Method Article

KRAS4b recombinant entièrement transformé : Isoler et caractériser les protéines farnestées et méthylées

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prénylation est une modification importante sur les protéines de liaison de membrane périphérique. Les cellules d'insectes peuvent être manipulées pour produire des KRAS4b farnédées et carboxyméthylées en quantités qui permettent des mesures biophysiques des interactions protéines-protéines et protéines-lipides

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prénylation des protéines est une modification clé qui est responsable du ciblage des protéines vers les membranes intracellulaires. KRAS4b, qui est muté dans 22% des cancers humains, est traité par farnesylation et carboxymethylation en raison de la présence d'un motif de boîte 'CAAX' au terminus C. Un système de baculovirus machiné a été employé pour exprimer kraS4b farnésylated et carboxymethylated dans des cellules d'insecte et a été décrit précédemment. Ici, nous décrivons la purification détaillée et pratique et la caractérisation biochimique de la protéine. Plus précisément, l'affinité et la chromatographie d'échange d'ions ont été utilisées pour purifier la protéine à l'homogénéité. La spectrométrie de masse intacte et indigène a été utilisée pour valider la modification correcte de KRAS4b et pour vérifier la liaison nucléotide. Enfin, l'association de membrane de KRAS4b farnesylated et carboxymethylated aux liposomes a été mesurée utilisant la spectroscopie de résonance de plasmon de surface.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les modifications post-traductionnelle jouent un rôle clé dans la définition de l'activité fonctionnelle des protéines. Les modifications telles que la phosphorylation et la glycosylation sont bien établies. Les modifications lipidiques sont moins bien caractérisées, cependant. On estime que jusqu'à 0,5 % de toutes les protéines cellulaires peuvent être prénylées1. La prénylation est le transfert d'un farnesyl de 15 carbone ou d'une chaîne lipidique geranylgeranyl de 20 carbone à une protéine accepteur contenant le motif CAAX2. Les protéines prénylées ont été impliquées dans la progression de plusieurs maladies humaines,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Purification des protéines

  1. Préparer les tampons A-H, comme on le voit dans le tableau 1.
Solution tamponAgent tampon (tous les 20 mM) pH NaCl (mM)imidazole (mM)MgCl2 TCEP
UnHepes7.3300-5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'une des variables les plus importantes du protocole est la quantité de protéines cibles exprimées (His6-MBP-tev-KRAS4b). Ce protocole a été développé à l'aide d'un isolat d'une lignée de cellules Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adapté pour la croissance de la suspension et scié à partir de sérum. Étant donné la vaste gamme de résultats rapportés à travers les différentes lignées de cellules d'insectes avec le système d'expression du baculovirus, il est conseillé que Tni-FNL soit utilisé, au.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comme indiqué dans la section Résultats représentatifs, l'étape la plus critique pendant la purification est la manipulation de l'échantillon pendant le temps qu'il est dans le sel inférieur. Limiter le temps d'exposition de l'échantillon à moins de 200 mM NaCl contribuera à réduire les précipitations et à augmenter le rendement de l'échantillon. L'interprétation des résultats du CEX peut être difficile si le profil ne correspond pas aux attentes (voir la figure 2). Jusqu'à ce que le protoco.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous reconnaissons le soutien au clonage et à l'expression de Carissa Grose, Jen Melhalko et Matt Drew du Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Ce projet a été financé en totalité ou en partie par des fonds fédéraux de l'Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention des noms commerciaux, des produits commerciaux ou des organisations n'implique pas nécessairement l'approbation par le gouvernement des États....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubes Safe-Lock de 1,8 ml, naturelEppendorf22363204
11 mm Cl SS Flacons d’échantillonneur automatique ThermoScientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC)AVANTI POLAR LIPIDSacheter sous forme de stocks liquides sous forme de chloroforme
1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phospho-sérine (POPS)AVANTI POLAR LIPIDS840034acheter sous forme de stocks liquides dans le chloroforme
5427R CentrifugeuseEppendorf
Acétonitrile, HPLC GradeFisher ChemicalA998-1 1L
Acétate d’ammoniumSigma-Aldrich09689-250g
Gazargon AirgasARUP
Plaque de dosage 384CORNING3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Bain à ultrasonsThermo Fisher15-336-1000
Colonne de chromatographie échangeuse de cations (CEX)GE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP Sepharose Haute Performance
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Lecteur de plaquesWyatt Technologies
Exactive Plus Spectromètre de masse EMRThermo Scientific
Acide formiqueSigma-AldrichF0507-500MlUtiliser un réactif de qualité supérieure
Flacons Gilson Tubes 7x14 mm TubesGE HealthcareBR-1002-12
Flacons à filetage en verre avec doubluresen mousse PTFESpécialités scientifiquesB69302
Centrifugeuse à grande vitesse/de paillasseThermo Fischer Scientific05-112-114Dcapable de produire jusqu’à 4 000 xg
protéase du virus de gravure du tabac (TEV)Addgene92414Purifié selon Raran-Kurussi et al. (2017) Élimination des marqueurs d’affinité avec la protéase TEV. Dans : Burgess-Brown N. (eds) Expression génique hétérologue chez E. coli. Méthodes en biologie moléculaire, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Colonne Chromatographie par affinité métallique immobilisée (IMAC)GE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Approvisionnement en eau interne, Arium AdvanceSartorius StedimRésistivité de 18 M&Omega ;
d’extrudeuse de lipides 0 cm avec supportAVANTI POLAR LIPIDS
Azote liquideAirgasMicrofluidiseur NI-DEWAR
M110-EHMicrofluidics
MabPac RP Colonne UHPLC, 4 um, 3,0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Colonne, 5 um, 300 & Aring ;, 2,1 x 150 mmThermo Scientific088790
Logiciel MagTranThermo Scientific
Méthanol, HPLCGrade VWR ChemicalsBDH20864.400
Système de chromatographie NGCBioRad78880002NGC QuestTM 100 Système de chromatographie
Inhibiteur de protéase Cocktail sans EDTA ou autres chélateursMillipore SigmaP8849
Capuchons en caoutchouc type 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Sensor Chip L129104993GE Healthcare
ThermoFischer Scientific13-400-519Absorbace à 280 nm
Unités de filtre centrifuge Ultra-15, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008membrane PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtres à centrifugerAmiconUFC501024
UltracentrifugeuseBeckman CoulterOptima - L80Kcapable de 100 000 xg
Vanquish UHPLC (pompe, colonne de refoulement et système LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Eau, qualité HPLCSigma-Aldrich270733-1LPeut utiliser une source d’eau interne (voir ci-dessous)
Seringue Whatman GD/XP PES 0,45 mm filtreGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserLogiciel de protéomique ThermoScientific
850457 de Kit 610023 Spectrophotomètre

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles