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Surveillance des anticorps PD-1-Blocking liés aux lymphocytes T dérivés d'une goutte de sang périphérique

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DOI :

10.3791/60608

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5 février 2020

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1Department of Respiratory Medicine and Clinical Immunology, Osaka University Graduate School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un essai simple de cytométrie de flux pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules De, exigeant seulement une goutte de sang périphérique des patients cancéreux.

Résumé

Les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, y compris les anticorps de blocage de la DP-1, ont considérablement amélioré les résultats du traitement dans divers types de cancer. L'efficacité pharmacologique de ces immunothérapies est durable, s'étendant même au-delà de l'arrêt de leurs injections, en raison des concentrations persistantes de sang. Ici, nous avons développé un essai de cytométrie de flux simple pour évaluer l'état de liaison des lymphocytes T des anticorps PD-1-bloquant nivolumab et pembrolizumab. Comme un test de glucose, cet essai ne nécessite qu'une seule goutte de sang périphérique. La visualisation de la liaison des anticorps sur les lymphocytes T est plus fiable que la mesure des concentrations sanguines d'anticorps. En outre, si nécessaire, nous pouvons potentiellement analyser de nombreux marqueurs distinctifs liés au système immunitaire sur les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-bloquant. Ainsi, il s'agit d'une stratégie simple et mini-invasive pour analyser l'effet pharmacologique des anticorps de Blocage de PD-1-blocage dans les patients cancéreux.

Introduction

Les anticorps de blocage de PD-1 sont devenus le choix standard pour le traitement de divers types de cancer, y compris le cancer du poumon de non-petite cellule (NSCLC)1,2,3,4. Ils montrent un effet thérapeutique remarquable dans un sous-ensemble de patients cancéreux qui n'ont pas répondu aux chimiothérapies cytotoxiques conventionnelles. Cependant, les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (IIC), qui comprennent les anticorps de blocage de la DP-1, peuvent causer un spectre unique et distinct d'événements indésirables, appelés événements indésirables liés au système immunitaire (IRAE)5. Bien que les irAE peuvent affecter presque tous les tissus, ils sont le plus souvent observés dans le tractus gastro-intestinal, les glandes endocrines, la peau et le foie, et ils peuvent causer le prurit, éruption cutanée, nausées, diarrhée, et troubles thyroïdiens6,7. En général, la plupart des irAE apparaissent dans les 1 à 2 mois suivant le déclenchement des ICI. Cependant, dans certains cas, ils peuvent se produire plus tard que 1 an après le début du traitement ou même après l'arrêt du traitement6,7. Ils causent également divers symptômes qui peuvent être difficiles à distinguer d'autres pathologies. Ainsi, il peut être difficile de diagnostiquer rapidement irAEs et de les traiter de façon appropriée. irAEs peut affecter tous les tissus, et leur arrivée est fortement influencée par la circulation des cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-blocage. Par conséquent, une méthode simple et mini-invasive pour surveiller les lymphocytes T ciblés par les anticorps est importante dans les milieux cliniques.

Ici, nous avons développé une méthode simple pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T utilisant une goutte de sang entier périphérique des patients de cancer qui ont reçu le nivolumab ou le pembrolizumab. En utilisant cette approche, nous avons pu surveiller chacun des éléments suivants : 1) la durée de la liaison des anticorps aux lymphocytes T, 2) l'occupation des molécules De Lymph PD-1 par des anticorps thérapeutiques, et 3) l'état d'activation et les caractéristiques immunologiques des lymphocytes T. Cette méthode est une modification d'une technique précédemment rapportée8. La quantité de sang nécessaire est presque la même que celle nécessaire pour un test de glucose, et l'approche ne nécessite pas d'enrichissement cellulaire mononucléaire ou de co-culture avec des anticorps PD-1-blocage. Nous avons confirmé que cette méthode peut également être effectuée à l'aide d'échantillons congelés, y compris les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et les cellules de l'effusion pleurale, l'effusion péricardique, le liquide de lavage bronchoalveolar, et le liquide céphalo-rachidien, suggérant que cette stratégie puisse être utile dans le contexte d'une étude multicentrique. Cette méthode peut faciliter le diagnostic précoce des irAE, et également aider à déterminer les traitements immunosuppresseurs appropriés pour contrôler leurs symptômes et d'identifier les moments optimaux pour initier des thérapies ultérieures après inhibiteurs de PD-1.

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Protocole

L'échantillonnage a été effectué pendant les procédures cliniques courantes. Tous les échantillons humains ont été obtenus après que le consentement éclairé a été fourni par les sujets, conformément à la Déclaration d'Helsinki et avec l'approbation du comité d'examen éthique de l'École supérieure de médecine de l'Université d'Osaka, au Japon (15383 et 752).

