Électrochimiothérapie dans les sphéroïdes de mélanome oculaire 3D à l’aide d’une électrode personnalisée

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour le développement de sphéroïdes de mélanome conjonctival et uvéal 3D et l’utilisation d’électrodes personnalisées portatives pour l’électrochimiothérapie in vitro de sphéroïdes 3D dans un puits de culture. Cela offre de nouvelles perspectives dans l’utilisation de l’électrochimiothérapie dans le traitement du mélanome oculaire.

Résumé

L’électrochimiothérapie (ECT) est la combinaison de la formation de pores transitoires après l’application d’une impulsion électrique et de l’administration de médicaments cytotoxiques, ce qui renforce l’effet cytotoxique de l’agent appliqué en raison des modifications membranaires. Les systèmes de culture 3D in vitro simulent la croissance tumorale in vivo et préservent les caractéristiques biologiques des tumeurs avec plus de précision que les cultures cellulaires monocouches conventionnelles. Nous décrivons un protocole pour le développement d’organoïdes tumoraux 3D à l’aide de lignées cellulaires de mélanome conjonctival (CM) et de mélanome uvéal (UM) ainsi que l’utilisation d’électrodes personnalisées portatives, adaptées à l’ECT in vitro dans le puits de culture sans destruction de l’environnement tumoral. Ce protocole analyse la culture et la croissance des sphéroïdes 3D CM et UM et leur réaction à la bléomycine (2,5 μg/mL) seule, à l’électroporation (EP) (750 volts/cm, 8 impulsions, 100 μs, 5 Hz) seule, et à l’ECT en tant que combinaison d’EP et de bléomycine. La concentration du médicament et les paramètres de PE utilisés dans ce protocole ont été établis comme conditions ECT privilégiées selon les expériences précédentes. Le test utilisé pour déterminer la viabilité du sphéroïde a été effectué 3 à 7 jours après le traitement. L’effet sur la viabilité et la croissance des sphéroïdes tumoraux 3D n’était significatif qu’après l’ECT. Les électrodes personnalisées sont décrites en détail afin de faciliter l’application d’impulsions dans le puits de culture. Ce nouveau traitement des sphéroïdes 3D UM et CM constitue un tremplin pour une application clinique future.

Introduction

Le mélanome uvéal (UM) est la tumeur intraoculaire primitive la plus fréquente chez l’adulte, tandis que le mélanome conjonctival (CM) représente 2 % de tous les mélanomes oculaires 1,2,3,4,5,6. La curiethérapie, la radiothérapie par faisceau de protons et la photothérapie sont les traitements de première intention dans l’UM, tandis que l’énucléation du globe peut être nécessaire ^1,2,3. Le traitement de la CM varie entre les centres d’oncologie oculaire ; La biopsie excisionnelle suivie d’une chimiothérapie locale et/ou d’une radiothérapie est l’approche de traitement la plus fréquente⁴. Malgré le traitement, la MC est associée à une mortalité de 25 à 30 %⁵.

Il y a peu de littérature sur la formation des sphéroïdes CM et UM et l’application de l’ECT dans le mélanome oculaire ^6,7,8. Les sphéroïdes tumoraux ont de meilleures caractéristiques biologiques que les cultures cellulaires 2D conventionnelles et ont été proposés comme un outil utile pour imiter l’environnement tumoral in vivo⁹. L’électrochimiothérapie (ECT) combine l’utilisation de médicaments cytotoxiques non perméables avec l’électroporation (EP)¹⁰. L’EP est l’application locale d’impulsions électriques courtes et intenses qui perméabilisent transitoirement les cellules pour une augmentation localisée de l’absorption de médicaments anticancéreux dans les cellules cancéreuses et entraîne une augmentation de la mort cellulaire¹¹. Cette étude établit un protocole décrivant le développement des sphéroïdes CM et UM et étudie les résultats après ECT avec bléomycine. Ce protocole pourrait aider les chercheurs dans le domaine de l’oncologie oculaire à utiliser d’autres modalités thérapeutiques sur les sphéroïdes ou à étudier d’autres effets de l’ECT. En raison de l’utilisation limitée de l’ECT en ophtalmologie, il existe peu de connaissances concernant l’effet et le processus de cette modalité ; Ainsi, cette expérience pourrait élargir le spectre des options de traitement à l’avenir. Nous proposons un nouveau réglage personnalisé de l’électrode de la plaque portable, qui permet l’ECT du sphéroïde dans les puits de culture sans aucune destruction de l’environnement tumoral.

