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Article de méthode

Évaluation de la guérison aigue des plaies à l’aide de l’implantation d’éponge d’alcool polyvinyl subcutanée et des modèles excisionaux de blessure de peau de queue.

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DOI :

10.3791/60653

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25 mars 2020

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1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

Dans cet article

Résumé

Ici, deux modèles murins de guérison de blessure sont décrits, l’un conçu pour évaluer les réponses cellulaires et de guérison de blessure de cytokine et l’autre pour quantifier le taux de fermeture de blessure. Ces méthodes peuvent être utilisées avec des modèles complexes de maladies telles que le diabète pour déterminer les mécanismes de divers aspects de la mauvaise cicatrisation des plaies.

Résumé

La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui exige la progression ordonnée de l’inflammation, la formation des tissus de granulation, la fibrose et la résolution. Les modèles murins fournissent un aperçu mécaniste précieux de ces processus; cependant, aucun modèle unique ne traite entièrement de tous les aspects de la réponse de guérison des plaies. Au lieu de cela, il est idéal d’utiliser plusieurs modèles pour aborder les différents aspects de la cicatrisation des plaies. Ici, deux méthodes différentes qui traitent de divers aspects de la réponse de guérison de blessure sont décrites. Dans le premier modèle, les éponges d’alcool polyvinyles sont sous-cutanées implantées le long du dorsum de souris. Après la récupération de l’éponge, les cellules peuvent être isolées par perturbation mécanique, et les fluides peuvent être extraits par centrifugation, permettant ainsi une caractérisation détaillée des réponses cellulaires et cytokine dans l’environnement aigu de blessure. Une limitation de ce modèle est l’incapacité d’évaluer le taux de fermeture des plaies. Pour cela, un modèle d’excision de la peau de la queue est utilisé. Dans ce modèle, un morceau rectangulaire de 10 mm x 3 mm de la peau de la queue est excisé le long de la surface dorsale, près de la base de la queue. Ce modèle peut être facilement photographié pour l’analyse planimétrique pour déterminer les taux de guérison et peut être excisé pour l’analyse histologique. Les deux méthodes décrites peuvent être utilisées dans les souches de souris génétiquement altérées, ou en conjonction avec des modèles de conditions comorbides, telles que le diabète, le vieillissement, ou l’infection secondaire, afin d’élucider les mécanismes de cicatrisation des plaies.

Introduction

Il existe de nombreux systèmes de modèles murins disponibles pour examiner les processus de cicatrisation des plaies, chacun possédant des avantages spécifiques et des limitations1,2. Les méthodes suivantes présentent deux modèles de plaies murines, chacun abordant un aspect particulier de la réponse de guérison de blessure, et qui peuvent être employés pour identifier la cause et l’effet des perturbations dans la réponse aux dommages. Le processus de cicatrisation des plaies se produit dans des phases distinctes. La première phase est inflammatoire, caractérisée par l’afflux rapide de plaquettes, de neutrophiles et de monocytes/macrophages, ainsi que par la production de cytokines et de chimiocontres proinflammatoires. Après la résolution de l’inflammation, l’environnement passe à un état plus réparateur avec l’induction des cytokines profibrotiques et proangiogéniques et des facteurs de croissance. Le tissu de granulation est déposé et les néovessels se forment avec la migration des myofibroblastes, des fibroblastes, des cellules épithéliales, et des cellules endothéliales. Dans les phases finales, la matrice extracellulaire provisoire est remodelée, et la formation de cicatrices et la fermeture de blessure procède2,3,4,5,6,7,8.

