Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

L'infection mycobactérienne a été démontrée pour causer la mort de cellules immunitaires d'hôte^1. Par exemple, une souche atténuée déclenchera l'apoptose dans les macrophages et contiendra l'infection. Cependant, une souche virulente déclenchera la mort des cellules lytiques, provoquant la dissémination bactérienne^1,2. Compte tenu de l'impact de ces différents types de mort cellulaire ont sur la réponse antimycobactérienne hôte, une observation détaillée de la mort des cellules macrophages pendant l'infection mycobactérienne in vivo est nécessaire.

Les méthodes conventionnelles pour mesurer la mort cellulaire sont d'utiliser des taches de cellules mortes, telles que Annnexin V, TUNEL, ou acridine orange / propidium iodide coloration^3,4,5. Cependant, ces méthodes sont incapables de faire la lumière sur le processus dynamique de la mort cellulaire in vivo. L'observation de la mort cellulaire in vitro a déjà été facilitée par l'imagerie en direct⁶. Cependant, si les résultats imitent avec précision les conditions physiologiques reste peu clair.

Le poisson zèbre a été un excellent modèle pour étudier les réponses anti-mycobacterium hôte. Il a un système immunitaire très conservé semblable à celui des humains, un génome facilement manipulé, et les premiers embryons sont transparents, ce qui permet l'imagerie en direct^7,8,9. Après l'infection par M. marinum, le poisson zèbre adulte forme des structures granulomes matures typiques, et le poisson zèbre embryonnaire forme un granulome précoce comme les structures^9,10. Le processus dynamique de l'interaction immunisée innée de cellules-bactéries a été exploré précédemment dans le modèle d'infection de M. marinum de poissons-zèbres^11,12. Cependant, en raison de l'exigence de résolution spatio-temporelle élevée, les détails entourant la mort des cellules immunitaires innées restent en grande partie indéfinis.

Ici nous décrivons comment visualiser le processus de la mort de cellules lytiques de macrophage déclenchée par l'infection mycobactérienne in vivo. Ce protocole peut également être appliqué à la visualisation du comportement cellulaire in vivo pendant le développement et l'inflammation.

Le poisson zèbre a été élevé dans des conditions standard conformément aux directives sur les animaux de laboratoire pour l'examen éthique du bien-être animal (GB/T 35823-2018). Toutes les expériences de poisson zèbre dans cette étude ont été approuvées (2019-A016-01) et menées au Centre clinique de santé publique de Shanghai, Université Fudan.

1. M. marinum Single Cell Inoculum Preparation (Figure 1)

1. Décongeler le stock de glycérol De Cerulean-fluorescent M. marinum à partir de -80 oC et inoculer une plaque d'agar de 7H10 avec 10 % (v/v) OADC, 0,25 % de glycérol et 50 g/mL d'hygromycine. Incuber la plaque à 32 oC pendant environ 10 jours.
2. Sélectionnez une colonie exprimant une fluorescence positive et inoculer 3 mL de 7H9 milieu avec 10% OADC, 0,5% de glycérol, et 50 'g/mL d'hygromycine.
   1. Incuber l'inoculation à 32 oC et 100 tours par minute (rpm) pendant 4 à 6 jours jusqu'à ce que la culture atteigne la phase logarithmique (OD₆₀₀ à 0,6 à 1,0).
   2. Sous-culture (1:100) dans 30 ml de milieu frais 7H9 avec 10% OADC, 0,5% de glycérol, 0,05% Tween-80, et 50 g/mL jusqu'à ce que l'OD₆₀₀ atteigne 1,0.
      REMARQUE: Pour la plus haute qualité de culture, une étape de sous-culture est recommandée à ce stade. D'après notre expérience, l'ajout du clone directement à un grand volume de milieu entraînera la formation d'amas bactériens.
3. Recueillir les cellules M. marinum comme décrit ci-dessous.
   1. Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 10 min pour recueillir le M. marinum comme granule. Jetez tous les sauf 300 L du supernatant et utilisez-le pour resuspendre le granule.
   2. Ajouter 3 mL de 7H9 moyen avec 10% de glycérol pour resuspendre davantage la pastille, puis sonicate la suspension dans un bain d'eau à 100 W à 15 s ON, 15 s OFF pour un total de 2 min.
      REMARQUE: Le but de la sonication est d'atteindre un homogénéisme cellulaire unique pour l'inoculum, ce qui permettra d'éviter le blocage de l'aiguille microinjection.
4. Transférer la suspension bactérienne sur une seringue de 10 ml, puis passer à travers un filtre de 5 m pour enlever les amas bactériens.
5. Mesurez la densité optique (OD) de la suspension à l'aide d'un spectrophotomètre et diluez-la à l'OD₆₀₀ à 1,0 avec un support 7H9 contenant 10 % de glycérol. Divisez la suspension en 10 aliquots ll et entreposez-la à -80 oC de congélateur pour une utilisation future.
6. Confirmer la concentration bactérienne de l'inoculum (cfu/mL) par dilution en série et placage du stock bactérien sur une plaque d'agar 7H10 contenant 10 % (v/v) d'OADC, 0,5 % de glycérol et 50 g/mL d'hygromycine.