Protocole

1. Formation des sphéroïdes

1. Utilisez des lignées cellulaires cancéreuses en croissance adhérente pour la formation de sphéroïdes.
2. Fournir toutes les étapes associées à la culture cellulaire dans des conditions de laboratoire stériles.
3. Préparez le milieu de culture complet standard comme recommandé pour les lignées cellulaires d’intérêt et réchauffez-le à 37 °C à l’aide d’un bain-marie.
   REMARQUE : Ici, les lignées cellulaires conjonctivales humaines CM2005.1, CRMM1, CRMM2 ainsi que les lignées cellulaires de mélanome uvéal 92.1, OMM1 et OMM2 ont été utilisées et cultivées dans un milieu Ham F-12 contenant 10 % de sérum de veau fœtal et dans un milieu RPMI contenant 10 % de sérum de veau fœtal, respectivement.
4. Détachez les cellules d’intérêt à l’aide de méthodes de digestion enzymatique standard (p. ex., solution trypsine-EDTA).
5. Pour déterminer le nombre de cellules vitales, remettre en suspension 10 μL de suspension cellulaire dans 10 μL de solution de bleu de Trypan (1:1) et compter les cellules à l’aide d’une chambre (hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé) dans les 5 minutes. Les cellules doivent être à <90 % de la confluence et en bon état.
6. Pour former des sphéroïdes, ensemencez 5 x 10³ cellules par puits avec un volume total de 200 μL de milieu de culture complet dans des plaques de fixation à très faible teneur en 96 puits. Incuber la plaque à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Pour une inhibition efficace de la fixation cellulaire, utilisez des plaques de fixation ultra-faibles avec un hydrogel hydrophile, non ionique et chargé neutrement lié de manière covalente à la surface. Cet hydrogel inhibe l’immortalisation des cellules et les force à passer à l’état suspendu pour construire des sphéroïdes en 3D.
7. Vérifiez la formation des sphéroïdes à l’aide d’un microscope.
   REMARQUE : Certaines lignées cellulaires ne forment pas de sphéroïdes tumoraux ronds en 3D dans le premier passage. Passez la culture de la sphère tumorale avant qu’ils ne commencent à développer un centre sombre. Dissocier les masses tumorales en fonction de la lignée cellulaire après 4 à 10 jours par trypsinisation. Ensuite, ensemencez les cellules individuelles dans une nouvelle plaque de fixation ultra-basse 96. En répétant cette procédure sur plusieurs passages, les cellules vont s’adapter à la culture 3D.

