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Article de méthode

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

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DOI :

10.3791/60593

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23 mars 2020

 ,  , 
1Biology Department, Lewis & Clark College

Dans cet article

Résumé

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Résumé

Le développement du système nerveux vertébré nécessite une coordination précise des comportements cellulaires complexes et des interactions. L’utilisation de techniques d’imagerie in vivo à haute résolution peut fournir une fenêtre claire sur ces processus dans l’organisme vivant. Par exemple, la division des cellules et de leur progéniture peut être suivie en temps réel au fur et à mesure que le système nerveux se forme. Ces dernières années, les progrès techniques dans les techniques multicolores ont élargi les types de questions qui peuvent être étudiées. L’approche multicolore Brainbow peut être utilisée non seulement pour distinguer entre les cellules comme, mais aussi pour code couleur plusieurs clones différents de cellules connexes que chacun dérive d’une cellule progénitrice. Cela permet une analyse de lignée multiplexe de nombreux clones différents et leurs comportements simultanément pendant le développement. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow sur le temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement. Ceci est particulièrement utile pour suivre les interactions cellulaires entre les cellules comme, qui sont difficiles à étiqueter différentiellement en utilisant des couleurs traditionnelles axées sur les promoteurs. Notre approche peut être utilisée pour suivre les relations de lignée entre plusieurs clones différents simultanément. Les grands ensembles de données générés à l’aide de cette technique fournissent des informations riches qui peuvent être comparées quantitativement à travers les manipulations génétiques ou pharmacologiques. En fin de compte, les résultats générés peuvent aider à répondre à des questions systématiques sur la façon dont le système nerveux se développe.

Introduction

Dans les premières phases du développement, les pools de cellules progénitrices spécialisées se divisent à plusieurs reprises dans les zones de prolifération, produisant divers éventails de cellules filles. Les cellules nées au cours de cette période de développement se différencieront alors et se déplaceront pour former les organes naissants. Dans le système nerveux, les ancêtres tels que les gliales radiales donnent lieu à des neurones immatures dans les zones ventriculaires. Comme les neurones migrent loin des ventricules et mûrissent, le tissu en expansion forme finalement les structures très complexes du cerveau1,2,3,4,5,6. La coordination entre la division des progéniteurs et la différenciation et la migration des neurones déterminera la taille, la forme et donc la fonction éventuelle du cerveau, ayant un impact direct sur le comportement7,8,9,10. Bien qu’un contrôle serré sur ces processus soit clairement crucial pour le développement normal du cerveau, les mécanismes mondiaux qui régulent ces dynamiques ne sont pas bien compris. Ici, nous décrivons un outil pour étudier le développement du système nerveux à une résolution cellulaire, permettant aux chercheurs de visualiser les cellules progénitrices et les neurones in vivo dans le cerveau du poisson zèbre en développement avec Brainbow et suivre leur comportement au fil du temps via la microscopie confocale en time-lapse11. L’approche peut également être adaptée pour visualiser d’autres parties de l’embryon en développement.

Pour observer et distinguer entre les cellules du cerveau du poisson zèbre en développement, nous avons adapté la technique d’étiquetage cellulaire Brainbow11. Brainbow utilise l’expression combinatoire déterminée au hasard de trois protéines fluorescentes distinctes (FPs) pour étiqueter une population de cellules. Tandis que l’expression par défaut pour l’expression de Brainbow est le dTomato rouge de FP, la recombinaination par l’enzyme Cre recombinase résulte dans l’expression du mcerulean (protéine fluorescente cyane, CFP) ou protéine fluorescente jaune (YFP)12,13. La quantité combinée de chaque FP exprimée dans une cellule lui donne une teinte unique, permettant une distinction visuelle claire des cellules voisines. En outre, quand une cellule progénitrice se divise, chaque cellule de fille héritera de la couleur de sa cellule mère, produisant des clones à code couleur et permettant aux chercheurs de tracer la lignée cellulaire11,14. Bien qu’à l’origine utilisé pour analyser les circuits neuronaux chez la souris12, Brainbow a depuis été exprimé dans une grande variété d’organismes modèles, y compris le poisson zèbre15.