2. Préparation d'embryons de poisson zèbre

1. Un jour avant le frai, installez des couples reproducteurs de poissons zèbres dans la chambre de reproduction.
   REMARQUE : Ajoutez une seule paire à chaque chambre de reproduction.
2. Recueillir les embryons le lendemain matin dans un délai de 1 h après la fécondation (hpf). Lavez soigneusement les embryons avec de l'eau distillée et transférez jusqu'à 100 embryons dans un plat Petri de 100 mm contenant 30 ml de milieu E3. Incuber à 28,5 oC.
3. Après 12 h, observez au microscope et jetez les œufs non fécondés ou endommagés.
4. À 24 hpf, changer le milieu Moyen à frais e3 avec N-phénylthiourea (PTU, 0,2 nM concentration finale) pour empêcher le développement du pigment. Incuber les embryons à 28,5 oC jusqu'à ce que les embryons soient prêts pour la microinjection.

3. Infection par microinjection bactérienne

1. Préparer des aiguilles d'injection microcapillaires en verre borosilicate telles que décrites précédemment dans la référence¹³.
2. Embryons de poisson zèbre s'élevant pour l'infection
   1. Micro-ondes 100 ml de 1 % (w/v) et 100 ml de 0,5 % (w/v) faible fusion agarose dans un milieu E3 autoclaved jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondue. Diviser en tubes aliquot de 1 ml et conserver à 4 oC pour une utilisation future.
   2. Avant de l'utiliser, chauffer l'agarose dans un bloc de chauffage de 95 oC jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu. Maintenir l'agarose sous forme liquide en la plaçant dans un bloc de chauffage de 45 oC (figure 2).
   3. Montage pour infection intramusculaire dans la région du tronc
      1. Créez la couche inférieure d'agarose en versant 0,5 ml de 1 % (w/v) agarose uniformément sur une lame de verre. Placer sur une glacière ou une surface froide pendant 3 min pour se solidifier.
      2. Anesthésiez les embryons de poissons zèbres (48 à 72 hpf) dans l'eau des œufs avec de la tricaine (200 g/mL) et du PTU pendant 5 min avant le montage. Placez jusqu'à 60 embryons de poissons zèbres sur la couche inférieure d'agarose et étalez-les soigneusement en deux rangées (Figure 2B).
      3. Enlever toute l'eau restante sur la couche inférieure d'agarose avec du papier de soie avant d'ajouter 0,3 ml d'agarose de 0,5 % (w/v) pour créer la couche supérieure. Assurez-vous que les embryons sont complètement intégrés dans l'agarose. Remettre la glissière en verre dans la glacière à nouveau pour solidifier l'agarose et prévenir la déshydratation.
