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Article de méthode

Isolement, culture et induction adipogénique des cellules souches adipeuses originales dérivées de l’adipose de l’adipose de l’adiacisation périortique

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DOI :

10.3791/60691

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2 mars 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, 2Shanghai Institute of Nutrition and Health, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3Shanghai Key Laboratory of Hypertension, Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Department of Cardiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Department of Cardiology, Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour l’isolement, la culture, et l’induction adipogenic des cellules souches adipeuses dérivées de crête neurale (NCADSCs) du tissu adipeux périortique de Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Les NCADSC peuvent être une source facilement accessible d’ADSCs pour la modélisation de l’adipogénèse ou de la lipogenèse in vitro.

Résumé

Une quantité excessive de tissu adipeux entourant les vaisseaux sanguins (tissu adipeux périvasculaire, également connu sous le nom de PVAT) est associée à un risque élevé de maladie cardio-vasculaire. Les ADSC dérivés de différents tissus adipeux présentent des caractéristiques distinctes, et ceux du PVAT n’ont pas été bien caractérisés. Dans une étude récente, nous avons rapporté que quelques ADSCs dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) descendent des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules migratrices provenant de l’ectoderm.

Dans cet article, nous décrivons un protocole pour isoler les nCCs étiquetés par protéines fluorescentes rouges (PD) de la PAAT de Wnt-1Cre.-; Rosa26RFP / souris et induire leur différenciation adipogénique in vitro. En bref, la fraction vasculaire stromal (SVF) est enzymatiquement dissociée de l’APA, et la DP- crête neurale dérivée ADSCs (NCADSCs) sont isolés par le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Les NCADSC se différencient en adipocytes bruns et blancs, peuvent être cryoconservés et conservent leur potentiel adipogénique pour des passages de 3 à 5. Notre protocole peut générer des ADSC abondants à partir du PVAT pour la modélisation de l’adipogénèse PVAT ou de la lipogenèse in vitro. Ainsi, ces NCADSCs peuvent fournir un système précieux pour étudier les commutateurs moléculaires impliqués dans la différenciation PVAT.

Introduction

La prévalence de l’obésité augmente dans le monde entier, ce qui augmente le risque de maladies chroniques connexes, y compris les maladies cardiovasculaires et le diabète1. PVAT entoure les vaisseaux sanguins et est une source majeure de facteurs endocriniens et paracrines impliqués dans la fonction de la vascularisation. Les études cliniques montrent que la teneur élevée en PVAT est un facteur de risque indépendant de la maladie cardio-vasculaire2,3, et sa fonction pathologique dépend du phénotype des cellules souches dérivées de l’adipose constituante (ADSCs)4.

Bien que les lignées cellulaires DaDSC comme la murine 3T3-L1, 3T3-F442A, et OP9 soient des modèles cellulaires utiles pour étudier l’adipogenèse ou la lipogenèse5, les mécanismes de régulation de l’adipogenèse diffèrent entre les lignées cellulaires et les cellules primaires. Les ADSC dans la fraction de cellules vasculaires stromal (SVF) isolées directement des tissus adipeux et induites pour se différencier en adipocytes récapitulent probablement l’adipogenèse in vivo et la lipogenèse6. Cependant, la fragilité, la flottabilité et les variations de taille et d’immunophénotypes des ADSC rendent leur isolement direct difficile. En outre, les différentes procédures d’isolement peuvent également affecter de manière significative le phénotype et la capacité potentielle adipogénique de ces cellules7,soulignant ainsi la nécessité d’un protocole qui maintient l’intégrité d’ADSC.

Le tissu adipeux est typiquement classifié comme tissu d’adipeux blanc morphologiquement et fonctionnellement distinct (WAT), ou le tissu adipeux brun (BAT)8, qui abrite des ADSC distincts9. Tandis que les ADSC isolés des WATs sous-cutanés périgonadalets et inguinals ont été caractérisés dans les études précédentes9,10,11,12, moins est connu concernant les ADSC s’agit de PVAT qui est principalement composé de BAT13.