2. Électrochimiothérapie des sphéroïdes tumoraux

1. Comme contrôle du dosage, utilisez des sphéroïdes non traités et des sphéroïdes traités uniquement avec de l’EP ou de la bléomycine seule.
2. Ajustez les paramètres de l’électroporateur (nombre d’impulsions, fréquence d’impulsion, durée, durée et tension ; voir tableau des matériaux). Pour les cellules de mélanome, utilisez 8 impulsions électriques à ondes carrées de 750 volts/cm, d’une durée d’impulsion de 100 μs, d’une fréquence de répétition de 5 Hz.
3. Au jour 3 de la culture de sphéroïdes, préparer une solution fraîche de sulfate de bléomycine dans du PBS stérile à une concentration de 5 μg/mL dans un tube de 15 mL.
4. Remplacez le milieu de culture cellulaire des sphéroïdes en prélevant 200 μL de milieu de culture et en remplissant avec 100 μL de milieu de culture complet frais pour chaque puits.
5. Ajouter 100 μL de solution de sulfate de bléomycine dans chaque puits (concentration finale : 2,5 μg/mL). Ajouter 100 μL de milieu frais aux témoins non traités et aux sphéroïdes traités uniquement avec de l’EP au lieu d’une solution de sulfate de bléomycine.
6. Effectuez l’électroporation.
   REMARQUE : Les électrodes illustrées à la figure 1 ont été produites dans l’atelier de recherche de l’Université de Halle-Wittenberg. Ils sont fabriqués en acier inoxydable et s’adaptent à la poignée de l’électroporateur. Les électrodes ont été conçues pour être utilisées dans des plaques de fixation ultra-basses à 96 puits. Des électrodes similaires en acier inoxydable peuvent également être facilement fabriquées pour des applications alternatives.
   1. Stérilisez les électrodes avec de l’éthanol à 70 % et laissez les électrodes sécher. Le diamètre des électrodes est de 1 mm, l’espace entre les deux électrodes est de 4 mm et la longueur de chaque électrode est de 8 mm (Figure 1a).
   2. Placez les électrodes au fond du puits, avec les sphéroïdes entre les électrodes. Cela permet le positionnement idéal du sphéroïde entre les deux électrodes (Figure 1b).
   3. Secouez la plaque pour permettre aux sphéroïdes de se déplacer du fond du puits et d’être placés entre les électrodes. Le sphéroïde ne sera entre les électrodes que pendant quelques secondes.
   4. Démarrez l’électroporation avec les réglages préférés.
   5. Remplacer la solution de sulfate de bléomycine dans le puits en remplaçant 150 μL de milieu par 150 μL de milieu frais.
   6. Incuber les cellules jusqu’à 10 jours à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂. Si les sphéroïdes non traités commencent à développer un centre sombre, mettez fin à l’expérience. Remplacez 150 μL du milieu de culture cellulaire tous les 2-3 jours. Ainsi, évitez la perturbation des sphéroïdes en positionnant la pointe de la pipette sur la région du bord du puits, en inclinant la plaque et en pipetant lentement.

3. Détermination de la taille des sphéroïdes

1. Mesurez la taille des sphéroïdes le jour du traitement (point de départ) et 3 à 7 jours après le traitement à l’aide de la microscopie à fond clair en calculant la section transversale des sphéroïdes à l’aide d’ImageJ Fiji¹¹.
2. Prenez une image des sphéroïdes uniques avec la barre d’échelle. Utilisez un grossissement par lequel tout le sphéroïde est visible. Par exemple, un grossissement 5x a été utilisé pour CM2005.1. Enregistrez l’image au format JPEG.
3. Analysez la taille du sphéroïde en calculant la section transversale à l’aide d’ImageJ/Fiji.
   1. Installez le logiciel (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Démarrez ImageJ/Fidji. Importez l’image spheroid : Fichier > Ouvrir.
   3. Pour régler l’échelle, choisissez le bouton de ligne de la barre d’outils et marquez la ligne de la barre d’échelle dans l’image en cliquant sur : Analyser > Définir l’échelle. À l’aide d’une distance connue, renseignez la distance de la barre d’échelle. Changez l’unité de longueur en μm. Cliquez sur le champ global pour attribuer les paramètres à toutes les images avec le même facteur d’agrandissement.
   4. Convertir l’image en 8 bits : Type de > d’image > 8 bits.
   5. Choisissez Image > Ajuster > seuil automatique (sélectionnez > Ne pas réinitialiser la plage). Le sphéroïde est marqué en rouge ou en noir selon le marqueur de seuil choisi. Ajustez les curseurs de sorte que les pixels sphéroïdes deviennent rouges, mais que les pixels non sphéroïdes ne changent pas de couleur. Fermez la boîte de dialogue Seuil sans cliquer sur l’un des boutons.
   6. Pour calculer l’aire de la section transversale du sphéroïde, choisissez Analyser > Définir les mesures, puis cliquez sur Zone, Limiter au seuil et Afficher l’étiquette. Fermez la boîte de dialogue Définir les mesures en cliquant sur OK.
   7. Pour afficher les résultats, choisissez Analyser > Analyser les particules et modifiez la taille (μm²) = 10000-infini pour supprimer le bruit. Cliquez sur le bouton Afficher les résultats et fermez la fenêtre en cliquant sur OK. Dans les résultats, les sphéroïdes avec l’étiquette et la zone sont affichés. En répétant les analyses de plusieurs sphéroïdes, les résultats sont listés dans la fenêtre Résultats .
   8. Pour déterminer la réponse relative au traitement des sphéroïdes traités par ECT par rapport aux témoins non traités et traités seuls, calculez les variations en pourcentage de la section transversale.