      4. Gardez la couche supérieure d'agarose humide en recouvrant la surface avec de l'eau d'oeuf s'écoulant e3.
   4. Montage pour l'infection de midbrain
      1. Couvrir la rainure d'une seule glissière de microscopie en verre de concavité avec 1% (w/v) agarose, puis transférer les 4-6 embryons anesthésiés tricaine dans l'agarose.
      2. Placez soigneusement la tête de chaque embryon vers le haut à l'avance à l'avance avec une aiguille de 10 G (figure 2C).
      3. Une fois que les positions de tous les embryons sont fixées, transférez la glissière de verre dans une glacière ou une surface froide pour laisser l'agarose se solidifier.
         REMARQUE : Évitez la dilution de l'agarose faible ment en minimisant le volume de transfert d'eau d'oeuf avec les embryons.
3. Préparation des bactéries à l'infection
   1. Ajouter 1 l de rouge phénol filtré stérile (10x) à un aliquot de 10 l de bouillon bactérien (fait à l'étape 1) et mélanger brièvement en vortexant.
      REMARQUE : La concentration finale peut être ajustée à l'aide de PBS stérile.
   2. Sonicate la préparation en utilisant 100 W à 10 s ON, 10 s OFF pendant 1 min pour briser les amas qui peuvent avoir formé¹⁴.
4. Infection par microinjection
   1. Ajuster le micro-injecteur et le micromanipulateur à la position appropriée et le réglage pour la microinjection comme précédemment rapporté¹³.
   2. Transférer 3 ll de la préparation bactérienne à l'aide d'une micro chargeuse dans l'aiguille préparée (voir l'étape 3.1). Pipette lentement et soigneusement pour éviter de former des bulles d'air.
   3. Pour l'infection de la région du tronc, injecter 100 cfu dans la région du tronc (Figure 3A). Évitez d'injecter des bactéries dans le notochord.
      REMARQUE : Le cfu pour l'injection est estimé par la formule cfu - concentration bactérienne de stock x facteur de dilution x volume de gouttelette d'injection. Le cfu réel est confirmé par le placage d'une goutte d'inoculum bactérien sur une plaque d'agar 7H10 contenant 10% (v/v) d'OADC, 0,5% de glycérol et 50 g/mL d'hygromycine.
   4. Pour l'infection du cerveau moyen, injecter environ 500 cfu dans la région du cerveau moyen (Figure 3B).
   5. Après la microinjection, rincer soigneusement les embryons de poisson zèbre dans l'eau fraîche des œufs avec une pipette en plastique.
      REMARQUE : Montez les embryons dans le plat de fond en verre dès que possible pour couvrir l'observation de la réponse immunitaire innée très tôt.

