Method Article

KRAS4b recombinant entièrement transformé : Isoler et caractériser les protéines farnestées et méthylées

DOI:

10.3791/60703

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January 16th, 2020

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1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prénylation est une modification importante sur les protéines de liaison de membrane périphérique. Les cellules d'insectes peuvent être manipulées pour produire des KRAS4b farnédées et carboxyméthylées en quantités qui permettent des mesures biophysiques des interactions protéines-protéines et protéines-lipides

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prénylation des protéines est une modification clé qui est responsable du ciblage des protéines vers les membranes intracellulaires. KRAS4b, qui est muté dans 22% des cancers humains, est traité par farnesylation et carboxymethylation en raison de la présence d'un motif de boîte 'CAAX' au terminus C. Un système de baculovirus machiné a été employé pour exprimer kraS4b farnésylated et carboxymethylated dans des cellules d'insecte et a été décrit précédemment. Ici, nous décrivons la purification détaillée et pratique et la caractérisation biochimique de la protéine. Plus précisément, l'affinité et la chromatographie d'échange d'ions ont été utilisées pour purifier la protéine à l'homogénéité. La spectrométrie de masse intacte et indigène a été utilisée pour valider la modification correcte de KRAS4b et pour vérifier la liaison nucléotide. Enfin, l'association de membrane de KRAS4b farnesylated et carboxymethylated aux liposomes a été mesurée utilisant la spectroscopie de résonance de plasmon de surface.

Introduction

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Les modifications post-traductionnelle jouent un rôle clé dans la définition de l'activité fonctionnelle des protéines. Les modifications telles que la phosphorylation et la glycosylation sont bien établies. Les modifications lipidiques sont moins bien caractérisées, cependant. On estime que jusqu'à 0,5 % de toutes les protéines cellulaires peuvent être prénylées1. La prénylation est le transfert d'un farnesyl de 15 carbone ou d'une chaîne lipidique geranylgeranyl de 20 carbone à une protéine accepteur contenant le motif CAAX2. Les protéines prénylées ont été impliquées dans la progression de plusieurs maladies humaines, y compris le vieillissement prématuré3, Alzheimer4, dysfonction cardiaque5, chorroideremia6, et le cancer7. Les petits GTPases, HRAS, NRAS et KRAS1, les laminins nucléaires, et les kinétochores CENP-E et F sont des protéines farnédylated sous l'état basal. D'autres petits GTPases, à savoir RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, et RRAS sont geranylgeranylated8, tandis que RhoB peut être farnétatif ou geranylgeranylated9.

Le petit GTPase KRAS4b fonctionne comme un interrupteur moléculaire, transmettant essentiellement le facteur de croissance extracellulaire signalant aux voies intracellulaires de transduction de signal qui stimulent la croissance et la prolifération de cellules, par l'intermédiaire des interactions multiples de protéine-protéine. Il y a deux aspects clés de la biochimie KRAS4b qui sont essentiels à son activité. Tout d'abord, les cycles protéiques entre un PIB inactif et un état lié gtP actif par lequel il s'engage activement avec les effecteurs. Deuxièmement, une région de polylysine C-terminal et une cystéine farnédilate et carboxymethylated dirigent la protéine à la membrane de plasma, permettant le recrutement et l'activation des effecteurs en aval. Mutant KRAS4b est un conducteur oncogène dans le cancer du pancréas, colorectal et du poumon10, et en tant que tel, l'intervention thérapeutique aurait un énorme avantage clinique. La production de protéines recombinantes authentiquement modifiées qui sont farnésylated et carboxymethylated permettrait le criblage biochimique utilisant KRAS4b en combination avec des substituts de membrane tels que des liposomes ou des nanodisques lipidiques11,12.