Notre technique s’appuie sur les méthodes précédentes d’étiquetage et d’imagerie multicolores pour imager directement plusieurs clones à code couleur au fil du temps dans les poissons zèbres vivants. En raison de leur transparence optique en tant qu’embryons, le poisson zèbre sont bien adaptés aux expériences d’imagerie16, et des études précédentes ont utilisé Brainbow dans le poisson zèbre pour étudier une variété de tissus, y compris le système nerveux11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. La capacité d’imager directement dans l’organisme vivant, avec leur développement ex-utérus rapide, font du poisson zèbre un modèle précieux de développement des vertébrés. Contrairement au cerveau des mammifères, toute la zone de prolifération du cerveau postérieur du poisson zèbre est facilement disponible pour l’imagerie sans perturber son environnement endogène6. Cela permet de mener des expériences dans l’organisme vivant, plutôt que dans les préparations de tissus in vitro ou fixes. Contrairement aux expériences d’imagerie fixe, les études in vivo permettent une conception longitudinale, produisant des heures de données qui peuvent être analysées pour les modèles, augmentant ainsi la probabilité d’observer des événements relativement rares. Selon la vitesse et la durée des événements d’intérêt, les chercheurs peuvent choisir d’effectuer des expériences d’imagerie courte (1 à 2 h) ou longues (jusqu’à 16 h). En utilisant le promoteur de choc thermique du poisson zèbre 70 (hsp70, hsp), l’expression Brainbow peut être contrôlé temporellement28,29. En outre, l’expression mosaïque induite par ce promoteur est bien adaptée à l’étiquetage et le suivi de nombreux clones11.

La capacité d’identifier visuellement plusieurs clones dans le cerveau vivant est un avantage de cette méthode. D’importantes études antérieures qui ont étudié le rôle des clones dans le développement du système nerveux ont utilisé des vecteurs rétroviraux pour étiqueter une seule cellule progénitrice et sa progéniture à l’aide d’un seul FP ou d’une autre protéine facilement visualisée. Un tel étiquetage permet aux chercheurs d’observer un seul clone au fil du temps, in vitro ou in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Contrairement aux méthodes de suivi du comportement des cellules au sein d’un clone, les couleurs distinctes de Brainbow permettent aux chercheurs d’observer la dynamique parmi les clones. En outre, en utilisant Brainbow pour étiqueter de nombreux clones dans le cerveau, des données supplémentaires sur le comportement clonal sont recueillies par rapport aux techniques qui étiquetent un seul clone11. Fait important, les approches décrites ici peuvent être élargies pour générer des comparaisons de développement entre les poissons qui ont subi différentes manipulations génétiques ou pharmacologiques18. Dans l’ensemble, ces avantages rendent l’imagerie confocale en vivo du poisson zèbre Brainbow-exprimant idéal pour les chercheurs explorant le développement du système nerveux vertébré, en particulier ceux qui s’intéressent au rôle des clones.

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Protocole

Les procédures relatives aux sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Lewis and Clark College.

1. Microinjection d’embryons de poissons zèbres

  1. Installez le type sauvage, le poisson zèbre adulte dans les cuves d’accouplement sex-ségréguées l’après-midi avant d’effectuer des microinjections39,40.
  2. Préparer la solution d’ADN le matin des microinjections. Dilute hsp:Zebrabow11 plasmid DNA to a concentration of '10 ng/'l in 0.1 mM KCl, along with 2.5% phenol red and 3.75U Cre recombinase enzyme.
  3. Effectuez des microinjections de solution d’ADN dans des embryons de poisson zèbre à une cellule dans un rayon de 45 min de fécondation39,41. Injecter environ 4,2 nL de cette solution dans chaque embryon, soit l’équivalent de 42 pg d’ADN plasmide.
    REMARQUE: L’étape de microinjection peut être omise si une ligne transgénique, Brainbow-exprimant le poisson zèbre est accouplée à la place, comme Tg (ubi:Zebrabow)15 et Tg (neurod:Zebrabow)18. Effectuer des microinjections peut être avantageux car il permet aux chercheurs de titrer le numéro de copie et la densité d’étiquetage. En outre, une deuxième construction d’ADN qui étiquette ou manipule un produit génétique spécifique peut être injecté aux côtés de Brainbow si désiré (par exemple, une protéine fluorescente rouge foncé qui complète Brainbow18).
  4. Maintenir les embryons injectés dans les boîtes Petri de l’E3 moyen39 dans un incubateur de 28 oC pendant 24 h.

