Un protocole normalisé pour les tests de préférence pour évaluer le bien-être des poissons

Résumé

Un aspect fondamental de l’évaluation du bien-être des animaux en captivité est de se demander si les animaux ont ce qu’ils veulent. Ici, nous présentons un protocole pour déterminer la préférence de logement dans le poisson zèbre (Danio rerio) en ce qui concerne la présence / absence d’enrichissement environnemental et l’accès à l’écoulement de l’eau.

Résumé

Les techniques d’évaluation du bien-être animal tentent de prendre en considération les besoins et les désirs spécifiques de l’animal en question. L’enrichissement (ajout d’objets physiques ou de congénères dans l’environnement du logement) est souvent un moyen de donner aux animaux captifs la possibilité de choisir avec qui ils interagissent et comment ils passent leur temps. Une composante fondamentale de l’environnement aquatique qui est souvent négligée en captivité, cependant, est la capacité de l’animal à choisir de s’engager dans l’exercice physique. Pour de nombreux animaux, y compris les poissons, l’exercice est un aspect important de leur histoire de vie, et est connu pour avoir de nombreux avantages pour la santé, y compris des changements positifs dans le cerveau et le comportement. Nous présentons ici une méthode d’évaluation des préférences en matière d’habitat chez les animaux captifs. Le protocole pourrait facilement être adapté pour examiner une variété de facteurs environnementaux (p. ex., le gravier par rapport au sable comme substrat, les plantes plastiques par rapport aux plantes vivantes, le faible débit par rapport à l’écoulement élevé de l’eau) dans différentes espèces aquatiques, ou pour une utilisation avec des espèces terrestres. L’évaluation statistique de la préférence est effectuée à l’aide de l’indice de préférence de Jacob, qui classe les habitats de -1 (évitement) à 1 (le plus préféré). Avec cette information, il peut être déterminé ce que l’animal veut du point de vue du bien-être, y compris leur emplacement préféré.

Introduction

Les règlements régissant la façon dont les animaux de laboratoire devraient être logés en captivité sont explicites et bien définis. L’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International supervise et gère toutes les organisations et institutions qui travaillent avec les animaux de recherche et a des lignes directrices spécifiques pour l’élevage et le logement adaptés aux espèces. Par exemple, l’Orientation de l’AAALAC sur le logement et l’attention des poissons zèbres, Danio Rerio^1, « encourage fortement » l’utilisation de l’enrichissement (ajout d’objets physiques ou de congénères dans l’environnement du logement) lorsqu’il loge des poissons zèbres en captivité. Le guide poursuit en ces qui concerne les « plantes ou structures artificielles qui imitent l’habitat du poisson zèbre permettent aux animaux de choisir dans leur environnement ».

Les preuves suggèrent que l’enrichissement peut stimuler la croissance de nouveaux neurones (neurogenèse) dans les zones du cerveau impliquées dans le traitement de l’information spatiale², et on pense que ces changements neuronaux sont associés à une capacité d’apprentissage améliorée³. Les effets de l’enrichissement sur la neurogenèse et l’apprentissage ont été largement étudiés à travers divers taxons, y compris les poissons^4,5, oiseaux⁶, reptiles⁷, et les mammifères⁸. Bien que ces types d’études soient importants pour comprendre les effets de l’enrichissement sur le cerveau et le comportement, ils ne prennent pas en considération les choix ou les préférences particulières des animaux pour un environnement particulier par-dessus un autre.