Dans une étude récente, nous avons constaté qu’une partie des ADSC résidents dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) sont dérivés des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules progénitrices migratoires qui proviennent de l’ectoderm14,15. Des souris transgéniques de Wnt1-Cre ont été employées pour tracer le développement neural de cellules de crête16,17. Nous avons traversé wnt1-Cre- souris avec Rosa26RFP / souris pour générer Wnt-1 Cre- ; Rosa26RFP / Souris, dans lequel les CNC et leurs descendants sont étiquetés avec des protéines fluorescentes rouges (DP) et sont facilement suivis in vivo et in vitro15. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler la crête neurale dérivée aDSCs (NC-dérivé ADSCs, ou NCADSCs) de la souris PAAT et induire les NCADSCs pour se différencier en adipocytes blancs ou adipocytes bruns.

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Protocole

Le protocole animal a été examiné et approuvé par le Comité des soins aux animaux de l’Université Jiao Tong de Shanghai.

1. Génération de Wnt-1 Cre-; Rosa26RFP / Souris

  1. Cross Wnt-1 Cre-/- souris16 avec Rosa26RFP/ souris 18 pour générer Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Maison des souris sous un cycle de lumière/obscurité de 12 h dans une installation exempte d’agents pathogènes à 25 oC et 45 % d’humidité jusqu’à l’âge de 4 à 8 semaines.

2. Dissection du PAAT

REMARQUE: Voir Figure 1.

  1. Stériliser tous les outils chirurgicaux (p. ex. ciseaux chirurgicaux, forceps standard et ciseaux et forceps microchirurgicaux) en autoclantant à 121 oC pendant 30 min.
  2. Préparer le milieu de digestion (High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium [HDMEM] contenant 2 mg/mL de collagène de type I). Préparer le milieu de culture (HDMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal [FBS] et 1% v/v pénicilline-streptomycine [PS]). Stériliser à l’aide d’un filtre à seringues de 0,22 m avant utilisation.
  3. Stérilisez les réactifs de culture cellulaire à l’aide d’UV, d’éthanol, de filtration ou de vapeur, le cas échéant.
  4. Préparer un plat Petri avec Hanks' Balanced Saline Solution (HBSS) et un tube conique de 15 ml avec 10 ml de HBSS complété avec 1% v/v de solution PS. Gardez les deux sur la glace.
  5. Anesthésier les souris15 avec l’isoflurane et le sacrifice par dislocation cervicale. Immerger les corps dans un bécher rempli de 75% d’alcool (200 ml) pendant 5 min pour stériliser la surface de la peau.
  6. Couper et séparer la peau sur l’abdomen et couper le long de la ligne médiane ventrale du bassin au cou. Ouvrez l’abdomen et déplacez le foie pour exposer le diaphragme19.
  7. Couper le diaphragme et les côtes des deux côtés de la ligne médiane et exposer le cœur et les poumons en épluchant les côtes.
  8. Retirer le poumon et le thymus et extraire le PAAT avec l’aorte et le cœur.
  9. Couper l’aorte à la racine aortique pour enlever le cœur. Faire une coupe entre l’arc aortique et l’aorte descendante et séparer soigneusement le tissu adipeux entourant les deux structures et les artères carotides communes gauches et droites de la paroi thoracique postérieure. Transférer le tissu dans le tampon HBSS glacé dans le plat Petri.
  10. À l’aide de forceps stériles, retirer autant de la vascularisation (p. ex., aorte, artères carotides courantes et autres petites vascularisations) et le fascia possible, et transférer le tissu adipeux dans les tubes d’Eppendorf de 2 ml contiennent un tampon HBSS de 0,5 ml de glace sur la glace.

3. Isolement de la SVF

Recueillir le PAAT de 5-6 souris dans un tube microcentrifuge de 2 ml contenant 1 ml de milieu de digestion fraîchement préparé et hacher le tissu à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans un tube Eppendorf à température ambiante (RT).