Aucun modèle murin unique ne fournit un système pour étudier toutes les étapes de la cicatrisation desplaies 2. Ici, deux modèles chirurgicaux de blessure sont décrits : l’un élucide les réponses cellulaires aigues et de guérison de blessure de cytokine, et l’autre permet l’évaluation de la fermeture de blessure aussi bien que des analyses histologiques. Ces deux méthodes peuvent être utilisées de façon complémentaire pour évaluer les effets d’une perturbation ou d’une comorbidité sur différents aspects de la réponse de guérison des plaies. L’implantation sous-cutanée dorsale des éponges d’alcool polyvinyle (PVA) est un système qui a été utilisé dans les modèles de rongeurs pendant des décennies pour élucider de nombreux aspects des réponses cellulaires et de tissu de granulation9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Cette approche permet la récupération de liquides de plaie riches en cytokine et d’infiltrations cellulaires. Dans ce modèle, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm de morceaux d’éponge PVA sont placés dans des poches sous-cutanées par une incision de 2 cm faite à la ligne médiane dorsale postérieure. L’incision est fermée avec des clips chirurgicaux, et les éponges peuvent être récupérées à des points plus tard pour l’isolement cellulaire et fluide. Le milieu cellulaire et cytokine des éponges isolées reflète les étapes normales de la guérison aigue de blessure jusqu’à environ 14 jours postimplantation. À des points de temps ultérieurs le modèle est plus avantageux pour étudier la formation de tissu de granulation et la réponse du corps étranger1. Avec ce système, il est possible d’isoler les cellules de6, ce qui offre un avantage distinct pour les tests phénotypiques et fonctionnels et l’isolement de l’ARN, sur l’isolement des cellules d’autres méthodes à base de biopsie1,22,23,25,26.

Le taux de fermeture de la plaie est déterminé à l’aide du modèle d’excision de la peau de la queue. Dans ce modèle, comme initialement décrit par Falanga et al. et rapporté par d’autres27,28,29,30, une section de 1 cm x 0,3 cm pleine épaisseur de la peau de queue est enlevée près de la base de la queue. La zone de la plaie est facilement visualisée et peut être mesurée au fil du temps. Alternativement, le tissu de queue peut être isolé pour l’analyse histologique. Cette approche peut être utilisée comme alternative ou en conjonction avec la méthode bien établie de biopsie de poinçon dorsale. Les principales distinctions entre ces deux modèles sont le taux de fermeture des plaies, la présence ou l’absence de fourrure, et la structure de la peau2,31,32. Les plaies de peau de queue offrent un délai plus long pour évaluer la fermeture des plaies, car il faut environ 21 jours pour que la fermeture complète se produise. Ceci s’oppose aux biopsies non attelles de poinçon dorsale, qui guérissent beaucoup plus rapidement (7-10 jours), principalement par contraction due à l’action du carnosus panniculus. Les biopsies de poinçon dorsale attelle guérissent plus lentement et diminuent les effets de la guérison contractile, mais comptent sur la présence d’un corps étranger pour restreindre les mécanismescontractuels-basés 1,2,27,30,31,33.

Les modèles décrits de blessure sont informatifs pour comprendre les processus normaux de guérison de blessure en l’absence de perturbation. Tandis que la guérison de la peau de rongeur diffère de manière très significative de la peau humaine, y compris la structure lâche, la dépendance à la guérison contractile, et d’autres différences anatomiques, le système murin offre certains avantages pour des études mécanistes et de criblage. La disponibilité de souches consanguines et de mutants génétiques, la tractabilité génétique et le coût inférieur sont au premier plan. La perspicacité mécaniste acquise à partir d’études murines peut être traduite en modèles animaux complexes qui imitent plus étroitement la guérison de la peau humaine, comme le système porcin2,31.

En plus d’examiner les réponses de guérison de blessure dans l’état régulier, ces modèles peuvent être combinés avec des conditions comorbides pour comprendre la base des défauts de guérison de blessure au niveau cellulaire, de cytokine, et brut de tissu. C’est dans ce cadre particulier que les deux modèles peuvent être utilisés de concert pour évaluer les effets d’une affection comorbide particulière, comme la pneumonie postopératoire, à la fois sur la réponse de guérison des plaies cellulaires aigues et sur le taux de fermeture desplaies 30.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Brown et menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux des National Institutes of Health.  REMARQUE : dans la vidéo, le drapé chirurgical a été omis à des fins de démonstration.