Farnesyl transferase (FNT) catalyse l'ajout de pyrophosphate de farnesyl à la cystéine C-terminale dans le motif CAAX dans KRAS4b. Après la prénylation, la protéine est trafiquée vers le réticulum endoplasmique (ER) où l'enzyme de conversion Ras (RCE1) fend les trois résidus c-terminaux. La dernière étape dans le traitement est la méthylation du nouveau résidu de farnesylcystéine C-terminal par la protéine de membrane d'ER, isoprenylcysteine carboxyl méthyltransferase (ICMT). L'expression du KRAS4b recombinant dans E. coli entraîne la production d'une protéine non modifiée. Les tentatives précédentes de produire du KRAS4b transformé ont été limitées en raison de rendements insuffisants pour des expériences structurelles ou de dépistage de médicaments ou n'ont pas réussi à récapituler la protéine mature pleine longueur indigène13,14. Le protocole présenté ici utilise un système d'expression et de purification d'insectes à base de baculovirus qui génère un KRAS4b hautement purifié et entièrement traité à des rendements de 5 mg/L de culture cellulaire.

Une caractérisation prudente des protéines est essentielle pour valider la qualité des protéines recombinantes avant de se lancer dans des études de biologie structurelle ou de dépistage des médicaments. Deux paramètres clés du KRAS4b entièrement traité sont la validation de la modification correcte de prenyl et la disponibilité du C-terminus (FMe) farnesylated et carboxymethylated pour l'interaction avec des substituts de membrane ou des lipides. La spectrométrie de masse d'ionisation d'électrospray (ESI-MS) du KRAS4b-FMe a été employée pour mesurer le poids moléculaire et confirmer la présence des modifications de farnesyl et de carboxymethyl. La spectrométrie de masse indigène, où les échantillons sont pulvérisés avec des solvants non dénaturants, a été utilisée pour démontrer que KRAS4b-FMe était également lié à son cofactor de PIB. Enfin, la spectroscopie de résonance de plasmon de surface a été employée pour mesurer la liaison directe de KRAS4b-FMe avec des liposomes immobilisés.

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Protocol

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1. Purification des protéines