2. Choc thermique pour induire l’expression Brainbow

REMARQUE: Si l’ADN plasmide injecté ou le transgène exprimé n’utilise pas le promoteur hsp70 pour conduire l’expression, l’étape de choc thermique peut être ignorée, et les embryons sains doivent être immédiatement transférés à la phénylthiourea (PTU) à 24 h après la fécondation (hpf).

  1. À 24 hpf, abattre les embryons morts et déformés du groupe d’embryons injectés. Ensuite, transférer les embryons sains dans un tube de 50 ml, avec jusqu’à 20 embryons/tube.
  2. Remplir les tubes de 10 ml d’E3. Placer un bouchon sur chaque tube mais ne fermez pas bien.
  3. Placer la grille à tube contenant les tubes de 50 ml à la verticale dans un bain d’eau de 37 oC. Assurez-vous que le niveau d’eau dans le bain est plus élevé que le niveau de l’E3 dans les tubes et laissez-les de 80 à 90 min.
  4. Retirer la grille à tube avec les embryons du bain d’eau et retourner à l’incubateur de 28 oC à la verticale. Laisser refroidir jusqu’à 1 h pour que l’E3 refroidisse et que les embryons s’acclimatent progressivement à la température. Ensuite, transférer les embryons dans des plats Petri de 0,2 mM PTU en E3 réchauffés dans l’incubateur pour prévenir la pigmentation des embryons.
    CAUTION: PTU est un produit chimique toxique qui doit être manipulé avec soin et éliminé de façon appropriée. Le port de gants est suggéré.

3. Dépistage des embryons pour l’expression Brainbow

  1. À 2 à 4 h après le choc thermique, examinez les embryons sous un microscope standard de dissection de fluorescence pour l’expression de CFP ou YFP, qui indique la recombinaison réussie de Brainbow (de l’expression par défaut de dTomato).
    REMARQUE: Si de multiples options de filtre à fluorescence sont disponibles, le dépistage de la PCP est le moyen le plus efficace d’identifier les poissons bien recombinés. Si les filtres CFP et YFP ne sont pas disponibles, YFP peut également être faiblement visualisé sous les filtres de protéines fluorescentes vertes (GFP) en raison du chevauchement de leurs profils spectrals.
  2. Sélectionnez des embryons avec une expression FP robuste tout au long et transférer dans un plat séparé avec PTU. Imagez les embryons à 1 jour après la fécondation (dpf; 28 hpf ou plus tard) ou maintenez les embryons dans PTU et image à 2 ou 3 dpf.