1. Implantation sous-cutanée des éponges PVA

  1. Utilisez des ciseaux pour couper des feuilles d’éponge PVA en morceaux de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Réhydratez les morceaux d’éponge PVA en les submergeant en sterile 1x PBS dans un bécher.
  2. Autoclavez les éponges dans 1x PBS pour stériliser, et refroidir complètement. Rangez les éponges autoclavées dans le PBS stérile 1x à 4 oC.
  3. Avant d’effectuer l’implantation chirurgicale, aco-pas le nombre nécessaire d’éponges dans un plat de culture stérile dans des conditions stériles dans un capot de flux laminar. Conservez les éponges supplémentaires dans le PBS stérile 1x à 4 oC pour une utilisation future. Assurez-vous que les éponges gonflent à 1 cm x 1 cm x 0,5 cm après la réhydratation. Une image d’éponges PVA déshydratées est montrée dans la figure 1A.
    REMARQUE : Pour maintenir la stérilité du site chirurgical, la procédure d’implantation d’éponge de PVA exige qu’une personne manipule la souris et prépare le site chirurgical, et une deuxième personne pour effectuer l’implantation.
  4. Anesthésiez une souris mâle de 8 à 12 semaines C57BL/6J par injection intraperitonéale de 80 mg/kg de kétamine. Administrer 40 mg/kg de xylazine intraperitoneally pour l’analgésie.  Confirmez la profondeur de l’anesthésie par la perte d’un réflexe de pédale. Préparer le site chirurgical en enlevant les cheveux le long du dorsum avec des tondeuses. À l’aide de gaze stérile, appliquer la solution povidone-iode à la zone de rasage 2x, suivie de 70% d’éthanol.
  5. Placez la souris sur des rideaux chirurgicaux stériles. Placez un tampon chauffé sous les rideaux chirurgicaux pour maintenir la température de base de la souris.
  6. Portez des gants chirurgicaux stériles pour effectuer la chirurgie. Éloignez la peau dorsale du tissu sous-jacent avec des forceps, et à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faites une incision de 2 cm le long de la ligne médiane dorsale d’environ 2 cm antérieur à la base de la queue. Tout en maintenant l’incision ouverte avec des forceps stériles, utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles à pointe émoussée pour former une poche sous-cutanée le long du dorsum dans l’une des positions indiquées dans la figure 1B.
  7. Continuez à utiliser des forceps pour soulever la peau loin du tissu sous-jacent. À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, presser délicatement une éponge PVA dans le plat de culture pour enlever l’excès de PBS. Ramassez l’éponge PVA par un coin à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et, en menant avec le coin tenu par les ciseaux, placez l’éponge dans la poche sous-cutanée formée à l’étape 1.4.
  8. Répétez ce processus 5x, en plaçant un total de six éponges dans des poches sous-cutanées comme le montre la figure 1B.
  9. Pincer la peau dorsale incisée avec des forceps stériles et fermer l’incision avec deux pincements en acier inoxydable.
  10. Utilisez un nouvel ensemble d’instruments chirurgicaux stériles pour chaque souris. Vous pouvez également utiliser un stérilisateur perlé pour stériliser les instruments entre souris.

2. Isolement des fluides des éponges PVA

  1. Pour évaluer le milieu aigu de cytokine de blessure, isolez les éponges entre 1-14 jours postimplantation.
  2. Préparer un tube de collecte de fluides en niant le baril d’une seringue de 5 ml dans un tube de culture de 16 ml.
  3. Euthanasiez une souris avec des éponges PVA implantées par asphyxie de CO2 suivie d’une dislocation cervicale.
  4. Retirez les agrafes chirurgicales et ouvrez l’incision avec des forceps dentés. Utilisez des ciseaux pour prolonger l’incision le long de la ligne médiane dorsale.
  5. À l’aide de forceps, extraire une éponge de sa poche sous-cutanée et la transférer au canon de seringue préparé, en prenant soin de minimiser la pression sur l’éponge. Dissociez tout tissu conjonctif qui reste adhéré à la surface de l’éponge. Utilisez des ciseaux pour disséquer l’éponge du tissu environnant si nécessaire. Répétez le processus d’enlèvement de l’éponge avec les éponges restantes. Placer le tube contenant les éponges sur la glace.
  6. Pour isoler le liquide de la plaie, centrifugez le tube de culture contenant la seringue de 5 ml avec les éponges à 700 x g pendant 10 min.
  7. Après la centrifugation, jetez la seringue et les éponges. Le liquide de la plaie aura recueilli dans le tube de culture de 16 ml. Une image représentative du liquide recueilli à partir d’une blessure du jour 7 est montrée dans la figure 1D. Transférer le liquide de la plaie dans un tube propre pour un stockage à long terme à -80 oC.

