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Article de méthode

Préparation de SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexs of Liver Alcohol Dehydrogenase

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DOI :

10.3791/60668

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19 mars 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

Dans cet article

Résumé

La préparation de SNS pincer cobalt (II) complexes modèles de déshydrogénase d’alcool de foie est présentée ici. Les complexes peuvent être préparés en réagissant au précurseur du ligand avec CoCl2'6H2O et peuvent ensuite être recrystallisés en permettant à l’éther de diethyl de se diffuser lentement dans une solution d’acétyltrile qui contient le complexe de cobalt.

Résumé

Les complexes de modèles chimiques sont prêts à représenter le site actif d’une enzyme. Dans ce protocole, une famille de précurseurs de ligand de pince tridentate (chacun possédant deux fonctionnalités d’atome de sulfure et d’un donneur d’azote (SNS) et basée sur des composés bis-imidazole ou bis-triazole) sont métallées avec des complexes CoCl2'6H2O pour se permettre des complexes tridents de cobalt de pince SNS(II). La préparation des complexes modèles de cobalt (II) pour la déshydrogénase d’alcool du foie est facile. Basé sur un changement de couleur rapide lors de l’ajout de la Solution CoCl26H 2O à l’acétyltrile qui contient le précurseur ligand, le complexe se forme rapidement. La formation du complexe métallique est terminée après avoir permis à la solution de reflux pendant la nuit. Ces complexes de cobalt (II) servent de modèles pour le site actif de zinc dans la déshydrogénase d’alcool de foie (LADH). Les complexes sont caractérisés à l’aide diffraction à rayons X en cristal unique, spectrométrie de masse électrospray, spectroscopie visible ultra-violet et analyse élémentaire. Pour déterminer avec précision la structure du complexe, sa structure cristalline unique doit être déterminée. Les cristaux simples des complexes qui conviennent à la diffraction des rayons X sont ensuite cultivés par la diffusion lente de vapeur de l’éther de diéthyle dans une solution d’acétyltrile qui contient le complexe de cobalt(II). Pour les cristaux de haute qualité, la récrystallisation se fait généralement sur une période d’une semaine, ou plus. La méthode peut être appliquée à la préparation d’autres complexes de coordination des modèles et peut être utilisée dans les laboratoires d’enseignement de premier cycle. Enfin, on croit que d’autres peuvent trouver cette méthode de réhantification pour obtenir des cristaux uniques bénéfiques à leur recherche.

Introduction

Le but de la méthode présentée est de préparer des analogues à petites molécules de la LADH pour mieux comprendre l’activité catalytique des métalloenzymes. LADH est une enzyme dimerique qui contient un domaine cofactor-contraignant et zinc(II) domaine catalytique contenant1. LADH, en présence du co-facteur NADH, peut réduire les cétones et les aldéhydes à leurs dérivés respectifs de l’alcool2. En présence de NAD,LADH peut effectuer une catalyse inverse de l’oxydation des alcools aux cétones et aux aldéhydes2. La structure cristalline du site actif de la LADH montre que son centre métallique de zinc(II) est lié à un atome d’azote, fourni par une chaîne latérale d’histidine et deux atomes de soufre et offert par deux ligands de cystéine3. D’autres recherches ont montré que le centre de zinc métal est ligated avec une molécule d’eau labile, résultant en la géométrie pseudo-tetrahedral autour du centre métallique4.

Nous avons déjà signalé et utilisé SNS pinces ligand précurseurs ainsi que métallé les précurseurs ligand avec ZnCl2 pour former Zn(II) complexes qui contiennent le précurseur de ligand tridentate5,6,7. Ces précurseurs ligand sont indiqués dans la figure 1. Ces complexes de zinc (II) ont montré l’activité pour la réduction stoichiométrique des aldéhydes électron-pauvres et sont donc des complexes modèles pour LADH. Par la suite, la synthèse et la caractérisation d’une série de complexes de cuivre (I) et de cuivre (II) qui contiennent des précurseurs de ligand SNS ont été rapportés8,9,10.

