Ce protocole démontre l’enregistrement en temps réel des relations dose-réponse complètes pour l’activation du GPCR induite par agoniste à partir d’une seule couche cellulaire cultivée sur un seul microélectrode à l’aide de mesures d’impédance sans étiquette. Le nouveau schéma de dosage augmente considérablement le débit sans perte de résolution de temps.
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Article de méthode
Protocole de dosage stepwise pour un débit accru dans les essais GPCR sans étiquette
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les essais sans étiquette basés sur l’impédance sont de plus en plus utilisés pour étudier non invasivement l’activation du GPCR induite par ligand dans les expériences de culture cellulaire. L’approche fournit une surveillance cellulaire en temps réel avec une résolution de temps dépendante de l’appareil jusqu’à plusieurs dizaines de millisecondes et il est hautement automatisé. Toutefois, lorsque le nombre d’échantillons est élevé (p. ex., des études de dose-réponse pour divers ligands différents), le coût des tableaux d’électrodes jetables ainsi que la résolution de temps disponible pour les enregistrements séquentiels de puits par puits peuvent devenir limitatifs. Par conséquent, nous présentons ici un protocole d’addition agoniste en série qui a le potentiel d’augmenter considérablement la production d’essais GPCR sans étiquette. À l’aide du protocole d’addition d’agoniste en série, un agoniste du GPCR est ajouté de façon séquentielle en augmentant les concentrations à une seule couche cellulaire tout en surveillant continuellement l’impédance de l’échantillon (mode agoniste). Avec cette approche sérielle, il est maintenant possible d’établir une courbe dose-réponse complète pour un agoniste GPCR à partir d’une seule couche cellulaire. Le protocole d’addition agoniste en série s’applique à différents types de couplage GPCR, Gq Gi/0 ou Gs et il est compatible avec les niveaux d’expression recombinants et endogènes du récepteur à l’étude. Le blocage des récepteurs par les antagonistes du GPCR est également évaluable (mode antagoniste).
Introduction
Ce rapport présente une description détaillée d’un protocole d’addition en série développé pour la quantification de l’activation du récepteur couplé de protéine G induite par ligand (GPCR) dans les cellules cultivées adhérente par des mesures d’impédance sans étiquette. Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont impliqués dans une multitude de fonctions physiologiques et de maladies humaines1. Pour cette raison et leur bonne accessibilité à la surface des cellules, les GPCR sont l’une des cibles les plus importantes en matière de médicaments. Cette évaluation se reflète dans un nombre estimatif de 700 médicaments approuvés ciblant les ....
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Protocole
1. Ensemencement cellulaire sur des réseaux d’électrodes
REMARQUE : La sélection de la disposition des électrodes est un compromis entre la sensibilité et le nombre de cellules à l’étude. Plus l’électrode est petite, plus la mesure est sensible, mais plus le nombre de cellules à l’étude est faible. Pour les cellules présentant de fortes fluctuations d’impédance au fil du temps dans des conditions de référence, des électrodes plus grosses ou internumérisées sont préférables.
- Préchauffez toutes les solutions nécessaires pour la passage et l’ensemencement cellulaires standard dans un bain d’eau de 37 oC. Pour les essais avec des cell....
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Résultats
Un schéma typique pour la préparation des différentes solutions agonistes est montré pour une expérience utilisant des réseaux d’électrodes à 8 puits avec l’histamine comme agoniste dans les tableaux 1-4. Le tableau 1 et le tableau 2 présentent des volumes et des concentrations pour une expérience utilisant le mode d’ajout 1 (cf., figure 1), tandis que les volumes et les concentrations des points 3 et
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour les mesures d’impédance sans étiquette pour déterminer la relation dose-réponse de l’activation du GPCR induite par agoniste en l’absence ou la présence d’antagonistes spécifiques pour le même récepteur. La preuve de concept de cette méthode a été présentée dans une publication récente12. À notre connaissance, il s’agit de la première étude décrivant l’établissement d’une courbe dose-réponse complète de l’activation du GPCR à médiation agoniste à l’aide d’une s.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions Barbara Goricnick et Nadja Hinterreiter pour leur aide dans la culture cellulaire et la préparation de solutions expérimentales. Les auteurs remercient le soutien financier du Research Training Group 1910 «Medicinal chemistry of selective GPCR ligands» financé par la Fondation allemande de recherche (DFG) sous le numéro de subvention 222125149. JAS est particulièrement reconnaissant pour une bourse accordée par le Programme bavarois pour l’égalité des sexes.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bü ; Chambre de comptage de | Marienfeld (Lauda-Kö ; nigshofen, Allemagne) | 640210 | |
| flacons de culture cellulaire 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Allemagne) | 690175 | |
| Incubateur cellulaire (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne) | \ | |
| Centrifugeuse (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne) | \Chlorhydrate | |
| de diphénhydramineSigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne) | D3630 | ||
| Eagle’s Minimum Essential Medium avec 4,5 g/L de D-glucose et 2,2 g/L de NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne) | Instrument d’impédance D5671 | |
| (ECIS Z&theta ;) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, États-Unis) | \ | |
| Réseaux d’électrodes à 8 puits (PET 8W1E) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, États-Unis) | \ | Base en PET avec électrode de travail de 0,049 mm2 et contre-électrode de ~50 mm2 (or) |
| Réseaux d’électrodes à 96 puits (PET 96W1E+) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | Base PET avec deux électrodes (or) avec 0,256 mm2 surface totale d’électrode |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Biochrom (Berlin, Allemagne) | S0615 | |
| Chlorhydrate d’histamine | Carl Roth (Karlsruhe, Allemagne) | 4017.1 | |
| Hotte à flux laminaire (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne) | 51022515 | enceinte de sécurité classe II |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µ ; L) | Brandt (Wertheim, Allemagne) | 704780 | |
| Micropipette grande (20 - 200 µ ; L) | Brandt (Wertheim, Allemagne) | 704778 | |
| Microscope (contraste de phase, Nikon Diaphot) | Nikon (Dü ; sseldorf, Allemagne) | ||
| Pénicilline/streptomycine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne) | P0781 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne) | D8537 | |
| Pipette sérologique | Greiner bio-one (Frickenhausen, Allemagne) | 607 180 | |
| Pipette (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Allemagne) | 26300 | |
| Trypsine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne) | T4174 | dans PBS avec tube EDTA de 1 mM |
| 15 mL | (Frickenhausen, Allemagne) | 188 271 | |
| tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Allemagne) | 210 261 | |
| cellules U-373 MG | ATCC (Rockville, MD, États-Unis) | Bain-marie ATCC HTB-17 | |
| (TW21) | Julabo (Seelbach, Allemagne) | \ |
Références
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....
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Réimpressions et autorisations