4. Imagerie en direct de l'infection

1. Montage de poissons pour l'imagerie en direct
   1. Transférer jusqu'à 10 embryons anesthésiés par tricaïne au milieu d'un plat de 35 mm en verre. Jeter le milieu E3 supplémentaire.
   2. Couvrir le plat d'une aagarose à faible point de fusion de 1 % et orienter soigneusement les embryons de poisson zèbre à l'aide d'une aiguille de 10 G. Incuber le plat en verre sur la glace pendant 10 s pour solidifier l'agarose.
      REMARQUE : Pour l'injection de mi-cerveaux, les embryons doivent être montés dans l'agarose avec la tête dirigée vers le haut (figure 4A). Pour l'infection intramusculaire de la région du tronc, les embryons doivent être montés latéralement dans l'agarose (figure 4B).
   3. Une fois qu'il a complètement solidifié, couvrir l'agarose avec une couche d'eau d'oeuf (plus 1 x tricaine et PTU).
2. Microscopie confocale de laps de temps haute résolution tricolore
   REMARQUE : Les étapes suivantes sont actionnées sur une microscopie confocale équipée d'une lentille objective UV de 63,0x 1,40 huile.
   1. Fixer la température de la chambre de l'environnement à 28,5 oC. Placez un peu de papier de soie humide à l'intérieur de la chambre pour fournir de l'humidité et prévenir l'évaporation de l'eau des œufs (Figure supplémentaire 1).
   2. Placer le plat en verre de 35 mm avec le poisson zèbre dans la chambre environnementale.
   3. Ouvrez le logiciel confocal et initialisez la scène. Passez à l'objectif UV d'huile 63.0 x 1.40, et localisez le poisson zèbre à l'aide du canal de champ lumineux avec un filtre différentiel de contraste d'interférence (DIC).
   4. Ouvrez le laser 405 Diode, Argon (20% de puissance) et DPSS 561 nm. Configurez la puissance laser et les paramètres de spectre appropriés.
      REMARQUE : Voici les paramètres du spectre pour Cerulean (excitation 405 nm; émission 456 à 499 nm), eGFP (excitation 488 nm; émission de 500 à 550 nm), DsRed2 (excitation 561 nm ; émission 575 à 645 nm)(Figure supplémentaire 2B).
   5. Choisissez le mode d'acquisition "XYZ" "Sequential Scan" et fixez le format d'images à "512 x 512 pixels" (Figure 2A).
   6. Passez à "Live Data Mode". Ciblez la position du premier poisson zèbre et marquez la position «Begin» et «End» Z. Répétez ce processus pour chacun des embryons restants. Un "Pause" peut être ajouté à la fin du programme (Figure supplémentaire 2C).
   7. Définir la boucle et le cycle du programme.
   8. Enregistrer le fichier.

5. Irradiation UV à cellule unique pour induire l'apoptose et l'imagerie en direct

1. Poisson de montagne tel que décrit à l'étape 4.1.
2. Imagerie de la région du cerveau moyen de 3 jours après la fécondation (dpf) macrophage spécifique transgénique Tg (mfap4-eGFP) embryon¹⁵
3. Sélectionnez la région d'intérêt d'un seul macrophage étiqueté fluorescent et numérisez à une vitesse de 400 Hz et 6 % de puissance laser UV pour 50 s.
   REMARQUE : La vitesse et le temps de balayage doivent être optimisés en fonction du microscope individuel. Le temps de numérisation doit être optimisé pour causer les dommages importants d'ADN qui causeront plus tard l'apoptose de cellules cibles, mais pas photobleach la cellule entière.
4. Répétez l'étape ci-dessus pour irradier plus de cellules cibles.
5. Effectuer l'imagerie de laps de temps de la région de midbrain comme décrit dans la section 4.

6. Traitement d'image

1. Effectuer "Maximum Projection" pour les images acquises.
2. Trouvez et marquez la position et l'heure XY des cellules cibles sous la vue «Projection maximale».
3. Revenez à la vue standard pour trouver et marquer la position Z des cellules cibles.
4. Recadrez l'image d'une seule couche des cellules cibles.
5. Exporter le canal de la rebandement et le champ lumineux comme des vidéos en format AVI.
6. Recadrez la zone d'intérêt du canal de la reition et du champ lumineux dans ImageJ.
7. Combinez les deux vidéos dans la dernière étape verticalement et enregistrez-la sous la forme d'une vidéo format AVI dans ImageJ.

L'infection à mycobactère peut déclencher différentes réponses de l'hôte en fonction des voies d'infection. Dans ce protocole, les embryons de poissons zèbres sont infectés par une microinjection intramusculaire de bactéries étiquetées fluorescentes dans le cerveau ou le tronc(figure 3) et observés par imagerie vivante confocale. L'infection par ces deux voies limitera localement l'infection causant le recrutement inné de cellules immunitaires et la mort cellulaire suivante.