3. Isolement des cellules des éponges PVA

  1. Pour évaluer le milieu cellulaire de guérison aigue de blessure, recueillez des éponges entre 1-14 jours d’implantation post-éponge. Les éponges obtenues à partir d’une blessure 7 jours après l’implantation sont indiquées dans la figure 1E.
  2. Préparer le milieu de collecte contenant 1x HBSS (calcium/-magnésium/-phénol rouge) complété par 1% de FBS, 1% HEPES et 1% de pénicilline-streptomycine.
  3. Aliquot 5 mL de collecte HBSS milieu dans un tube conique de 15 mL.
  4. Extraire les éponges PVA des souris euthanasiées telles que décrites dans 2.2-2.4. Placer les éponges dans le tube conique contenant 5 ml de milieu de collecte HBSS.
  5. Transférer les éponges et le milieu de la collection HBSS dans un sac de mélangeur de 80 ml en versant. Accrochez le sac de mélangeur de l’écoutille du mélangeur à pagaie, positionné de sorte que les pagaies frappent les éponges et les supports. Ajuster les réglages du mélangeur à pagaie pour fonctionner à hauteur de 60 s. Appuyez sur le démarrage.
  6. Transférer le support du sac de mélangeur vers le tube conique de 15 ml avec une pipette, en laissant les éponges dans le sac. Pressez les éponges pour libérer complètement les médias. Ajuster les réglages du mélangeur à pagaie pour fonctionner pendant 30 s en hauteur. Ajouter 5 ml de support au sac de mélangeur et répéter le processus d’estomac 2x pour un total de trois lavages d’éponge.
  7. Centrifuge le tube conique à 250 x g pendant 5 min. Une boulette rouge de cellules et de globules rouges sera visible au fond du tube conique après centrifugation.
  8. Jetez le supernatant et effectuez une lyse des globules rouges : ajouter 900 L de dH2O à la pastille et à la pipette cellulaire pour mélanger. Neutraliser avec 100 L de 10x PBS. Ajouter 4 ml de PBS 1x au tube pour neutraliser complètement la lyse, puis la centrifugeuse à 250 x g pendant 5 min.
    REMARQUE : L’étape de lyse doit être brève ; laisser l’eau en contact avec les cellules pour plus de 3-5 s pourrait entraîner une lyse des globules non rouges.
  9. Après centrifugation, une boulette de cellules blanches contenant des cellules de plaie dépourvues de globules rouges sera présente au fond du tube conique. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille cellulaire dans le milieu désiré pour les analyses en aval.

4. Analyse facultative de cytométrie de débit des leucocytes innés isolés des plaies d’éponge de PVA

  1. Résuspendez 0,5 à 1 x10 6 cellules de plaie dans 25 'L d’une solution de blocage d’anticorps contenant 10 'g/mL anti-CD16/CD32 FcR-II/III anticorps dilués dans 1x PBS - 1% BSA.
    REMARQUE : Tous les anticorps doivent être titrés pour déterminer les concentrations optimales pour l’analyse de cytométrie d’écoulement.
  2. Incuber les cellules avec anticorps bloquant pendant 10 min sur la glace.
  3. Faire un mélange de maître 2x d’anticorps contenant 2,5 mg/mL de PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/mL de FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, et 10 mg/mL d’eFluor660-F4-80 dilués dans 1x PBS - 1% BSA. Ajoutez directement 25 L du cocktail d’anticorps aux cellules incubant dans le blocage des anticorps.
  4. Incuber les cellules pendant 20 min sur la glace, à l’abri de la lumière.
  5. Laver les cellules 2x avec 1x PBS.
  6. Faire un mélange principal de amine-réactive réparable viabilité dye-eFluor506 dilué 1:1,000 dans 1x PBS. Réutilisez la pastille de cellules dans 50 L de la solution de teinture de viabilité.
    REMARQUE : Le sérum doit être exclu de l’étape de viabilité fixable, car il empêchera la liaison du colorant aux protéines endogènes. Incuber les cellules pendant 20 min sur la glace, à l’abri de la lumière.
  7. Laver les cellules 2x avec 1x PBS. Réutilisez la pastille de cellules dans 50 L de 1% de paraformaldéhyde.
  8. Incuber les cellules avec 1% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes sur la glace, à l’abri de la lumière.
  9. Laver les cellules 1x avec 1x PBS et ressinpendre la granule en 1x PBS pour l’analyse cytométrique de débit.