4. Montage d’embryons pour l’imagerie In Vivo

  1. Avant le jour de l’expérience, préparez la chambre d’imagerie et l’outil de manipulation d’embryons.
    1. Préparer la chambre d’imagerie en supercollant soigneusement un anneau en plastique au centre d’un plat Petri de 60 mm.
    2. Optionnellement, préparez un manipulateur d’embryons sur mesure pour déplacer les embryons dans le plat et orienter les embryons tout en montant. Construisez le manipulateur en supergluant une petite ligne de pêche en nylon (1/2 à l’extrémité de 6 lb) jusqu’à l’extrémité d’un bâton de coton en bois qui a été coupé à une longueur de 4 euros.
  2. Si nécessaire (c.-à-d., imagerie à 2 dpf ou plus tôt), avant de monter les embryons déchorionate à l’aide de seringues sous un microscope à dissection.
  3. Anesthésiez les embryons de poissons zèbres.
    1. Remplissez un plat Petri de 60 mm à mi-chemin avec de l’E3 et ajoutez 5 à 6 gouttes de 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S à une concentration finale de 0,2 mM. Tourbillonnez pour mélanger.
      CAUTION: Tricaine doit être manipulé avec soin et éliminé de façon appropriée.
    2. Transférer les embryons de la PTU à la solution tricaine, en veillant à ce que le moins de PTU soit transféré le plus possible. Alors que les réflexes de poisson doivent cesser après 1-2 min, laissez les embryons en tricaine jusqu’à 10 min pour assurer une anesthésie approfondie pour les expériences d’imagerie en time-lapse.
    3. Confirmez que les embryons sont correctement anesthésiés. Évaluez le réflexe de sursaut en touchant doucement les queues de l’embryon avec le manipulateur d’embryons. Si un mouvement réflexe est observé, ajoutez une goutte supplémentaire de tricaine au plat aussi loin que possible des embryons et tourbillonnez pour mélanger. Observez la fréquence cardiaque de l’embryon sous une portée de dissection. S’il est anormalement lent, ajoutez des gouttes supplémentaires d’E3 au plat pour réduire la concentration de tricaine.
  4. Monter des embryons anesthésiés dans l’agarose.
    1. Transférer le poisson au centre de l’anneau en plastique dans la chambre d’imagerie et enlever autant d’excès d’E3 que possible à l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine.
    2. À l’aide d’une pipette de transfert propre, recouvrir le poisson d’une finerach (LMA) à faible fondre (LMA) dans l’E3 entreposée à 42 oC et remplissez l’anneau en plastique entier d’une fine couche d’agarose. Utilisez une pipette de transfert pour tirer doucement les embryons vers le haut dans la pointe de la pipette et de nouveau dans l’agarose sans introduire des bulles d’air.
    3. Avant que l’agarose durcisse, utilisez rapidement un manipulateur d’embryons pour orienter le poisson de manière appropriée. Si l’imagerie avec un microscope droit, placez les embryons aussi près que possible de la surface supérieure de l’agarose. Placez les embryons parallèlement au fond de la chambre d’imagerie avec la queue droite.
      REMARQUE: Pour l’imagerie par le cerveau postérieur, les embryons peuvent être placés dans une vue dorsale ou sagittale. Il faut veiller à ce que les têtes des embryons ne coulent pas pendant que l’agarose est encore liquide. D’autres orientations peuvent être appropriées pour cibler d’autres tissus en développement pour l’imagerie. Pour les microscopes inversés, le montage serait fait différemment, généralement en positionnant le poisson près du fond d’un plat Petri à fond de verre.
  5. Attendez que l’agarose durcisse, puis remplissez la chambre d’imagerie avec L’E3. Ajouter autant d’E3 que possible pour tenir compte de l’évaporation au cours de l’imagerie.