Une question fondamentale à se poser lors de l’évaluation du bien-être des animaux captifs est de savoir si oui ou non les animaux ont ce qu’ils veulent⁹. Une façon d’étudier cette question qui fournit des preuves tangibles est de fournir aux animaux des choix qui nous permettent de comprendre leurs préférences subjectives. Par exemple, deux études ont cherché à savoir si le poisson zèbre préfère avoir accès à un environnement enrichi ou à un environnement ordinaire, les deux études indiquant une préférence pour les zones qui contiennent de l’enrichissement^10,11. Cependant, il a également été suggéré que le poisson zèbre semble indifférent à l’enrichissement environnemental¹², de sorte que la réponse à la question n’est évidemment pas claire. Une autre application des tests de préférence associés au bien-être animal s’étend à essayer de comprendre comment différents aspects d’un environnement enrichi jouent un rôle dans les choix d’un animal individuel fait. Dans le seul poisson, différents types d’enrichissement ont des effets différentiels sur le cerveau et le comportement, et cette relation est encore compliquée par les différences individuelles dans les traits de personnalité¹³. En outre, les tests de préférence pourraient être utiles pour les études comparatives de l’enrichissement de l’environnement. Même à travers différentes espèces de poissons, l’enrichissement a été montré pour avoir un effet sur de nombreux types de comportement, y compris l’agression¹⁴, l’audace¹⁵, la locomotion¹⁶, et le comportement de prise de risque¹⁷.

L’indice de préférence de Jacob est un test statistique qui est fréquemment utilisé pour quantifier les préférences en matière de logement¹⁸. L’indice de préférence de Jacob attribue une valeur à chaque habitat différent en fonction du nombre d’animaux présents dans chaque type d’habitat à des moments différents, où les préférences vont de -1 (évitement) à 1 (le plus préféré). Nous décrivons ici une méthode d’utilisation de l’indice de préférence de Jacob pour étudier les préférences en matière de logement chez les poissons et prenons l’exemple de l’évaluation de deux caractéristiques importantes du milieu aquatique : 1) la présence ou l’absence d’enrichissement; et 2) le débit de l’eau¹⁹. Cependant, le protocole pourrait facilement être adapté pour examiner une variété de facteurs environnementaux (p. ex., le gravier par rapport au sable comme substrat, les plantes plastiques par rapport aux plantes vivantes, le débit d’eau faible par rapport à l’eau élevée) à travers différentes espèces et paysages (p. ex., aquatique salet et terrestre).

Protocole

L’étude actuelle a l’approbation et se conforme à toutes les exigences des protocoles de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie; IACUC no 46466.

1. Configuration de l’appareil de préférence

1. Obtenir l’approbation du Comité de soins aux animaux (ou organisation équivalente) de l’Institut pour toutes les procédures expérimentales et d’élevage impliquant des animaux vivants avant de commencer l’expérience.
2. Utilisez un réservoir expérimental en plastique blanc opaque. Les murs entre les zones sont fabriqués à partir d’acrylique gris qui est fixé en place avec du scellant de silicium.
   REMARQUE : La taille du réservoir expérimental dépend de la taille de l’espèce d’intérêt et du nombre d’individus utilisés (p. ex., pour 8 poissons zèbres adultes, un réservoir de 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H est recommandé).
3. Diviser le réservoir expérimental en quatre zones qui varient en fonction des paramètres spécifiques de l’habitat à tester. Parmi les différents types d’enrichissement à étudier, mentionnons le substrat sablonneux par rapport au substrat rocheux, les plantes artificielles par rapport aux abris, ou l’écoulement de l’eau par rapport à la présence de plantes artificielles (figure 1).
   1. Si vous utilisez l’écoulement de l’eau comme paramètre d’intérêt, utilisez de petites pompes pour fournir des jets d’eau (voir Tableau des matériaux). Définir les pompes à une vitesse choisie afin qu’elles fournissent un débit constant et dirigé de l’eau. Choisissez la vitesse désirée en fonction de l’écologie et de l’histoire de la vie de l’espèce (p. ex., 14 cm/s pour le poisson zèbre).
4. Au milieu du réservoir expérimental, avoir une arène centrale où la nourriture est livrée (Figure 1). L’accès à l’arène centrale à partir de chaque zone se fait par une petite ouverture dans les murs séparant. L’ouverture est assez grande pour que les espèces d’intérêt se déplacent entre les zones sans entrave, mais assez petites pour réduire les indices visuels que les poissons pourraient éprouver d’autres zones.
5. Placez un biofiltre et un chauffe-eau dans chaque coin du réservoir, mais à l’extérieur de la zone expérimentale afin de ne pas perturber l’écoulement de l’eau et d’assurer une température constante de l’eau dans toutes les zones.
6. Installez d’autres réservoirs expérimentaux selon les besoins de l’espace. Faites pivoter les différentes zones de chaque réservoir expérimental pour limiter tout biais séquentiel. Assurez-vous que tous les réservoirs répliqués ont des conditions uniformes (mêmes niveaux de lumière, température de l’eau, etc.)
7. Placez des caméras (voir Tableau des matériaux)sur des trépieds directement au-dessus de chaque réservoir expérimental, de sorte que toutes les zones soient visibles. Évitez les lentilles grand angle et assurez-vous que les cartes mémoire ont suffisamment d’espace pour l’enregistrement.
8. Définir l’éclairage de la pièce sur un cycle graduel (p. ex., 1/2 h) 12 L : 12 D pour simuler le lever et le coucher du soleil. Maintenir la température de l’eau à 25 et 1 oC.