Bien que la LADH soit une enzyme de zinc(II), nous sommes intéressés à préparer des complexes modèles de cobalt (II) de LADH afin d’obtenir plus d’informations spectroscopiques sur les analogues de cobalt(II) de LADH. Les complexes de cobalt (II) sont colorés, tandis que les complexes de zinc(II) sont blanc cassé. Puisque les complexes de cobalt (II) sont colorés, des spectres ultraviolets visibles des complexes peuvent être obtenus, dans lesquels des informations sur la force du champ de ligand dans les complexes de cobalt(II) peuvent également être recueillies. En utilisant les informations des calculs gaussiens et les spectres visibles ultra-violets obtenus expérimentalement, les informations sur la force du champ ligand peuvent être déduites. Cobalt(II) est un bon substitut pour le zinc(II), puisque les deux ions ont des radii ioniques similaires et des acidités similaires de Lewis11,12.

La méthode présentée consiste à synthétiser et caractériser les complexes modèles pour tenter d’imiter le comportement catalytique naturel de LADH5,6. Nous avons déjà métallé une famille de précurseurs ligand avec ZnCl2 pour former zinc (II) complexes modèles de LADH, qui a modélisé la structure et la réactivité du site actif de zinc dans LADH4. Grâce à de multiples expériences, ces ligands pinces se sont avérés robustes dans des conditions environnementales différentes et sont restés stables avec une collection diversifiée de R-groupes attachés. 5,6

Les ligands Tridentate sont préférables par rapport aux ligands monodentate, parce qu’ils se sont avérés être plus de succès avec la métalisation en raison des effets chélatés forts des ligands tridentate. Cette observation est due à une entropie plus favorisée de la formation de ligand de pince de tridentate par rapport à un ligand monodentate13. En outre, les ligands de pince tridentate sont susceptibles d’empêcher la dimécrétisation des complexes métalliques, ce qui est favorisé parce que la dimerisation est susceptible de ralentir l’activité catalytique d’un complexe14. Ainsi, l’utilisation de ligands de pince tridentate a été prouvée réussie dans la chimie organométallique dans la préparation des complexes actifs et robustes catalytiques. Les complexes de pinces SNS ont été moins étudiés que les autres systèmes de pinces, car les complexes de pinces contiennent habituellement des métaux de transition de deuxième et troisièmerangées 15.

Cette recherche sur les métalloenzymes peut aider à mieux comprendre leur activité enzymatique, qui peut être appliquée à d’autres domaines de la biologie. Cette méthode de synthèse des complexes modèles par rapport à la méthode alternative (synthétiser toute la protéine de LADH) est favorable pour un certain nombre de raisons. Le premier avantage est que les complexes modèles sont faibles en masse moléculaire et sont encore capables de représenter avec précision l’activité catalytique et les conditions environnementales du site actif de l’enzyme naturelle. Deuxièmement, les complexes modèles sont plus simples à travailler et à produire des données fiables et relatables.

Ce manuscrit décrit la préparation et la caractérisation synthétiques de deux complexes modèles de pinces de cobalt(II) de LADH. Les deux complexes disposent d’un ligand pince qui contient du soufre, de l’azote et des atomes de donneurs de soufre. Le premier complexe (4) est basé sur un précurseur imidazole, et le second (5) est basé sur un précurseur triazole. Les complexes montrent la réactivité pour la réduction de stoichiométrie des aldéhydes pauvres d’électrons en présence d’un donneur d’hydrogène. Ces résultats de réactivité seront rapportés dans un manuscrit ultérieur.