Visualiser les détails de la mort cellulaire immunitaire innée est difficile. La mort cellulaire lytique se produit sur une fenêtre de temps très courte et nécessite une microscopie à haute résolution pour observer. En outre, la forte motilité des cellules immunitaires innées leur permet de migrer hors de la zone d'observation. Dans ce protocole, nous résolvons ce problème en observant plusieurs embryons en parallèle. Une gamme d'embryons de poisson zèbre peut être monté sur une seule lame de microscope en verre pour l'infection, et jusqu'à 10 embryons peuvent être montés sur le même plat de 35 mm de fond en verre pour l'imagerie en direct (Figure 4). En profitant d'un modèle de données en direct de microscopie confocale, plus d'un embryon peut être observé simultanément. Cela améliore l'efficacité de l'imagerie en direct et augmente considérablement la probabilité de capturer l'ensemble du processus de mort des cellules lytiques.

Le système immunitaire inné est la première ligne de défense contre l'infection mycobactérienne, et deux composants clés sont le macrophage et le neutrophile. Ici, nous utilisons précédemment rapporté Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) et Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP) pour distinguer les macrophages et les neutrophiles in vivo16,17,18. Un macrophage fortement engorgé avec des bactéries est devenu rond et a montré la motilité réduite, avec le gonflement cytoplasmique éventuel, la rupture de la membrane cellulaire, et la diffusion rapide du contenu cytoplasmique. Ces événements sont des changements morphologiques typiques de la mort des cellules lytiques comme précédemment rapporté (Figure 5A)16. L'irradiation UV a été utilisée pour déclencher des cellules pour subir l'apoptose chez le poisson zèbre20,21. Conformément à cette notion, les macrophages irradiés UV ont montré les phénotypes apoptotiques typiques de cellules, tels que le rétrécissement de cellules, la fragmentation nucléaire, et la condensation de chromatine (figure 5B)22,23. Combiné avec l'utilisation de Cerulean-fluorescent M. marinum19, l'imagerie en direct de trois couleurs de l'interaction entre le macrophage, le neutrophile, et M. marinum a été réalisé in vivo. Nous avons également observé que les macrophages peuvent activement phagocytose et disséminer M. marinum (Figure supplémentaire 3A). Cependant, les neutrophiles avaient une capacité phagocytique limitée et ont rapidement subi la mort de cellules lytiques sans engorgement bactérien évident (figure supplémentaire 3B). Les neutrophiles pourraient être déclenchés par la phagocytose de seulement quelques M. marinum morts qui n'expriment pas la fluorescence cérulenne, ou simplement par la phagocytose des débris de cellules mortes limitées.