5. Excision de peau de queue

  1. Anesthésiez une souris mâle de 8 à 12 semaines C57BL/6J par injection intraperitoneal de 80 mg/kg de kétamine. Administrer 40 mg/kg de xylazine intraperitoneally pour l’analgésie. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par la perte d’un réflexe de pédale.
  2. Préparer le site chirurgical sur la queue de la souris anesthésié en utilisant de la gaze stérile pour appliquer la solution povidone-iode 2x, suivie d’une application d’éthanol à 70%.
  3. Définir une section de 10 mm x 3 mm sur la surface dorsale de la queue, à 10 mm de la base de la queue(figure 1C) à l’aide d’un marqueur permanent pour tracer à partir d’un modèle préfabriqué.
  4. Placez la souris anesthésiée sur des rideaux chirurgicaux stériles.
  5. Portez des gants chirurgicaux stériles pour effectuer les interventions chirurgicales. Avec une lame stérile de scalpel, faites une incision pleine épaisseur le long des bords droit, inférieur, et gauche de la zone de blessure.
  6. À l’aide de forceps stériles, pelez la peau excisée de la queue et utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour couper le bord supérieur de la zone de la plaie.
  7. Appliquer une pression avec de la gaze stérile pour arrêter de saigner.
  8. Appliquer un film de barrière de pulvérisation sur le lit de la plaie.
  9. Photographiez les blessures à distance fixe à intervalles réguliers. Analyser les photographies par analyse planimétrique pour déterminer les mesures de la zone de la plaie. Vous pouvez également utiliser des étriers pour obtenir des mesures de longueur et de largeur des plaies.

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Résultats

Réponse inflammatoire systémique après l’implantation d’éponge de PVA
La chirurgie d’implantation d’éponge de PVA a généré une réponse inflammatoire systémique, comme démontré par l’induction de l’IL-6 dans le plasma 1 jour après la blessure(figure 2A). D’autres cytokines proinflammatoires, y compris TNF-MD et IL-1, ainsi qu’un tableau de chimiothèques, y compris CCL2 et CXCL1 ont été induits systématiquement dans les 7 premiers jours après l’implantation éponge PVA, et o...

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Discussion

Cet article décrit deux modèles de plaies murines tractables qui permettent l’évaluation de la réponse aigue de guérison de blessure. La première méthode implique l’implantation chirurgicale des éponges de PVA dans l’espace sous-cutané dorsal. Cette approche offre un avantage distinct sur les modèles de plaies à base de biopsie pour étudier la réponse de guérison cellulaire de blessure due au grand nombre de cellules et à la quantité de fluides de blessure obtenus des éponges isolées. Pour l’exécution réussie de cette pr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier Kevin Carlson, de l’Installation de cytométrie et de tri des flux de l’Université Brown, pour consultation et aide aux expériences de cytométrie des débits. Des images de la figure 1B et de C ont été créées avec BioRender. Kayla Lee et Gregory Serpa sont remerciés pour leur aide photographique. Ce travail a été soutenu par des subventions de ce qui suit: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean’s Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) et Brown University Research Seed Award.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x Saline tamponnée au phosphateFisher ScientificBP3991
15 mL tubes à centrifuger, OlympusGenesee28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnésium, &ndash ; ThermoFisher Scientific14025076
Seringue 5mlBD309646
Anti-souris CD45.2-APC Fire750BioLegend109852Clone 104
Anti-souris F4/80-eFluor660ThermoFisher Scientific50-4801-82Clone BM8
Anti-souris Ly6C-FITCBD Biosciences553104Clone AL-21
Anti-souris Ly6G-PerCP-eFluor710ThermoFisher Scientific46-9668-82Clone 1A8-Ly6g
Anti-souris Siglec-F-APC-R700BD Biosciences565183Clone E50-2440
Autoclip Clip en acier inoxydable ApplicateurBraintree ScientificNC9021392
Autoclip Clips en acier inoxydable, 9mmBraintree ScientificNC9334081
Sac mélangeur, 80 mlScientific14258201
Tube de culture, 16 ml, 17 x 100Genesee Scientific21-130
Sérum fœtal de veau - StandardThermoFisher Scientific10437028
Fixable Viability Dye eFluor506ThermoFisher Scientific65-0866-14
Hepes Solution, 1MGenesee Scientific25-534
ImageJ SoftwareNIH
Pénicilline-Streptomycine (5000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070-063
Éponge à alcool polyvinylique - grande taille de poresIvalon/PVA Unlimitedwww.sponge-pva.com
Solution de povidone iodée, 10 %Fisher Scientific3955-16
Film barrière de pulvérisation, Cavilon3M3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110VSeward0080/000/AJ
Fisher

Références

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