1. Préparation d'échantillons de sang entier et coloration

  1. Recueillir des échantillons de sang entier dans des tubes de collecte de sang contenant de l'acide tétratique de diaté-acétique (EDTA) contenant de l'acide tétratique de la diamine d'éthylène.
    REMARQUE : La collecte de sang peut être effectuée à l'aide d'une aiguille ordinaire ou d'une lancette sanguine.
  2. Transférer 20 l d'échantillons de sang entier dans des tubes de cytométrie à fond rond à fond rond de 5 ml.
    REMARQUE : Pour réduire la liaison non spécifique des cellules aux tubes, 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS) de 2 % dans la saline tamponnée en phosphate (PBS) est ajouté dans les tubes et vortexé pendant 10 s avant l'application aux échantillons.
  3. Ajouter 20 'L de 2% FBS dans PBS.
  4. Ajouter 10 L de réactif de blocage FcR spécifique à l'homme. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  5. Ajouter 500 l de tampon de lyse des globules rouges. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  6. Ajouter 4 ml de 2 % de FBS en PBS et faire tourner les cellules à 400 x g (1 500 tr/min) pendant 5 min à 4 oC. Enlever le supernatant par aspiration.
  7. Répétez le processus de lavage et d'aspiration décrit à l'étape 1.6.
  8. Resuspendre les cellules dans 100 'L de 2% FBS en PBS et diviser en deux tubes de 50 'L chacun.
  9. Ajouter les anticorps marqueurs de surface (tableau 1). Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
    REMARQUE : Lors du profilage du statut immunitaire des lymphocytes T, le nombre de marqueurs peut être augmenté en fonction de la qualité de la machine de cytométrie de flux.
  10. Laver les échantillons 2x tel que décrit à l'étape 1.6.
  11. Resuspendre les cellules dans 200 'L de 2% FBS dans PBS.

2. Analyse cytométrique de flux

  1. Insérez des tubes dans le cytomètre d'écoulement et acquérez des cellules, suivant essentiellement le protocole recommandé9.
  2. Enregistrez 10 000 événements comme la porte des lymphocytes (figure 1A) et les données sur les flux d'exportation sous forme de fichiers .fcs aux fins d'analyse.
  3. Ouvrez les fichiers dans le logiciel d'analyse. Visualisez les cellules sur une diffusion vers l'avant (FSC) (A) vs la dispersion latérale (SSC) (A) parcelle et les lymphocytes porte (Figure 1A).
  4. Après avoir sélectionné des cellules individuelles à l'aide de FSC (H) vs FSC (W) et SSC (H) vs SSC (W) (Figure 1B) et les afficher sur un CD3 vs CD8 ou CD3 vs CD4 parcelle, porte les cellules T CD8 et CD4 lymphocytes T, respectivement (Figure 1C).
  5. Après avoir sélectionné les cellules fermées et les avoir exposées sur une parcelle DP-1 vs Humaine IgG4, identifiez les cellules CD8 et CD4 liées par les anticorps PD-1-bloquants en fonction du contrôle de l'isotype (Figure 1D).

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Résultats

La stratégie de gating et l'analyse de cytométrie de flux (figure 1) peuvent détecter la liaison d'anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T obtenues à partir d'une goutte de sang périphérique patient de NSCLC. Avant l'administration de l'anticorps PD-1-bloquant, il n'y a pas de cellules CD8 ou CD4 positives humaines, et l'expression PD-1 peut être confirmée par un anticorps de détection de PD-1 (EH12.1)(figure 2A). Après l'administration du niv...

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Discussion

Dans cet article, nous rapportons une méthode utilisant un cytomètre de flux pour détecter les anticorps de PD-1-bloquant lié aux cellules T dérivées d'une goutte de sang périphérique, que nous avons à l'origine développé pour la détection de nivolumab10. Bien que cette technique soit très simple et facile à exécuter, deux points importants doivent être notés afin d'obtenir des résultats précis. La première est que pour détecter les molécules de PD-1, un anticorps approprié qui est en concurrence ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions à S.K. de la Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) et de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (JP18cm0106335 et 19cm0106310).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10X Tampon de lyse RBC (multi-espèces)Thermo Fisher Scientific00-4300-5450 mL
Anticorps anti-CD4 humain APC/Cyanine7BioLegend300518Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Cytomètreen flux BD
Brilliant Violet 510 Anticorps CD8a anti-humainBioLegend301048Clone RPA-T8
Dulbecco’s Phosphate Saline tamponnéenacalai tesque14249-95500 mL
Falcon Tubes en polystyrène à fond rondSTEMCELL Technologies3520585 mL
FcR Blocking Agent, humainMiltenyi Biotec130-059-9012 mL
FLOWJOBD
Gibco Sérum fœtal bovinThermo Fisher Scientific12676029500 mL
Souris IgG1 monoclonale - Contrôle des isotypesabcamab81200
Souris monoclonale Anti-Humain IgG4 Fcabcamab99825Clone HP6025
Souris Bleu Pacifique Anti-Humain CD3BDBD 558117Clone UCHT1
PE-Cy7 Souris anti-Humaine CD279 (-1)BD561272Clone EH12.1
PE-Cy7 Souris IgG1 &kappa ; Contrôle d’isotypeBD557646

Références

  1. Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).
  2. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  3. Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
  4. Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
  5. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  6. Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
  7. Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
  8. Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
  9. Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).
  10. Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).
  11. Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
  12. Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
  13. Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).

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Mots-clés

Essai de cytom trie en fluxAnalyse du sang p riph riquetat de liaison des lymphocytes TD tection du nivolumab et du pembrolizumabLyse des globules rougesAnticorps anti marqueurs de surfaceStrat gie de fen trage des lymphocytesSurveillance des points de contr le immunitaireBiomarqueur minimalement invasif

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