Figure 1 : Diagramme schématique de la préparation des bactéries à cellule unique. Des stocks de M. marinum monocellulaires ont été générés après le processus décrit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Diagramme de montage d'embryons de poisson zèbre pour microinjection. (A) Diagramme schématique du processus de montage. (B) Des embryons de poisson zèbre ont été montés latéralement pour l'infection de la région du tronc. (C) Des embryons de poissons zèbres ont été montés avec leurs têtes dirigées vers le haut pour l'infection du cerveau moyen. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Positionnement pour microinjection. (A) La flèche rouge indique le site d'injection pour l'infection de la région du tronc. (B) La flèche rouge indique le site d'injection pour l'infection de midbrain. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Montage d'embryons de poissons zèbres pour l'imagerie en direct. (A) Pour l'infection du cerveau moyen, les embryons de poissons zèbres ont été montés avec leurs têtes dirigées vers le bas. (B) Pour l'infection de la région du tronc, des embryons de poissons zèbres ont été montés latéralement avec le site d'injection près du fond du plat en verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Changements morphologiques typiques dans l'infection de M. marinum a induit la mort de cellules lytiques de macrophage et l'apoptosis induit par UV de macrophage. (A) Imagerie par laps de temps d'un macrophage (Mac) subissant la mort des cellules lytiques une fois qu'il est fortement engorgé de M. marinum. Le cerveau moyen de l'embryon de poisson zèbre Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) est infecté par le M. marinum (500 cfu) par microinjection. Des images pour le canal de la reule (panneau supérieur) et le canal DIC (panneau inférieur) sont fournies. T 00:00 est 5 h 20 min post infection. Lignes pointillées blanches et contour de la membrane cellulaire; lignes pointillées noires et cytoplasme enflé; flèches noires et membrane cellulaire rompue; lignes pointillées rouges - rapidement perdu le contenu cytoplasmique. (B) Imagerie par laps de temps du macrophage irradié UV. Une cellule de GFP MFP dans la région du cerveau moyen de 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) est irradiée par UV et suivie d'une imagerie par laps de temps. Lignes pointillées blanches et contour de la membrane cellulaire; flèches noires - fragmentation nucléaire et condensation de chromatine. Barre d'échelle de 15 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Chambre environnementale mise en place pour l'imagerie en direct. (A) Définir le contrôleur numérique pour maintenir la température à 28,5 oC. (B) Mettre des lingettes humides à l'intérieur de la chambre pour fournir de l'humidité et prévenir l'évaporation de l'eau des œufs. (C) Fermer le couvercle de la chambre et attendre au moins 30 min pour la stabilisation de la température avant de commencer l'imagerie en direct. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Réglage de panneau confocal pour l'imagerie en direct. (A) Représentation du réglage du panneau d'acquisition. (B) Représentation de la puissance laser et des paramètres du spectre. (C) Représentation de plusieurs tâches et réglage de boucle en mode données en direct. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 3 : Les macrophages disséminuent l'infection et les neutrophiles subissent la mort de cellules lytiques après l'infection de M. marinum. (A) Macrophage disséminant M. marinum dans le tronc d'un 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) embryon de poisson zèbre infecté par Cerulean-fluorescent M. marinum (100 cfu). (B) Neutrophil (Neu) subissant la mort de cellules lytiques sans M. marinum évident chargé dans la région de tronc de 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) embryon de poisson zèbre infecté par Cerulean-fluorescent M. marinum (100 cfu) par microinjection. La couleur verte est assignée à LRLG et la couleur rouge est assignée à eGFP pour une meilleure visualisation du processus de mort de cellules lytiques. Les flèches dans le cyan indiquent les cellules cibles. Flèches en rouge point entacher les cellules qui sont sur le point de libérer le contenu cytoplasme dans le cadre suivant. Flèches en vert point aux cellules mortes qui viennent de perdre leur contenu cytoplasme. Barre d'échelle de 25 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo 1 : Un macrophage lourdement chargé de M. marinum subit la mort des cellules lytiques, liée à la figure 5A. Imagerie time-lapse (objectif 63x) pour 9 min et 18 s à 3 images par seconde (fps) de la région midbrain d'un Tg 3 dpf (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) embryon de poisson zèbre infecté par Cerulean-fluorescent M. marinum. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Vidéo 2 : Un macrophage subit une apoptose après irradiation UV, liée à la figure 5B. Imagerie en accéléré (objectif 63x) de 74 min à 6 fps de la région midbrain d'un embryon de poisson zèbre Tg(mfap4:eGFP) de 3 dpf. Une cellule de GFP MD dans la région du cerveau moyen des embryons est irradiée par les UV et suivie d'une imagerie par laps us. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Vidéo 3 : Un macrophage diffuse M. marinum, lié à lafigure supplémentaire 3A. Imagerie time-lapse (objectif 63x) de 24 min à 3 fps de la région du tronc de 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) embryon de poisson zèbre infecté par Cerulean-fluorescent M. marinum. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Vidéo 4 : Un neutrophile subit la mort de cellules lytiques sans engorgement évident de M. marinum, lié à la figure 3B supplémentaire. Imagerie time-lapse (objectif 63x) de 7 min 30 s à 3 fps de la région du tronc de 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) embryon de poisson zèbre infecté par Cerulean-fluorescent M. marinum. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Les auteurs n'ont rien à révéler.