4. Détermination de la viabilité des sphéroïdes

1. Mesurer la viabilité des sphéroïdes 3 à 7 jours après le traitement à l’aide d’un test de viabilité cellulaire adapté aux cultures cellulaires 3D selon les instructions du fabricant. Le test doit pénétrer et lyser de grands sphéroïdes pour permettre la détection de la viabilité par quantification de l’ATP, qui signale la présence de cellules métaboliquement actives.
   REMARQUE : Dans cette expérience, un test basé sur la luminescence comme méthode de lecture a été utilisé. La viabilité des sphéroïdes traités par ECT a été comparée à celle des témoins sept jours après le traitement.

Résultats

Les expériences ont été menées avec des électrodes portatives personnalisées, composées d’acier inoxydable de haute qualité. L’épaisseur des électrodes est de 1 mm, la largeur est de 4 mm, l’espace entre les deux électrodes est de 4 mm et la longueur de chaque électrode est de 8 mm (Figure 1). L’EP et la bléomycine seules n’ont pas d’effet significatif sur la viabilité et la croissance des sphéroïdes tumoraux UM et CM. L’ECT montre une réduction significative de la viabilité tumorale et de la taille des sphéroïdes. Une perte de l’architecture sphéroïde avec des fragments cellulaires déconstruits autour des sphéroïdes et une nécrose sur la région centrale et périphérique de tous les sphéroïdes testés ont été observées après ECT avec bléomycine. La figure 2 montre les résultats des lignées cellulaires CM2005.1. Les lignées cellulaires UM métastatiques ont montré une réponse plus élevée par rapport aux lignées cellulaires primaires après ECT⁸.

Figure 1 : Électrodes portatives personnalisées. Les électrodes sont en acier inoxydable de haute qualité. La poignée des électrodes est fournie avec l’électroporateur. L’épaisseur des électrodes est de 1 mm, la largeur est de 4 mm, l’espace entre les deux électrodes est de 4 mm et la longueur de chaque électrode est de 8 mm (a) ; électroporation de sphéroïdes dans un format de 96 puits (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Effet cytotoxique de l’électrochimiothérapie sur les sphéroïdes tumoraux de la lignée cellulaire de mélanome conjonctival CM2005.1. L’électrochimiothérapie (ECT, 750 V/cm après l’application de 2,5 μg/mL de bléomycine) a provoqué des effets cytotoxiques plus forts chez les sphéroïdes par rapport à l’électroporation (EP) seule ou à la chimiothérapie utilisant la bléomycine (2,5 g/mL) seule. L’effet cytotoxique a été mesuré en calculant à la fois l’aire transversale et un test de viabilité en pourcentage du témoin non traité sept jours après le traitement. Les boîtes à moustaches montrent l’aire transversale moyenne des sphéroïdes (a) ; la viabilité moyenne des sphéroïdes (b) ; Images représentatives de sphéroïdes, barre d’échelle = 200 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’EP est utilisé dans diverses applications biotechnologiques et cliniques¹². De nouveaux développements technologiques, tels que des électrodes spécialement conçues avec une spécificité élevée pour chaque cellule et site cible, peuvent aider les tissus cibles de l’ECT n’importe où dans le corps¹². La conception et la position des électrodes doivent permettre une accessibilité complète à la tumeur et garantir que les tissus sains ne sont que peu affectés ou ne sont pas endommagés par le traitement¹³.