2. Capture, acclimatation et procédure

1. Gardez les poissons dans des réservoirs lorsqu’ils ne sont pas testés. Net tous les poissons d’essai de leurs réservoirs à la maison et placedans l’arène centrale du réservoir expérimental (Jour 1). Réduire les temps de capture pour réduire le stress (p. ex., moins de 30 s).
   REMARQUE : Une autre procédure pour transférer le poisson de leur réservoir d’attache au réservoir expérimental qui peut minimiser le stress est de transporter le poisson dans un bécher d’eau de réservoir.
2. Conservez le nombre et le sexe des poissons dans chaque réservoir expérimental constant à travers les réservoirs de répétition et choisissez en fonction de la taille de l’espèce et de l’écologie.
3. Les jours 1 à 4, les poissons passent du temps à s’acclimater et à explorer les différentes zones. Ne collectez pas de données ces jours-ci.
   REMARQUE : Prolonger ou réduire le nombre de jours pour l’acclimatation en fonction du protocole expérimental particulier. Cependant, la période d’acclimatation devrait être suffisante pour minimiser les effets de la manipulation ainsi que pour obtenir les poissons habitués à l’alimentation dans l’appareil.
4. Pendant la période d’acclimatation, surveillez de près la qualité de l’eau en effectuant régulièrement des tests de qualité de l’eau (p.p., pH, nitrate ou nitrite) et remplacez l’eau si des problèmes sont détectés (voir Tableau des matériaux).
5. Nourrir les flocons de poisson (voir Tableau des matériaux)dans l’arène centrale à l’aide d’un anneau de nourriture flottant (voir Tableau des matériaux) fixé au mur de l’arène centrale à la surface de l’eau. Un anneau alimentaire assure que les particules alimentaires restent dans l’arène centrale et ne présentent pas de biais pour les zones en raison de la dérive des aliments.
6. Donnez au poisson 0,5 h pour nourrir ad libitum avant d’enlever les restes de nourriture du réservoir expérimental avec un filet de trempette. Nourrir le poisson une fois le matin et une fois l’après-midi.
7. Évaluer les comportements les jours 5 à 7. Allumez les caméras et enregistrez les comportements des poissons pendant 2 h après chaque alimentation prévue le matin et l’après-midi. Le jour 8, retirez tous les poissons des réservoirs expérimentaux avec un filet de trempette et placez-les dans leurs réservoirs d’origine.
8. Selon la quantité d’eau de puisard disponible, remplacez au moins un 1/3 de l’eau dans le réservoir expérimental par de l’eau douce pour réduire les effets des hormones de stress sur les poissons dans les répliques suivantes.
9. Configurez les réservoirs expérimentaux conformément au calendrier de rotation de la zone pour cette semaine. La rotation des zones diminue le risque de biais comportemental résultant du placement d’une zone par rapport à l’autre. Ensuite, recommencez le processus d’essai avec un nouveau lot de poissons.