  1. Préparer les tampons A-H, comme on le voit dans le tableau 1.
Solution tamponAgent tampon (tous les 20 mM) pH NaCl (mM)imidazole (mM)MgCl2 TCEP
UnHepes7.3300-51
BHepes7.33003551
CHepes7.330050051
DMES (EN)6.0200-51
EMES (EN)6.0--51
FMES (EN)6.0100-51
GMES (EN)6.01000-51
H (en)Hepes7.3300-11
  1. Préparer les matériaux de purification (voir Tableau des matériaux):cocktail inhibiteur de la protéase sans EDTA ou autres chélateurs; colonne de chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) ; colonne de chromatographie d'échange de cation (CEX) ; filtre à seringues de 0,45 m; 2 M d'imidazole (pH 7,5); ultracentrifuge capable de 100 000 x g; centrifugeuse à montables à grande vitesse capable de 4 000 x g; unités de filtre centrifuge (10 KDa NMWL); spectrophotomètre capable de lire à 280 nm; His6-tobacco etch virus (TEV) protéase; et instrumentation de chromatographie capable de mélanger deux solutions tampons, d'appliquer des solutions aux colonnes, de créer des élutions de gradient à partir de colonnes et de collecter des fractions à partir de colonnes.
  2. Décongeler les cellules à partir de 2 L de culture de cellules d'insectes précédemment stockées à -80 oC ou utiliser des cellules fraîchement récoltées. Voir Gillette et coll. 201915 pour plus de détails sur la lignée et les protocoles d'expression des insectes Tni.FNL. Resuspendre soigneusement les cellules avec 200 ml de tampon A avec un inhibiteur de protéase ajouté de 1:200 v/v sans introduire d'air ou créer de la mousse.
    REMARQUE : L'étape 1.3 et les étapes suivantes (sauf indiqué) doivent être effectuées à température ambiante (22 oC). Il est important que l'échantillon soit homogène pour permettre une lyse complète à l'étape suivante.
  3. Lyse pastilles cellulaires dans un microfluidifiant à 7 000 psi pour deux passes ou dans un système de lyse équivalent. D'autres méthodes de lyse n'ont pas été explorées.
  4. La clarification des lysates des cellules d'insectes est problématique en raison de la présence de composés qui obstruent les filtres. Ainsi, l'ultracentrifugation (100 000 x g pendant 30 min à 4 oC) est très importante. Un résidu de lipide blanc à la surface du supernatant doit être évité et peut être enlevé ou réduit à l'aide d'écouvillons de coton. Filtrer le supernatant décanté dans un filtre PES de 0,45 m. Utilisez immédiatement l'échantillon clarifié ou entreposez-le à -80 oC.
    REMARQUE : Les blocs de résidus filtrent rapidement et de nombreux filtres peuvent être nécessaires. Le défaut de réduire la quantité de ce matériau entraînera une pression arrière haute dans les étapes suivantes.
  5. Déterminez le volume du lysate clarifié et ajustez l'échantillon à 35 mM d'imidazole par l'ajout de 2 M de stock d'imidazole. Chargez l'échantillon à 3 ml/min sur une colonne IMAC de 20 mL (colonne HisPrep FF 16/10) pré-équilibrée en tampon B pour trois volumes de colonnes (CV).
  6. Bien que la protéine cible soit généralement adsorbée quantitativement à la colonne, il est préférable de recueillir le flux de colonne pour l'analyse ultérieure. Laver la colonne jusqu'à ce que l'Abs280 atteigne une ligne de base stable (100 unités de milliabsorbance [mAU]) avec le tampon B à 3 ml/min pour 20 ml (1 CV), puis pour 3 CV à 4 ml/min pour le reste de l'étape de lavage. En règle générale, 60 à 80 ml de tampon B sont nécessaires pour atteindre l'absorption de base.