Des publications antérieures ont montré l’effet de l’ECT dans des suspensions de cellules de mélanome humain in vitro ^7,8. La littérature faisant référence à l’application de l’ECT dans des modèles de cellules oculaires 3D ou d’autres environnements similaires in vivo, permettant une utilisation thérapeutique plus sûre, est limitée. Brun et al. postulent que les cellules 3D de l’échafaudage lors de l’analyse morphologique ont une forme ronde différente de la forme allongée montrée dans les cultures 2D, mais extrêmement similaire aux cellules des biopsies des patients⁹. L’affinement des paramètres de thérapie et des instruments utilisés dans les cultures 3D peut conduire à une optimisation des paramètres ECT, permettant une approche clinique plus précise⁹.

Nous décrivons un développement technologique concernant de nouvelles électrodes pour l’application de l’ECT dans des cultures cellulaires 3D. La bléomycine est l’agent cytotoxique le plus couramment administré en association avec l’ECT¹¹. Des études antérieures de notre groupe ont montré que les paramètres EP appliqués (750 Volts/cm, 8 impulsions, 100 ms, 5 Hz) étaient adaptés au traitement des tumeurs oculaires in vitro. Les étapes critiques de la technique comprennent le peu de temps nécessaire pour effectuer l’ECT pendant que le sphéroïde s’enfonce après la mobilisation, ainsi que la dimension précise des électrodes. La nécessité de disposer d’électrodes personnalisées était due aux difficultés rencontrées pour effectuer l’ECT dans les puits avec les instruments disponibles. Des données non publiées de notre groupe ont montré une augmentation des dommages aux sphéroïdes lors du transfert des sphéroïdes dans un puits plus grand ou dans une cuvette pour les préparer au traitement, puis de les remettre dans le puits de culture. Un avantage de la technique décrite est l’absence de manipulation des sphéroïdes pour effectuer le traitement, car les organoïdes ne sont pas transférés dans des plaques ou des puits plus grands. Par conséquent, tous les sphéroïdes conservent leur forme. Un autre avantage est l’utilisation de tests de viabilité 3D plus robustes pour déterminer la cytotoxicité de l’ECT par rapport aux tests de viabilité standard, tels que le test MTT. Ainsi, toutes les cellules du sphéroïde sont lysées et un lavage supplémentaire des cellules, l’élimination du milieu et plusieurs étapes de pipetage sont nécessaires.

Les limites des méthodes décrites sont la courte durée de vie des sphéroïdes, qui affecte la taille de la tumeur ainsi que la nécrose cellulaire, comme on le voit au centre de l’organoïde tumoral. Le taux de mortalité élevé associé à la fois dans la MC et l’UM et les options thérapeutiques limitées nécessitent l’enrichissement des possibilités thérapeutiques existantes. L’ECT peut offrir une modalité adjuvante pour améliorer la qualité de vie du patient et prolonger la survie du patient. Ces conditions in vitro imitent un environnement in vivo avec une plus grande précision, offrant des résultats prometteurs pour une application humaine ultérieure. De futures études utilisant des sphéroïdes préparés à partir de cultures primaires peuvent fournir des résultats plus représentatifs pour l’optimisation des paramètres ECT pour un traitement ciblé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sulfate de bléomycine	Enzo	BML-AP302-0010	10 mg
Fiole de culture cellulaire 75 cm	TPP	TPP90076
Fiole de culture cellulaire TC175 cm	Sarstedt	83,39,12,002	Standard avec
filtre Cliniporateur	IGEA	EPS01	Électroporateur
Corning Costar Fixation ultra-basse Plaque à puits multiples, 96 puits, fond rond	Corning	7007	96Fond rond bien clair, plaques de fixation ultra basses
EGF 1MG	Sigma-Aldrich	E4127-.1MG
F-12 K Nut Mix (1x)	Gibco	21127-022
Sérum de veau fœtal, Amérique du Sud	Corning	35-079-CV	LOT Nr. 35079010, Reservierungsnummer : EU00478541
FKS
KGM-2	Lonza	CC-3103
PBS w/o. CaCl und MgCl	PromoCell	C-40232	500 ml
Pénicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333-100ml
RPMI 1640	Gibco	11504566	ATCC modification, HEPES, liquide, 500 ml
Tecan Infinity M Plex	Tecan
Trypsin-EDTA 1x Solution	Sigma-Aldrich	59430C-100ml