3. Mesures et analyse de données

1. Téléchargez les vidéos sur un ordinateur à la fin de chaque journée d’enregistrement. Cela garantit qu’il ya de l’espace sur la carte mémoire avant chaque utilisation.
2. Utilisez un logiciel vidéo (voir Tableau des matériaux) pour quantifier la préférence de zone. Comptez manuellement le nombre de poissons dans chaque zone à intervalles de 5 min au cours de chaque période d’enregistrement de 2 h (inclure l’arène centrale dans ces comptes). Définir le sexe du poisson au cours de l’analyse si la différenciation entre les mâles et les femelles est possible à partir de la séquence vidéo.
3. Pour analyser la préférence de l’habitat, calculez le nombre moyen de poissons par zone pour chaque réservoir répliqué (c.-à-d. la moyenne de toutes les données sur les 3 jours). Afin d’obtenir un score de préférence pour l’utilisation de la structure, calculez l’indice de préférence¹⁵ de Jacobs
   
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   où x est la zone d’intérêt, r_x est le rapport des poissons dans la zone x au nombre total de poissons dans toutes les zones, et p est la proportion disponible de toutes les zones dans le réservoir expérimental. L’indice varie entre 1 euro pour la préférence maximale et 1 pour l’évitement maximal.
4. Pour déterminer s’il y a des changements dans la vitesse à laquelle les poissons passent d’une zone à l’autre au cours d’une période d’observation, calculez le taux d’aiguillage, r_sr, dans la première et dernière 5 min de chaque période d’observation, où r_sr est le nombre de fois qu’un poisson entre dans chaque zone à partir de l’arène centrale, divisé par le nombre total de poissons.
5. Considérez un poisson comme entré dans une zone lorsque tout le corps du poisson traverse l’ouverture séparant les zones. Calculez un taux de démarrage et un taux de commutation moyen de finition pour chaque réservoir de repli. Effectuer toutes les observations comportementales par le même expérimentateur pour réduire tout biais d’observation de l’expérimentateur.
6. À l’aide d’un logiciel statistique (voir Tableau des matériaux),effectuez des analyses statistiques pertinentes. Les analyses suggérées comprennent un ANOVA à sens unique, avec l’indice de préférence comme variable dépendante et la zone comme variable prédictive, et un t-test couplé sur le taux moyen de commutation de démarrage et de finition pour chaque réservoir.
7. Appliquer le test post hoc de comparaison multiple de Tukey pour étudier plus en détail les comparaisons de zone, où chaque zone est comparée les unes aux autres. Une analyse statistique plus complexe comprend des modèles mixtes qui évaluent les effets temporels, les effets d’arène, les effets sexuels ou même les différences individuelles de comportement.

Résultats

Nous avons utilisé le test de préférence pour étudier les préférences de logement chez le poisson zèbre étant donné un choix entre l’enrichissement variable comprenant 1) les usines en plastique et le substrat sablonneux ; et 2) l’écoulement de l’eau. Celles-ci ont été divisées en quatre zones: (i) Enrichi seulement; (ii) Flux uniquement; (iii) Enrichi et flow; (iv) Plaine; et une arène centrale où la nourriture a été livrée¹⁹. Le poisson zèbre a montré la plus grande préférence pour la zone enric...

Discussion

Nous présentons ici une conception expérimentale qui nous permet d’étudier les préférences des poissons pour différents types d’habitats. Voici quelques étapes critiques qui sont importantes dans les essais de préférence : 1) veiller à ce que des conditions uniformes soient maintenues dans différentes répliques (p. ex., bruits ou mouvements externes, expérimentateur, chimie de l’eau, niveaux de lumière); 2) s’assurer que les zones sont tournées entre les répliques et qu’une quantité importante d’eau est remplacée par de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plantes artificielles d’aquarium	Smarlin	B07PDZQ5M5
Plantes d’eau d’algues artificielles pour aquarium	MyLifeUNIT	PT16L212
Réservoirs expérimentaux	United States Plastic Corporation	6106
Anneau alimentaire flottant	SunGrow	B07M6VWH9V
Débitmètre	YSI	BA1100
Jager Aquarium Thermostat Heater	Ehiem	3619090
Master Water Quality Test Kit	API	34
SPSS Statistics for Macintosh	IBM	Version 25.0
Submersible Pump, SL-Songlong		SL-381
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	16106
Triple Flow Corner Biofilter	Lee’s	13405
Caméra vidéo	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player (logiciel vidéo)	Microsoft	Windows Media Player 12