche d’imagerie multicolore in vivo décrite ici. Nous montrons que Brainbow clones codés en couleur de cellules dans la zone ventriculaire proliférée de l’arrière-poisson zèbre en développement¹⁴ (figure 1).

Typiquement, lorsque les cellules étiquetées Brainbow ont été disposées le long d’une fibre radiale particulière, elles partageaient la même cou.......

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser les clones de cellules progénitrices et de neurones dans le cerveau postérieur du poisson zèbre en développement et les suivre in vivo à l’aide de Brainbow et de microscopie confocale en time-lapse¹¹. Le principal avantage de ce protocole par rapport aux études in vitro ou ex vivo est la capacité d’observer directement la zone de prolifération du cerveau vertébré dans son milieu naturel au fil du temps. Cette technique s’appuie sur des études antérie.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette de transfert de 1,5 mL (pointe fine)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-phényl-2-thiourée (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Dilué à 0,2 mM dans E3 pour prévenir la pigmentation de l’embryon
50 mL tubes coniques	Corning	352070	Pour choquer la chaleur des embryons
Fil de pêche en nylon de 6 lb	SecureLine	NMT250	Pour la fabrication de manipulateurs d’embryons
Pipette de transfert de 7,5 mL	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	Pour
écouvillons de coton	Puritan	867-WC PAS DE COLLE	Pour la fabrication de manipulateurs d’embryons
Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Bain sec numérique	Genemate	490016-616	Utilisé pour stocker LMA à 42 ° ; C
Lunette de
Tubes capillaires en verre	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubateur	Forma Scientific	3158	Pour maintenir les embryons à 28 ° ; C
Moules à plaque d’injection	Outils de science adaptatifs	TU-1
Bain-marie Isotemp	Fisher Scientific	2320	Pour les embryons choquants de chaleur
KCl	AMRESCO	0395	Pour E3 et pour solution d’ADN pour injections
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	À créer Plaques d’injection d’agarose
Agarose à bas point de fusion (LMA)	AMRESCO	J234
Réservoirs d’accouplement	Aquaneering, Inc.
Bleu de méthylène	Sigma	M9140	Pour E3
MgSO4	Sigma	9397	Pour E3
Micromanipulateur	World Precision Instruments	M3301
Micropipette	Puller Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaïne-S	Western Chemical, Inc.		Pâte préparée à 4 mg/mL dans de l’eau d’osmose inverse (OI), puis ajoutée goutte à goutte à E3 jusqu’à une concentration finale de 0,2 mM pour anesthésier les embryons
NaCl	J.T. Baker	4058-01	Pour
boîtes de Pétri E3 (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	Pour loger les embryons et créer une chambre d’imagerie (60 mm)
Rouge phénol	Sigma	P0290
Marqueurs	annulaires à mailles souplesClover Needlecraft, Inc.	354	Pour la création d’une chambre d’imagerie avec une boîte de Pétri
Super colle (contrôle Ultra gel)	Loctite	1363589	Pour la fabrication de manipulateurs d’embryons
Aiguilles à seringue	Beckton Dickinson	BD329412	Pour la déchiffonnement d’embryons