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Protocole

Synthèse du chloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)pyridine]cobalt(II)tetrachlorocobaltate [4]

  1. Pour préparer le complexe 4, ajouter 0,121 g (3,12 x 10-4 mol) de 2,6-bis (N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)pyridine (C19H25N5S2)6 à 15 mL d’acétonitrile dans un flacon de fond rond de 100 ml. Ensuite, à cette solution, ajouter 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) de chlorure de cobalt (II) hexahydrate (CoCl2'6H2O). La solution de réaction devrait changer la couleur du jaune clair au vert émeraude immédiatement après l’ajout du chlorure de cobalt(II).
  2. Ajouter une barre de remuer au flacon. Reflux et remuer la réaction pendant 20 h pour assurer une réaction complète. Retirer le solvant à l’aide d’un rotovap sous pression réduite.

2. Recrystallization of chloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)pyridine]cobalt(II)tetrachlorocobaltate [4] par diffusion lente de vapeur

  1. Dissoudre le soluté dans l’acétonitrile (7,5 ml), filtrer la solution et placer la solution uniformément dans 1 flacons dram. Remplir chaque flacon de 1,5 ml de solution d’acétonitrile.
    1. Ajouter le coton pour plafonner les flacons, ce qui permet une diffusion lente de vapeur. Ajuster le coton confortablement dans l’ouverture au sommet de la fiole.
    2. Placer les flacons dans un bocal de 240 ml contenant 50 ml d’éther de diéthyle. Fermez le pot avec un bouchon.
    3. Laissez les cristaux se développer sur une période de 1 semaine.
      REMARQUE : La recrystallisation peut prendre plus d’un jour.

3. Synthèse du chloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazole-2-thione)pyridine]cobalt (II)tétrachlorocobaltate [5]

  1. Pour préparer le complexe 5, ajouter 0,183 g (4,70 x 10-4 mol) de 2,6-bis (N-isopropyl-N'-methylenetriazole-2-thione)pyridine (C17H23N7S2)6 à 15 mL d’acétonitrile dans un flacon de fond rond de 100 ml. À cette solution, ajouter 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) d’hexahydrate de chlorure de cobalt (CoCl2à 6H2O). La solution de réaction devrait changer la couleur du jaune clair au bleu royal immédiatement après l’ajout du chlorure de cobalt(II).
    1. Ajouter une barre de remuer au flacon. Reflux et remuer la réaction pendant 20 h pour assurer une réaction complète. Retirer le solvant à l’aide d’un rotovap sous pression réduite.

4. Recrystallization of chloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazole-2-thione)pyridine]cobalt(II)tetrachlorocobaltate [5] par diffusion lente de vapeur

  1. Dissoudre le soluté dans l’acétonitrile (9,0 ml), filtrer la solution et placer la solution uniformément dans 1 flacons dram. Remplir chaque flacon de 1,5 ml de solution d’acétonitrile.
    1. Ajouter le coton pour plafonner les flacons, ce qui permet une diffusion lente de vapeur. Ajuster le coton confortablement dans l’ouverture au sommet de la fiole.
    2. Placer les flacons dans un bocal contenant 50 ml d’éther de diéthyle. Fermez la fiole avec un bouchon.
    3. Laissez les cristaux se développer sur une période de 1 semaine.
      REMARQUE : La recrystallisation peut prendre plus d’un jour.

5. Cristallographie aux rayons X

  1. Montez un cristal de 4 sur une boucle en nylon. Recueillir les données sur un diffractomètre Rigaku Oxford Diffraction. Ici, les données de diffraction aux rayons X sont collectées à 173(2) K. Résoudre la structure cristalline à l’aide de programmes de solutions de structure Olex216 et ShelXT17 à l’aide de méthodes directes. Affiner la structure avec le paquet de raffinement ShelXL18 en utilisant la minimisation du moins de carrés.
  2. Montez un cristal de 5 sur une boucle en nylon. Recueillir les données de diffraction aux rayons X sur un diffractomètre Rigaku Oxford Diffraction. Ici, les données de diffraction aux rayons X sont collectées à 173(2) K. Résoudre la structure cristalline à l’aide de programmes de solutions de structure Olex216 et ShelXT17 à l’aide de méthodes directes. Affiner la structure avec le paquet de raffinement ShelXL18 en utilisant la minimisation du moins de carrés.