  7. Élirez la protéine avec un gradient de 400 ml (20 CV) du tampon B au tampon C tout en recueillant 8 ml de fractions. Typiquement, la protéine cible élute dans la première moitié du gradient(figure 1A; toutes les fractions ultérieures ne sont pas montrées).
  8. Analyser les fractions de protéines à l'aide de la coloration SDS-PAGE/Coomassie. Poule fractions de pointe et dialyser la piscine pendant la nuit contre 2 L de Tampon D à 4 oC.
    REMARQUE : Un faible pH est essentiel pour assurer la liaison des protéines à l'étape suivante. Cependant, le changement de pH pendant cette dialyse se produit lentement, et c'est une étape commode pour l'incubation de nuit. D'autres stratégies d'échange de tampons (p. ex., une concentration plus élevée de tampons pour accélérer le changement de pH) n'ont pas été étudiées. La protéine commencera à se précipiter lentement au fil du temps à un pH plus faible et à des concentrations de sel plus faibles et une petite quantité de précipitations est normale au cours de cette étape. Pour cette raison, nous évitons d'échanger le tampon à la 100 mM NaCl nécessaire pour se lier à la colonne suivante pendant la dialyse. Au contraire, une concentration de NaCl de 200 mM est utilisée pour la dialyse et la protéine est diluée à 100 mM (voir ci-dessous) immédiatement avant l'application à la colonne. Nous n'avons pas étudié si ces précipitations sont spécifiques à KRAS4b, mais la protéine qui ne précipite a été confirmée comme KRAS4b-FMe. Pour cette raison, nous suggérons d'utiliser la concentration plus élevée de NaCl dans le tampon de dialyse pour toute protéine d'intérêt par mesure de précaution jusqu'à ce que la stabilité de la protéine cible dans le tampon de liaison puisse être déterminée.
  9. Retirer l'échantillon de la dialyse et de la centrifugeuse à 4 000 x g pendant 10 min pour enlever tout précipité. L'échantillon final dialysé et clarifié à ce stade est encore souvent flou, mais peut être appliqué sans traitement supplémentaire sur la colonne CEX ultérieure.
  10. Préparer une colonne d'échange de cation de 20 ml (voir Tableau des matériaux) en lavant avec trois CV de Buffer G, puis avec trois CV de Buffer F.
    REMARQUE: Bien que nous n'ayons pas méticuleusement évalué d'autres résines, plusieurs collègues ont trouvé une mauvaise résolution avec des résines autres que la résine SP Sepharose Haute Performance.
  11. Diluer 20 ml de l'échantillon dialysé à une concentration finale de NaCl de 100 mm en ajoutant 20 ml de tampon E et appliquer l'échantillon dilué à la colonne d'échange de cation.
  12. Continuer à charger la colonne en ajoutant des échantillons fraîchement dilués préparés comme décrit ci-dessus sur le tube de charge que la dilution précédente est proche de la fin de la charge.
    REMARQUE : La dilution de l'échantillon entier à la fois à 100 mM De NaCl a entraîné une perte importante de protéines cibles en raison des précipitations.
  13. Laver la colonne à la ligne de base Abs280 avec Buffer F. Cela nécessite généralement 3 CV. La protéine est élue de la colonne au cours d'un gradient de 400 ml (20 CV) de Buffer F à 65% Buffer G, recueilli en fractions de 6 ml (Figure 1B).
  14. Continuez à laver la colonne pour un CV supplémentaire de 1,5 CV (65 % de tampon G) une fois le gradient terminé. Choisissez des fractions positives basées sur l'analyse des taches bleues SDS-PAGE/Coomassie et l'inspection de la trace UV du chromatogramme.