5. Imagerie confocale time-lapse du poisson-poisson-zèbre en développement

  1. Placez la chambre d’imagerie sur le microscope confocal en vue de l’imagerie.
    1. Placez la chambre d’imagerie avec le poisson et l’E3 au microscope confocal.
    2. Sélectionnez un objectif avec une ouverture numérique élevée et une longue distance de travail, comme un objectif d’immersion en eau 20x (1,0 NA).
    3. Trouvez une région avec un étiquetage convenablement dense et lumineux du type de cellule(s) d’intérêt.
      REMARQUE: Un stade/appareil à température contrôlée au microscope peut également être utilisé pour réguler la température et l’humidité pendant de longues séances d’imagerie. Cela peut diminuer l’évaporation.
  2. Configurez les paramètres d’acquisition pour l’imagerie Brainbow.
    1. Image de chaque canal FP séquentiellement. Si vous utilisez un logiciel commercial (par exemple, le logiciel Zen), cela se fait en préparant trois « pistes ». Utilisez un laser Argon pour exciter la PCP à 458 nm et YFP à 514 nm. Utilisez un laser DPSS 561 nm pour exciter dTomato. Collectez les émissions entre 463-509 nm pour CFP, 519-555 nm pour YFP, et 566-691 nm pour dTomato.
    2. Pour l’affichage à l’écran, codeR CFP comme bleu, YFP comme jaune, et dTomato comme rouge.
      REMARQUE: Ces paramètres varient en fonction des lignes laser et autres caractéristiques disponibles au microscope confocal. Pour augmenter la vitesse de l’imagerie, les canaux CFP et dTomato peuvent être photographiés simultanément sans saignement appréciable. Si un FP séparé est également photographié, comme un FP rouge lointain, cela peut être photographié séquentiellement ou simultanément avec YFP.
    3. Configurez les paramètres d’imagerie générale pour prendre des images 16 bits avec une résolution d’au moins 1024 x 1024 et une moyenne de deux fois. Ajuster le zoom en fonction de la région et le type d’intérêt cellulaire (c.-à-d., pour l’imagerie postérieure avec un objectif 20x le zoom variera de 1,0 à 2,5). Maximisez le champ de vision pour permettre la croissance du poisson au fil du temps.
    4. Affichage d’une piste à la fois (et éteindre d’autres lasers pour empêcher le photobleaching), optimiser les paramètres d’acquisition pour chaque FP individuellement (p. ex., puissance laser, taille de trou d’épingle, gain de tube photomultiplier, etc.).
    5. Sélectionnez la gamme Z-stack à l’image.
      REMARQUE: Pour de longues séances d’imagerie (2 h), prenez en considération que le poisson continuera à croître tout au long de l’imagerie, de ce fait que le champ XY et la gamme Z-stack devraient en tenir compte avec de la place supplémentaire. Si l’imagerie du cerveau arrière, inclure l’espace dans le champ pour le tissu de se déplacer rostrally pendant la période d’imagerie. L’espace doit également être inclus pour la croissance dans la dimension Z. Inclure dans l’image environ 10 à 20 m au-dessus de la région d’intérêt, que le poisson soit positionné pour une vue sagittale ou dorsale.
  3. Configurez des paramètres pour l’imagerie par time-lapse.
    1. Sélectionnez un intervalle de temps. La longueur d’intervalle varie entre 10-30 min pour suivre les événements mitotiques et apoptotiques dans le cerveau postérieur en développement. La longueur de l’intervalle varie en fonction de la vitesse des événements d’intérêt et du temps total qu’il faut pour capturer une seule pile Z.
    2. Sélectionnez la durée de la séance d’imagerie. Les séances d’imagerie en accéléré se produisent généralement pendant la nuit et peuvent durer au moins 16 h.
  4. Dirigez l’expérience.
    REMARQUE :     Le poisson peut être euthanasié immédiatement après l’imagerie ou soigneusement disséqué de l’agarose à l’aide de seringues et retourné à l’E3 pour récupérer. Les poissons récupérés peuvent ensuite être photographiés à nouveau à un moment ultérieur, bien que la position et la profondeur cellulaires se déplacent au cours de cette période en raison de la croissance globale.

6. Gestion des fichiers time-lapse

  1. Importer le fichier d’image dans le logiciel d’analyse.
    1. Si vous utilisez un logiciel Zen, enregistrez le fichier en format .czi une fois l’acquisition d’images terminée. Assurez-vous d’enregistrer des données brutes dans un format compatible avec Fidji42 et/ou d’autres logiciels.
    2. Importer dans le logiciel Fidji à l’aide de BioFormats Importer.
      REMARQUE: Les fichiers time-lapse seront importants et peuvent nécessiter beaucoup de temps et de mémoire pour ouvrir pour analyse. Ainsi, il est utile d’être stratégique dans la façon dont ils sont sauvés et ouverts. Il peut être utile d’enregistrer une version de moindre qualité qui peut être ouverte plus facilement à la recherche d’événements d’intérêt à l’œil.
  2. Si vous utilisez Fidji, créez des sous-ensembles plus petits et plus gérables de fichiers time-lapse. Générer des sous-ensembles soit par le temps (p. ex., en visualisant la pile Z complète au premier moment) ou par profondeur (p. ex., en visualisant les 50 premières sections Z à chaque moment) en cliquant sur Image( Piles Outils Faire Substack.