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Résultats

Synthèse
Les synthèses des complexes 4 et 5 ont été réalisées avec succès en réagissant à une solution d’acétylière contenant un précurseur de ligand bis-thione avec l’hexahydrate de chlorure de cobalt (II)(figure 2). Cette réaction s’est produite à une température de reflux en présence de l’air. En général, les complexes 4 et 5 ont été observés pour être solubles dans l’acétyonitrile, le sulfoxide de dim...

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Discussion

La préparation des complexes 4 et 5 est facile. L’étape clé consiste à ajouter le solide CoCl2'6H2O à une solution d’acétylure qui contient le précurseur de ligand respectif. La solution devient vert foncé quelques secondes après l’ajout de CoCl26H2O pour former le complexe 4. La solution devient bleu vif après l’ajout de CoCl26H2O pour former le complexe 5. Pour assurer une réaction compl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

John Miecznikowski a reçu le soutien financier de ce projet : la Connecticut NASA Space Grant Alliance (Award Number P-1168), le Fairfield University Science Institute, College of Arts and Sciences Publication Fund, Fairfield L’allocation de recherche d’été de la Faculté d’université et le Programme d’instrumentation de recherche major de la National Science Foundation (Grant Number CHE-1827854) pour obtenir un spectromètre NMR de 400 MHz. Il remercie également Terence Wu (Yale University) pour son aide dans l’acquisition de spectres de masse électrospray. Jerry Jasinski reconnaît le Programme d’instrumentation de recherche de la National Science Foundation-Major Research (Grant Number CHE-1039027) pour les fonds nécessaires à l’achat d’un diffractomètre aux rayons X. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch et Samantha Zygmont reconnaissent que le Programme des boursiers Hardiman a fourni leur allocation de recherche estivale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fiole à fond rond de 100 mlVerre chimiqueCG150691Flacon à fond rond à col unique de 100 ml, joint extérieur 19/22
AcetonitrileFisherHB9823-4Refroidisseur de qualité HPLC
pour roto-vapLaudaL000638Alpha RA 8
Chlorure de cobalt hexahydratéAcros OrganicsAC423571000Acros Organics
ÉtherdiéthyliqueFisherE-138-1éther diéthylique Anhydorus
FisherS63456pour cylindre gradué de 25 mL
Fisher11-100-49SHIsotemp Basic Agitateur
BocauxFisher05-719-481Bocaux de 250 mL
Ligand----------Synthezied précédemment par le professeur Miecznikowski
medium boules de cotonFisher22-456-80boules de coton moyennes
flacons d’un dramFisher03-339flacons d’un dram avec pipette à capuchon doublé TFE
Fisher13-678-20BPipettes de 5,75 pouces
Fisher03-448-21Poire en latex de marque Fisher pour pipette
plat de recristallisation pour bain de sableFisher08-741 D325 mL plat de recristallisation pour condenseur de reflux de bain de sable
Chem GlassCG-1218-A-22Condenseur avec joint intérieur 19/22
RotovapHeidolph Collegiate36000090Brinkmann ; Évaporateur rotatif Heidolph Collegiate avec bain écologique Heidolph WB Évaporateur rotatif Heidolph sable
de mer pourde sable Acros Organics612355000sable de mer lavé pour bain de sable
Barre d’agitationFisher07-910-23Barre d’agitation magnétique en forme d’œuf
Graisse sous videFisher14-635-5DDow Corning High Vacuum Pompe
vide pour rotovapHeidolph Collegiate36302830Heidolph Rotovac Valve Control
Cylindre gradué en Plaque chauffante bain à

Références

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