    REMARQUE : La trace UV contient généralement cinq pics. Commençant par des concentrations de sel plus faibles, le pic initial est habituellement une protéine non transformée et/ou protéolysée. Les deuxième et troisième pics sont un mélange de deux formes de protéines transformées : le deuxième pic est principalement un intermédiaire farnédilatif (FARN), tandis que le troisième est principalement la protéine Entièrement traitée FMe d'intérêt. Les pics quatre et cinq représentent les protéines de fusion His6-MBP-KRAS4b (toutes les protéines sont dans ce format à ce stade, car aucune digestion DeEV n'a eu lieu). Ceux-ci ne sont pas N-acetylated au N-terminus et sont farnesylated (pic quatre) et farnesylated et carboxymethylated (pic cinq) au C-terminus. Comme le pic deux et le pic quatre produiront des protéines identiques après l'élimination des étiquettes (c.-à-d. KRAS4b-FARN), celles-ci peuvent être mises en commun à ce stade si désiré. De même, le pic trois et le pic cinq peuvent être combinés pour produire un seul lot de KRAS4b-FMe (Figure 1B, Figure 2). Cependant, il est conseillé que cette mise en commun ne se fasse que lorsque la nature de la protéine dans les pics séparés a été confirmée.
  15. Digdez la protéine mise en commun à l'étape 1,15 avec la protéase His6-TEV (200 g de protéase/mL d'échantillon.
    REMARQUE: Nous faisons sa protéase His6-TEV en utilisant le plasmide et les protocoles disponibles à partir d'Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialyser le digest TEV contre le tampon A (10 kDa MWCO dialyse avec un minimum de 40 ml de tampon A par ml d'échantillon) pendant 2 h à température ambiante, puis pendant la nuit à 4 oC.
  16. Après la digestion et la dialyse, chargez la protéine directement sur une colonne IMAC de 20 mL libé avec le tampon A à 3 ml/min.
    REMARQUE: Recueillir 7 mL fractions au cours de cette chromatographie entière, parce que la protéine cible a une faible affinité pour la colonne, mais pourrait ne pas être entièrement lié à la résine. Laver la colonne à 3 ml/min avec le tampon A pour un total de 3 CV ou jusqu'à ce qu'une absorption de base soit atteinte.
  17. La protéine cible est élugée avec un gradient de 5 CV de Buffer C de 0%-10%, recueillant 7 ml de fractions. Par mesure de précaution, des protéines liées supplémentaires peuvent être élucées avec 100 % de tampon C. Des fractions positives sont identifiées après analyse par SDS-PAGE (Figure 1C). Typiquement, la protéine cible élude à une faible concentration d'imidazole (c.-à-d., dans le gradient de 0% -10% De tampon C), mais parfois des élutes dans le flux à travers ou le lavage de colonne.
  18. Dialysez la piscine finale contre le tampon H. Déterminer la concentration en protéines par spectrophotométrie à 280 nm.
    REMARQUE : Assurez-vous de tenir compte de la présence du nucléotide lors de la détermination du coefficient d'extinction à utiliser pour ce calcul.
  19. La protéine peut être concentrée à 2 à 5 mg/ml à l'aide d'une unité de filtre centrifuge (10 K NMWL) sans perte significative de protéines. Filtrer à l'utilisation d'un filtre à seringues de 0,22 M. Mesurer l'absorption de la solution à A280 pour calculer la concentration finale de protéines (figure 1D). Congeler les aliquots dans de l'azote liquide et stocker les échantillons congelés à -80 oC.
    REMARQUE : La protéine purifiée est liée au PIB. KRAS4b-FMe peut être échangé dans GppNHp en utilisant des protocoles précédemment publiés16.