7. Analyse quantitative des couleurs clonales des images Brainbow

  1. Mesurer les valeurs d’intensité moyennes rouge, verte et bleue (RGB) pour les cellules d’intérêt aux Fidji.
    REMARQUE :     Ces instructions sont spécifiques à l’analyse d’image aux Fidji. Cependant, les chercheurs peuvent préférer obtenir des valeurs d’intensité moyenne RGB dans un logiciel alternatif.
    1. Assurez-vous que le fichier est correctement recadré de sorte qu’il n’y a pas d’espace noir sur les bords de l’image. L’espace noir permettra d’abaisser artificiellement les mesures d’intensité minimales nécessaires à l’analyse. Si le fichier doit être recadré, sélectionnez le bouton de sélection Rectangle et dessinez une zone d’intérêt (ROI) autour du champ de vision, à l’exclusion de tout espace noir. Cliquez sur l’image(fr) Récolte.
    2. Définissez l’outil de mesure pour prendre des mesures de valeur moyenne, minimale et maximale de la valeur grise. Cliquez sur Analysede l’analyse Définir les mesures. Assurez-vous que les cases à cocher pour la valeur de min et max Gray et la valeur de gris moyen sont tous deux sélectionnés.
    3. Affichage des fichiers de données brutes ou subsetted Z-stacks aux Fidji, trouver des cellules d’intérêt pour l’analyse des couleurs clonales. Dans le cerveau arrière, les clones putatifs peuvent être identifiés visuellement par leur teinte commune ainsi que leur orientation radiale. Ne sélectionnez pas les cellules qui sont en contact étroit avec, et donc difficile à résoudre à partir de, cellules voisines d’une autre couleur. Il peut être difficile de quantifier leur teinte.
    4. Trouvez le plan Z central de la cellule d’intérêt à l’aide de la barre de Z. Cliquez à droite sur le bouton de sélection ovale et sélectionnez le bouton de sélection elliptique. D’autres outils de sélection seront appropriés pour différents types de cellules. Dessinez un retour sur investissement elliptique autour du centre de la cellule.
    5. À l’aide de la barre de C,sélectionnez le canal rouge (dTomato). Prenez la mesure d’intensité moyenne pour ce canal en sélectionnant Analyze. Mesure. Répétez l’opération avec le même plan de retour sur investissement et plan focal pour les canaux vert (YFP) et bleu (CFP) et économisez toutes les valeurs d’intensité moyenne.
    6. Cliquez n’importe où sur l’image pour supprimer le retour sur investissement elliptique dans la cellule d’intérêt.
    7. Pour mesurer les niveaux de fond pour la normalisation, utilisez la barre de défilement C et sélectionnez le canal rouge (dTomato). Prenez la mesure d’intensité minimale pour l’ensemble du champ dans ce canal en sélectionnant Analyze. Mesure. Répétez l’opération avec le même plan focal pour les canaux vert (YFP) et bleu (CFP) et économisez toutes les valeurs d’intensité minimales.
  2. Calculez les poids relatifs des canaux RGB pour les cellules d’intérêt.
    REMARQUE :     Le calcul des poids relatifs des canaux RGB à partir de ces valeurs d’intensité peut être effectué dans une variété de logiciels, tels que Microsoft Excel ou R43.
    1. Normaliser la mesure d’intensité moyenne du retour sur investissement de la cellule pour chaque canal en soustrayant l’intensité minimale de l’ensemble du champ dans ce canal et le plan focal.
    2. Résumez les valeurs d’intensité moyenne normalisées de RGB de chaque canal pour trouver l’intensité totale normalisée de RGB pour la cellule.
    3. Calculez le poids relatif du canal pour chaque canal en divisant la valeur d’intensité moyenne normalisée pour ce canal par l’intensité totale normalisée de RGB.
  3. Afficher les poids relatifs du canal RGB comme parcelles ternaires utilisant le paquet sternaire pour R43,44. Les parcelles ternaires sont utiles pour visualiser le regroupement de couleurs similaires dans l’espace RGB 3D.
  4. Calculez le coefficient de propagation de couleur pour quantifier la différence entre les couleurs cellulaires.
    1. Calculez la distance Euclidean entre les deux couleurs dans l’espace RGB 3D à l’aide de l’équation suivante :
      figure-protocol-1
      où R, G et B sont les poids relatifs du canal RGB calculés en 7,2.
    2. Pour faciliter la compréhension, normaliser la distance de couleur en divisant par le 2, la distance maximale possible entre les couleurs, pour obtenir un coefficient de diffusion de couleur entre 0 et 1, où 0 indique exactement la même couleur et 1 indique des couleurs complètement différentes (par exemple, rouge pur et bleu pur).

