Ce protocole décrit une technique pour visualiser le comportement et la mort de macrophage dans le poisson zèbre embryonnaire pendant l'infection de marinum de Mycobacterium. Des étapes pour la préparation des bactéries, l'infection des embryons et la microscopie intravitale sont incluses. Cette technique peut être appliquée à l'observation du comportement cellulaire et de la mort dans des scénarios similaires impliquant une infection ou une inflammation stérile.
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Article de méthode
Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale
Dans cet article
Résumé
Résumé
Zebrafish est un excellent organisme modèle pour étudier le comportement inné des cellules immunitaires en raison de sa nature transparente et la dépendance uniquement sur son système immunitaire inné au cours du développement précoce. Le modèle d'infection du poisson zèbre Mycobacterium marinum (M. marinum) a été bien établi dans l'étude de la réponse immunitaire de l'hôte contre l'infection mycobactérienne. Il a été suggéré que différents types de décès de cellules de macrophage mèneront aux résultats divers de l'infection mycobactérienne. Ici nous décrivons un protocole utilisant la microscopie intravitale pour observer la mort de cellules de macrophage dans les embryons de poisson zèbre suivant l'infection de M. marinum. Les lignées transgéniques de poisson zèbre qui étiquetent spécifiquement les macrophages et les neutrophiles sont infectées par microinjection intramusculaire de M. marinum étiqueté fluorescent dans le cerveau moyen ou le tronc. Les embryons de poissons zèbres infectés sont ensuite montés sur une faible fonte de l'agarose et observés par microscopie confocale dans les dimensions X-Y-Z-T. Parce que l'imagerie en direct à long terme nécessite l'utilisation d'une faible puissance laser pour éviter le blanchiment photo et la phototoxicité, un transgénique fortement exprimant est fortement recommandé. Ce protocole facilite la visualisation des processus dynamiques in vivo, y compris la migration des cellules immunitaires, l'interaction des agents pathogènes hôtes et la mort cellulaire.
Introduction
L'infection mycobactérienne a été démontrée pour causer la mort de cellules immunitaires d'hôte1. Par exemple, une souche atténuée déclenchera l'apoptose dans les macrophages et contiendra l'infection. Cependant, une souche virulente déclenchera la mort des cellules lytiques, provoquant la dissémination bactérienne1,2. Compte tenu de l'impact de ces différents types de mort cellulaire ont sur la réponse antimycobactérienne hôte, une observation détaillée de la mort des cellules macrophages pendant l'infection mycobactérienne in vivo est nécessaire.
Les méthod....
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Protocole
Le poisson zèbre a été élevé dans des conditions standard conformément aux directives sur les animaux de laboratoire pour l'examen éthique du bien-être animal (GB/T 35823-2018). Toutes les expériences de poisson zèbre dans cette étude ont été approuvées (2019-A016-01) et menées au Centre clinique de santé publique de Shanghai, Université Fudan.
1. M. marinum Single Cell Inoculum Preparation (Figure 1)
- Décongeler le stock de glycérol De Cerulean-fluorescent M. marinum à partir de -80 oC et inoculer une plaque d'agar de 7H10 avec 10 % (v/v) OADC, 0,25 % de glycérol et 50 g/mL d'hygromy....
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Résultats
L'infection à mycobactère peut déclencher différentes réponses de l'hôte en fonction des voies d'infection. Dans ce protocole, les embryons de poissons zèbres sont infectés par une microinjection intramusculaire de bactéries étiquetées fluorescentes dans le cerveau ou le tronc(figure 3) et observés par imagerie vivante confocale. L'infection par ces deux voies limitera localement l'infection causant le recrutement inné de cellules immunitaires et la mort cellulaire suivante.
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Discussion
Ce protocole décrit la visualisation de la mort de macrophage pendant l'infection mycobactérienne. Basé sur des facteurs tels que l'intégrité de la membrane cellulaire, la mort cellulaire induite par l'infection peut être divisée en apoptose et la mort des cellules lytiques24,25. La mort cellulaire lytique est plus stressante pour l'organisme que l'apoptose, car elle déclenche une forte réponse inflammatoire 24,
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions le Dr Zilong Wen d'avoir partagé des souches de poissons zèbres, le Dr Stefan Oehlers et le Dr David Tobin pour le partage des ressources liées à M. marinum, Yuepeng He pour son aide dans la préparation des chiffres. Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), l'Outstanding Youth Training Program de la Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.), et Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| Seringue 10 mL | Solarbio | YA0552 | |
| 10 % OADC | BD | 211886 | |
| Acide 3-aminobenzoïque | Sigma | E10521 | |
| 5 &mu ; m filtre | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 &mu ; l/ml hygromycine | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A fond en verre Plat de 35 mm | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Microscope confocal | Leica | TCS SP5 II | |
| Chambre environnementale | Pecon | temp control 37-2 microchargeur numérique | |
| Eppendorf | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Lame de microscope en verre | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycérol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubateur | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Aiguille de micro-injection | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjecteur | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulateur | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12 :cerulean | Réf. : PMID 25470057 ; 27760340 | ||
| Rouge phénol | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Lame de microscope en verre à concavité unique | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotomètre (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4 :eGFP) | Ref. : PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a :eGFP ; lyzDsRed2) | Ref. : PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1 :LRLG ; lyz :eGFP) | Ref. : PMID 27424497 ; 17477879 |
Références
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathw....
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Réimpressions et autorisations