2. Préparation d'échantillon pour l'analyse de masse intacte et l'analyse de masse indigène

  1. Préparation d'échantillons pour l'analyse de masse intacte
    1. Décongeler l'échantillon de protéines sur la glace avant l'analyse. Pour une analyse de masse intacte, diluer la protéine à 0,1 mg/ml en 20 mM de bicarbonate d'ammonium (pH à 8,4). Pour l'analyse de masse indigène, diluer la protéine à une concentration de 0,1 mg/mL dans 50 mM d'acétate d'ammonium (pH à 7,5). Vortex chaque échantillon pour 5-10 s, puis centrifugeuse à 12.500 x g pendant 1 min pour granuler tout matériau solide dans la solution. Retirez 10 à 20 L de chaque supernatant et transférez-le dans un flacon d'ausampler en verre. Capuchonde zona votre flacon hermétiquement pour éviter la contamination ou l'évaporation.
      REMARQUE : Pour l'analyse de masse intacte ou l'analyse de masse indigène, l'échantillon peut être dessalé avant l'analyse à l'aide d'un filtre à membrane de cellulose MWCO de 10 kDa pour tamponner l'échange dans le tampon de dilution final.
  2. Préparation de la spectroscopie de masse étendue (EMR) pour l'analyse de masse
    REMARQUE : Avant d'effectuer une analyse sur le spectromètre de masse, assurez-vous qu'il a été récemment étalonné. De plus, portez toujours des gants et d'autres équipements de protection individuelle au besoin pour éviter tout produit chimique nocif et pour éviter de contaminer des échantillons et des solvants. Calibration se fait à l'aide d'une solution d'étalonnage obtenue commercialement et d'une solution d'iodure de césium de 2 mg/mL préparée en interne.
    1. Ouvrez le logiciel d'analyse et chargez le fichier de méthode d'instrument approprié. Pour l'analyse de masse intacte des protéines KRAS4b, les paramètres de départ appropriés sont les suivants : mode de détection positif ; trois microscans, résolution 70 000; Objectif AGC 3e6; temps d'intégration maximum de 200 ms; et une plage d'analyse de 70 à 1 800 ratio masse/charge (m/z). Pour l'analyse de masse indigène des protéines KRAS4b, les paramètres de départ appropriés sont les suivants : mode de détection positif ; 10 microscans, résolution 17 500; dissociation induite par les collisions à l'interne (CID) à 20 eV; Objectif AGC 3e6; l'énergie de collision (CE) 20; temps d'intégration maximum de 200 ms; et une plage d'analyse de 500 à 10 000 m/z.
  3. Préparation de solvants chromatographiques et colonne
    1. Préparer les solvants nécessaires à l'analyse de masse intacte. Le solvant A est de l'eau avec 0,1% d'acide formique. Le solvant B est à 80 % d'acétonitrile et à 0,1 % d'acide formique dans l'eau.
    2. Préparer les solvants nécessaires à l'analyse de masse indigène. Le solvant A est de 0,1 M d'acétate d'ammonium dans l'eau et le solvant B est de l'eau.
    3. Une fois les solvants appropriés préparés, purger le système de façon à ce que le tube soit rempli des solvants appropriés et que toutes les bulles d'air soient retirées des lignes.
    4. Installer la colonne appropriée (une colonne de phase inversée pour l'analyse de masse intacte et une colonne d'exclusion de taille pour l'analyse de masse native). Pour l'analyse de masse intacte, le débit est de 0,5 ml/min, et la température de la colonne (à l'aide d'un chauffe-colonne) est de 50 oC. Équilibrez la colonne pendant 15 à 20 min. Pour l'analyse de masse native, le débit est de 0,25 ml/min.
      REMARQUE : Surveillez toujours la pression arrière de la colonne pour vous assurer qu'elle ne dépasse pas la limite supérieure, ce qui pourrait indiquer une ligne obstruée ou que la matrice de colonne est compromise. Remplacez la colonne si nécessaire.
  4. Analyse de l'échantillon
    1. Placez l'échantillon de protéines préparé dans le flacon d'ausampler en verre dans le support de flacon approprié dans l'autosampler des systèmes LC. Créez une liste d'échantillons dans le logiciel avec la méthode d'instrument appropriée pour l'analyse souhaitée. Une fois la liste d'échantillons terminée, cliquez sur le bouton Lecture pour démarrer l'analyse.
    2. Injecter un échantillon de 1 à 2 l par analyse, avec un blanc d'eau avant et après chaque échantillon, pour s'assurer qu'il n'y a pas de report.
      REMARQUE : L'analyse de masse intacte est très différente de l'analyse de masse native et nécessite des paramètres de méthode d'instrument très différents. C'est parce qu'avec l'analyse de masse intacte, la protéine est "relaxée" en présence d'un solvant organique, et est donc capable d'accepter plus de charges. Il est plus facile de décongestionner et de résoudre la distribution isotopique des états de charge. L'analyse de masse indigène fournit une distribution étroite de charge des ions de protéine, et basé sur la protéine, exige différents arrangements d'énergie de tension et de collision.
  5. Analyse des données et déconvolution de protéines
    1. Exporter le spectre de l'échantillon vers un logiciel où il peut être transformé en spectre dé-compliqué qui affichera la masse intacte (ou masse indigène) de la protéine. La masse intacte aura une distribution de pointe isotopique en raison de la forte abondance de pics spectraux chargés. La masse indigène aura généralement très peu de pics en raison de la faible abondance des pics spectraux chargés (Figure 3D).
    2. Élargir la plage de masse-charge (m/z) du pic d pour confirmer que la masse mesurée est compatible avec la masse prévue. De temps en temps, en raison de l'ajout de charges à la protéine, il peut y avoir une légère variation entre le poids moléculaire prévu (MW) et le MW observé. De plus, comme c'est le cas pour de nombreuses analyses de spectrométrie de masse, les adducteurs comme le sodium peuvent contribuer à l'apparition de pics supplémentaires dans les données, même avec des échantillons soigneusement dessalées. On observe parfois des pics abondants plus bas avec un m/z plus bas que prévu. Cela est probablement dû à une perte neutre, qui est la perte d'un groupe fonctionnel en raison du processus d'ionisation.
      REMARQUE : Comme prévu, il y aura des différences entre la masse intacte et les pics de masse indigènes. L'affichage de masse intact montrera le MW prévu de la protéine. Il n'aura pas le MW supplémentaire du nucléotide attaché ou d'autres modifications. Cependant, le pic de masse indigène montrera la protéine avec n'importe quel nucléotide ajouté.