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Résultats

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus à l’aide de l’approche d’imagerie multicolore in vivo décrite ici. Nous montrons que Brainbow clones codés en couleur de cellules dans la zone ventriculaire proliférée de l’arrière-poisson zèbre en développement14 (figure 1).

Typiquement, lorsque les cellules étiquetées Brainbow ont été disposées le long d’une fibre radiale particulière, elles partageaient la même cou...

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser les clones de cellules progénitrices et de neurones dans le cerveau postérieur du poisson zèbre en développement et les suivre in vivo à l’aide de Brainbow et de microscopie confocale en time-lapse11. Le principal avantage de ce protocole par rapport aux études in vitro ou ex vivo est la capacité d’observer directement la zone de prolifération du cerveau vertébré dans son milieu naturel au fil du temps. Cette technique s’appuie sur des études antérie...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Y. A. Pan, J. Livet et Z. Tobias pour leurs contributions techniques et intellectuelles. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (Award 1553764) et le M.J. Murdock Charitable Trust.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pipette de transfert de 1,5 mL (pointe fine)Globe Scientific, Inc.134020
1-phényl-2-thiourée (PTU)Alfa AesarL06690Dilué à 0,2 mM dans E3 pour prévenir la pigmentation de l’embryon
50 mL tubes coniquesCorning352070Pour choquer la chaleur des embryons
Fil de pêche en nylon de 6 lbSecureLineNMT250Pour la fabrication de manipulateurs d’embryons
Pipette de transfert de 7,5 mLGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881Pour
écouvillons de cotonPuritan867-WC PAS DE COLLEPour la fabrication de manipulateurs d’embryons
Cre recombinaseNew England BiolabsM0298M
Bain sec numériqueGenemate490016-616Utilisé pour stocker LMA à 42 ° ; C
Lunette de
Tubes capillaires en verreWorld Precision InstrumentsTW100F-4
IncubateurForma Scientific3158Pour maintenir les embryons à 28 ° ; C
Moules à plaque d’injectionOutils de science adaptatifsTU-1
Bain-marie IsotempFisher Scientific2320Pour les embryons choquants de chaleur
KClAMRESCO0395Pour E3 et pour solution d’ADN pour injections
Microscope confocal à balayage laserZeissLSM710
LE agaroseGenemateE3120À créer Plaques d’injection d’agarose
Agarose à bas point de fusion (LMA)AMRESCOJ234
Réservoirs d’accouplementAquaneering, Inc.
Bleu de méthylèneSigmaM9140Pour E3
MgSO4Sigma9397Pour E3
MicromanipulateurWorld Precision InstrumentsM3301
MicropipettePuller Sutter Instrument Co.P-97
MS-222 Tricaïne-SWestern Chemical, Inc.Pâte préparée à 4 mg/mL dans de l’eau d’osmose inverse (OI), puis ajoutée goutte à goutte à E3 jusqu’à une concentration finale de 0,2 mM pour anesthésier les embryons
NaClJ.T. Baker4058-01Pour
boîtes de Pétri E3 (90 mm, 60 mm)Genesee Scientific32-107GPour loger les embryons et créer une chambre d’imagerie (60 mm)
Rouge phénolSigmaP0290
Marqueursannulaires à mailles souplesClover Needlecraft, Inc.354Pour la création d’une chambre d’imagerie avec une boîte de Pétri
Super colle (contrôle Ultra gel)Loctite1363589Pour la fabrication de manipulateurs d’embryons
Aiguilles à seringueBeckton DickinsonBD329412Pour la déchiffonnement d’embryons
E3 dissection par épifluorescenceZHCT100

Références

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  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3(2013).
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