  1. Transférer le mélange dans des tubes de 50 ml contenant 9 ml du milieu de digestion. Homogénéiser les tissus en faisant monter et descendre avec une pipette 10x de 1 ml.
  2. Incuber les tubes à 37 oC avec des secousses constantes à 100 tr/min pendant 30 à 45 min et vérifier toutes les 5 à 10 min pour éviter la surdigestion. Ceci est essentiel à l’amélioration de la viabilité et du rendement des cellules.
    REMARQUE : Une bonne digestion des tissus se traduira par un tissu adipeux jaune clair homogène qui est visible à l’œil nu en tourbillonnant doucement le tube.
  3. Arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de HDMEM contenant 10% FBS et 1% v/v PS à RT et bien mélanger par pipetting.
  4. Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à RT. Le SVF sera visible sous forme de granule brunâtre. Aspirez soigneusement les adipocytes flottants et décants le reste du supernatant sans déranger le SVF. Dissoudre la pastille SVF dans 10 ml de milieu de culture et filtrer à travers une passoire à cellules de 70 m.
  5. Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min, retirez le supernatant et suspendez doucement la pastille dans 5 mL de tampon de lyse érythrocyte dans un tube conique de 15 ml pendant 10 min à RT.
  6. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 ml de 1x PBS contenant 1% FBS. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 oC, retirer le supernatant et resuspendre la pastille en 10 ml de 1x PBS contenant 1 % de FBS.
  7. Centrifuger à nouveau les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de milieu de culture dans un tube conique de 15 ml à 4 oC.
  8. Après un dernier tour de centrifugation (500 x g pour 5 min à 4 oC), resuspendre les cellules granulées en 5 ml de tampon FACS (PBS contenant 10 % de FBS, 100 unités/mL d’ADN I et 1 % v/v PS) sur la glace, et compter les cellules avec un hémocytomètre.

4. Isolement des NCADSC par les FACS

  1. Configurez et optimisez le trieur cellulaire en suivant le manuel d’instructions. Sélectionnez la buse de 100 m, stérilisez les tubes de collecte, installez le dispositif de collecte requis et configurez les flux latéraux20.
  2. Un laser jaune/vert de 561 nm et un filtre optique 579/16 sont recommandés pour le tri descellules de la DP. Effectuer la compensation en utilisant le contrôle négatif et les contrôles positifs non tachés. Voir Figure 2A pour le schéma de gating.
  3. Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 m, centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min, et resuspendre les cellules dans 2 ml de tampon FACS à une densité de 0,5 x 1 x 107/mL. Transférer les cellules dans des tubes de polystyrène ronds de 5 ml clairement étiquetés et charger dans le trieur.
  4. Exécuter le tube d’échantillon expérimental à 4 oC, allumer les plaques de déviation et trier en un tube conique de 15 ml précouché avec RPMI contenant 1 % de FBS et 1 % de v/v PS.
    REMARQUE : Protégez les échantillons de la lumière forte pour minimiser l’étanchéité de la DP.

5. Culture des NCADSC

  1. Plaquer les cellules triées à une densité de 5 000 cellules/cm2 dans une plaque de culture de 12 puits dans un milieu de culture complet et incuber à 37 oC dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2 pour 20 à 24 h.
  2. Enlever le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS préchauffé (37 oC) pour enlever les débris cellulaires et ajouter un milieu de culture frais.
  3. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 à 90 %, digérez la monocouche à l’aide d’une solution EDTA de trypsine de 0,25 % à 37 oC dans un incubateur de 3 à 5 min, et neutralisez-la avec 2 ml de milieu de culture.
  4. Centrifuger les cellules récoltées pendant 15 min à 250 x g à RT, enlever le supernatant, et resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture. Comptez les cellules avec un hémocytomètre.
  5. Ensemencer les cellules dans une plaque de culture de 12 puits à la densité de 5 000 cellules/cm2.
  6. Resuspendre les cellules restantes dans le milieu de culture contenant 10% de DMSO, congeler et stocker dans l’azote liquide.