3. Validation de la liaison KRAS4b-FMe aux liposomes

  1. Préparation des liposomes de membrane
    1. Préparer un tampon composé de 20 mM HEPES (pH 7,3), 150 mM NaCl et 1 mM de TCEP.
    2. Les matériaux de préparation de Liposome incluent 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) et 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) stocks dans le chloroforme; un extrudeur lipidique réglé avec un support et un bloc chauffant; gaz argon et azote liquide; un bain à ultrasons; flacons de fil de vis en verre avec revêtements en mousse PTFE; et un lecteur de plaques capable de la détection dynamique de diffusion de la lumière.
    3. Décongeler les stocks lipidiques en chloroforme à température ambiante pendant 30 min. Préparer 1 ml de 5 mM 70 m30 POPC : popS liposomes en inscrivant 106 OL de 25 mL de POPC (stock) et 118 oL de 10 mL de POPS (stock) dans un flacon de verre.
      REMARQUE: Ne pas aliquot lipides avec une pointe en plastique, parce que le chloroforme pourrait dissoudre certains bouts en plastique.
    4. Graisses sèches sous un flux régulier de gaz argon. Faites pivoter lentement le flacon de verre lors de l'application du gaz argon pour former une fine couche de film sec.
    5. Mettre les échantillons sous un lyophiliseur sous vide pendant la nuit pour enlever l'excès de chloroforme.
    6. Reconstituer les lipides en ajoutant 1 ml de tampon au film séché et vortexles les mélanges pendant 5 min. Hydratez les mélanges lipidiques en se balançant pendant 1 h à 25 oC.
      REMARQUE: L'échantillon sera très turbide lors de l'ajout du tampon à la couche de film séché de lipides.
    7. Effectuez cinq cycles de gel/dégel en alternant en plaçant le flacon de l'échantillon entre une eau glacée (4 oC ou moins) et un bain d'eau chaude (25 oC ou plus).
    8. Placez le flacon d'échantillon dans le bain à ultrasons et sonicate l'échantillon pendant environ 0,5 h ou jusqu'à ce que l'échantillon devienne semi-transparent.
    9. Extruder les échantillons à l'aide de l'ensemble d'extrudeur lipidique. Assembler le kit d'extrusion comme indiqué dans les instructions du fabricant. Extrudez les échantillons à l'aide de papier filtre de 0,1 m. Chargez les échantillons dans une seringue en verre et attachez-les à une extrémité de l'appareil d'extrusion. Ajouter une seringue vide à l'autre extrémité de l'appareil d'extrusion. Poussez d'avant en arrière 10 à 20x jusqu'à ce que vos échantillons deviennent entièrement transparents.
    10. Faire tourner les échantillons finaux pendant 30 min à 20 000 x g pour enlever les gros agrégats.
    11. Utiliser la diffusion dynamique de la lumière (DLS) pour déterminer la taille et l'homogénéité des liposomes (facultatif). Placez 30 liposomes dans un lecteur de plaque de puits de 384. Faire tourner la plaque à 1 000 x g pendant 30 min. Placez la plaque dans un lecteur de plaque et recueillez 10 mesures de diffusion de la lumière.
  2. Caractérisation kraS4b-FMe liant aux liposomes par résonance plasmon de surface (SPR)
    1. Assembler les matériaux requis : un instrument SPR; puce de capteur L1; tubes flacons de 7 x 14 mm; et CHAPS.
    2. Préparer un tampon contenant 20 mM HEPES (pH 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Préparer une série de dilution 2:1 de KRAS4b-FMe à partir de 60 M-0,06 M dans un volume total de 200 L (10 titrations au total). Transférer les échantillons dilués finaux dans des tubes de flacon (voir Tableau des matériaux),placer les tubes de flacon dans un rack, et insérer les échantillons dans l'instrument SPR.
    3. Insérez la puce du capteur L1 dans l'instrument SPR. Fixez le tampon et amorcez le système avec un tampon pendant 7 min.
    4. Configurez une méthode automatisée comme suit :
      1. Fixer la température de l'instrument à 25 oC.
      2. Activez la puce du capteur L1 en la rinçant à l'injection de deux injections de 20 mM de 20 mM de CHAPS dissous dans l'eau à un débit de 30 l/min.
      3. Effectuez des cycles de démarrage de dix injections de 1 min de tampon de fonctionnement pour hydrater la surface de la puce.
        1. Déposez les liposomes sur la puce du capteur L1 en injectant les liposomes sur la cellule d'écoulement (FC)-2 de la puce L1 avec des injections de 2 min à 5 l/min. Visez un niveau de capture d'au moins 3 000 unités d'intervention (REU).
          REMARQUE : Augmentez le temps d'injection jusqu'à ce que vous atteigniez le niveau de capture approprié.
      4. Injecter trois cycles de tampon sur les deux FC-1 et FC-2 avec des injections de 1 min à 30 l/min.
        1. Injectez les différentes titrations KRAS4b-FMe de la série de concentration la plus basse à la plus élevée. Injecter les protéines à l'aide d'injections de 1 min pour la phase d'association et de 2 min d'injections pour la phase de dissociation à un débit de 30 l/min sur les deux FC.
        2. Régénére la puce du capteur L1 en la rinçant avec deux injections de 1 min de 20 mM CHAPS à 30 l/min.
    5. Adapter les données à l'aide du logiciel d'évaluation SPR à l'aide d'un modèle de liaison de site unique pour obtenir des affinités de liaison apparentes (voir la section Discussion pour une explication de l'ajustement des données).

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Results

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L'une des variables les plus importantes du protocole est la quantité de protéines cibles exprimées (His6-MBP-tev-KRAS4b). Ce protocole a été développé à l'aide d'un isolat d'une lignée de cellules Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adapté pour la croissance de la suspension et scié à partir de sérum. Étant donné la vaste gamme de résultats rapportés à travers les différentes lignées de cellules d'insectes avec le système d'expression du baculovirus, il est conseillé que Tni-FNL soit utilisé, au...