6. Induction adipogénique des NCADSC

  1. Induire la différenciation adipogénique des NCADSCs à 80-90% de confluence et conditions de culture standard21.
  2. Pour l’induction adipogénique brune, traitez d’abord les cellules cultivées avec le milieu d’induction adipogénique brun (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1M/L dexamethasone, 1 'M/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, et 1 'g/mL insuline) pendant 2 jours. Laver les cellules avec pbS 2x et les remplacer par un milieu frais (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 m/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, et 1 'g/mL insuline). Changez ce médium tous les 2 jours pour un total de 3 à 5x.
  3. Pour l’induction adipogénique blanche, traitez d’abord les cellules avec le milieu adipogenic blanc d’induction (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1 M/L dexamethasone, et 1 'g/mL insuline) pendant 2 jours. Laver les cellules avec du PBS 2x et les remplacer par un milieu frais (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, et 1'g/mL d’insuline). Changez ce milieu tous les 2 jours pour un total de 3-5x.
  4. Analyser les cellules adipogéniques le cas échéant.
    REMARQUE : Soyez doux lorsque vous lavez les cellules avec du PBS. Les adipocytes différenciés peuvent facilement se laver.

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Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons obtenu 0,5 à 1,0 x 106 ADSC de 5 à 6 Wnt-1Cre.-; Rosa26Souris De p. 100 (48 semaines, mâle ou femelle).

Le diagramme d’écoulement de la collection de PAAT des souris est présenté dans la figure 1. La morphologie des NCADSCs était semblable à l’ADSC d’autres tissus adipeux de souris. Les NCADSC cultivés ont atteint 80 à 90 % de confluence après 7 à 8 jours de culture, et les NCA...

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Discussion

Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique des NCADSC extraits du PVAT de Wnt-1Cre. Rosa26RFP / souris transgéniques conçues pour produire des PDSA. Les rapports précédents montrent qu’il n’y a pas de différence significative dans l’expression des marqueurs mésenchymal sénogènes (MSC) généraux dans les NCADSCets et non NCADSCs22, et que les NCADSCont ont un fort potentiel de se différencier en adipo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

National Key R-D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), et Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ont fourni les fonds pour cette étude .

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % PFABBI sciences de la vieE672002-0500Lot # : EC11FA0001
AgaroseABCONE (Chine)A479021 % concentration de travail
Anti-cebp/&alpha ;ABclonalA0904Concentration de travail 1:1000
Anti-IgG de souris, CST7076Concentration de travail 1:5000
Anti-perilipinAbcamAB616821 &mu ; g/mL de concentration de travail ; lot # : GR66486-54
Anti-PPARySANTA CRUZsc-72730.2 &mu ; g/mL concentration de travail
Anti-IgG de lapin, HRPlié CST7074Concentration de travail 1:5000
Anti-&bêta ;-tubulineCST2146Concentration de travail 1:1000
BSAVWR sciences de la vie0332-100G50 mg/mL concentration de travail ; lot # : 0536C008
Collagénase, type IGibco17018029
DexaméthasoneSigma-AldrichD49020.1 et micro ; M concentration de travail
Tampon de lyse érythrocytaireInvitrogen00-4333
FBSCorningR35-076-CV50 mg/mL concentration de travail ; lot # : R2040212FBS
HBSSGibco14025092
HDMEMGelifesciencesSH30243.01Lot # :
AD20813268 IBMXSigma-AldrichI70180,5 mM de travail concentration
InsulineSigma-AldrichI3536 1&mu ; g/mL concentration de travail
Pince microchirurgicaleSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chine)MR-F201A-1
Ciseaux microchirurgicauxSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chine)MR-H121A
Oil Red O solutionSigma-AldrichO15160,3 % concentration de travail
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)ABCONE (Chine)P41970
Pénicilline-StreptomycineGibco15140122
PrimeScript RT reagent kitTAKARARR047ALot # : AK4802
RNeasy kitTAKARA9767Lot # : AHF1991D
Rosa26RFP/+ sourisJAXNo.007909C57BL/6 backgroud ; mâle et femelle
RosiglitazoneSigma-AldrichR24081 &mu ; M concentration de travail
Pince standardSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chine)MR-F424
Ciseaux chirurgicauxSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chine)MR-S231
SYBR Premix Ex TaqTAKARARR420ALot # : AK9003
TriiodothyronineSigma-AldrichT287710 nM concentration
de travailWnt1-Cre+ ; PPAR&gamma ; flox/flox sourisJAXn° 009107C57BL/6 backgroud ; mâle et femelle
lié à la HRP

Références

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