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Discussion

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Comme indiqué dans la section Résultats représentatifs, l'étape la plus critique pendant la purification est la manipulation de l'échantillon pendant le temps qu'il est dans le sel inférieur. Limiter le temps d'exposition de l'échantillon à moins de 200 mM NaCl contribuera à réduire les précipitations et à augmenter le rendement de l'échantillon. L'interprétation des résultats du CEX peut être difficile si le profil ne correspond pas aux attentes (voir la figure 2). Jusqu'à ce que le protoco...

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Disclosures

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

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Nous reconnaissons le soutien au clonage et à l'expression de Carissa Grose, Jen Melhalko et Matt Drew du Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Ce projet a été financé en totalité ou en partie par des fonds fédéraux de l'Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention des noms commerciaux, des produits commerciaux ou des organisations n'implique pas nécessairement l'approbation par le gouvernement des États-Unis.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubes Safe-Lock de 1,8 ml, naturelEppendorf22363204
11 mm Cl SS Flacons d’échantillonneur automatique ThermoScientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC)AVANTI POLAR LIPIDSacheter sous forme de stocks liquides sous forme de chloroforme
1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phospho-sérine (POPS)AVANTI POLAR LIPIDS840034acheter sous forme de stocks liquides dans le chloroforme
5427R CentrifugeuseEppendorf
Acétonitrile, HPLC GradeFisher ChemicalA998-1 1L
Acétate d’ammoniumSigma-Aldrich09689-250g
Gazargon AirgasARUP
Plaque de dosage 384CORNING3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Bain à ultrasonsThermo Fisher15-336-1000
Colonne de chromatographie échangeuse de cations (CEX)GE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP Sepharose Haute Performance
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Lecteur de plaquesWyatt Technologies
Exactive Plus Spectromètre de masse EMRThermo Scientific
Acide formiqueSigma-AldrichF0507-500MlUtiliser un réactif de qualité supérieure
Flacons Gilson Tubes 7x14 mm TubesGE HealthcareBR-1002-12
Flacons à filetage en verre avec doubluresen mousse PTFESpécialités scientifiquesB69302
Centrifugeuse à grande vitesse/de paillasseThermo Fischer Scientific05-112-114Dcapable de produire jusqu’à 4 000 xg
protéase du virus de gravure du tabac (TEV)Addgene92414Purifié selon Raran-Kurussi et al. (2017) Élimination des marqueurs d’affinité avec la protéase TEV. Dans : Burgess-Brown N. (eds) Expression génique hétérologue chez E. coli. Méthodes en biologie moléculaire, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Colonne Chromatographie par affinité métallique immobilisée (IMAC)GE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Approvisionnement en eau interne, Arium AdvanceSartorius StedimRésistivité de 18 M&Omega ;
d’extrudeuse de lipides 0 cm avec supportAVANTI POLAR LIPIDS
Azote liquideAirgasMicrofluidiseur NI-DEWAR
M110-EHMicrofluidics
MabPac RP Colonne UHPLC, 4 um, 3,0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Colonne, 5 um, 300 & Aring ;, 2,1 x 150 mmThermo Scientific088790
Logiciel MagTranThermo Scientific
Méthanol, HPLCGrade VWR ChemicalsBDH20864.400
Système de chromatographie NGCBioRad78880002NGC QuestTM 100 Système de chromatographie
Inhibiteur de protéase Cocktail sans EDTA ou autres chélateursMillipore SigmaP8849
Capuchons en caoutchouc type 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Sensor Chip L129104993GE Healthcare
ThermoFischer Scientific13-400-519Absorbace à 280 nm
Unités de filtre centrifuge Ultra-15, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008membrane PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtres à centrifugerAmiconUFC501024
UltracentrifugeuseBeckman CoulterOptima - L80Kcapable de 100 000 xg
Vanquish UHPLC (pompe, colonne de refoulement et système LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Eau, qualité HPLCSigma-Aldrich270733-1LPeut utiliser une source d’eau interne (voir ci-dessous)
Seringue Whatman GD/XP PES 0,45 mm filtreGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserLogiciel de protéomique ThermoScientific
850457 de Kit 610023 Spectrophotomètre

References

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