Article de méthode

Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome

DOI :

10.3791/60705

⸱

1 février 2020

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Décrit ici est l'utilisation d'une méthode d'amplification de sonde méthylation-spécifique pour analyser des niveaux de méthylation des éléments de LIGNE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires ostéosarcoma-dérivées. L'ultracentrifugation, une procédure populaire pour séparer les vésicules extracellulaires du sérum bovin foetal, est également démontrée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'amplification de sonde spécifique à la méthylation (MSPA) est une technique simple et robuste qui peut être utilisée pour détecter les différences relatives dans les niveaux de méthylation des échantillons d'ADN. Il est débrouillard, nécessite de petites quantités d'ADN, et prend environ 4 à 5 h de travail pratique. Dans la technique présentée, les échantillons d'ADN sont d'abord dénaturés puis hybridés en sondes qui ciblent l'ADN à des sites méthylés ou de référence comme un contrôle. L'ADN hybride est séparé en réactions parallèles, l'une subissant seulement la ligature et l'autre subissant la ligature suivie de la digestion HhaI-négociée aux séquences non méthylées de GCGC. Les fragments d'ADN qui en résultent sont amplifiés par PCR et séparés par l'électrophorèse capillaire. Les sites GCGC méthylés ne sont pas digérés par HhaI et produisent des signaux de pointe, tandis que les sites GCGC non méthylés sont digérés et aucun signal de pointe n'est généré. La comparaison des pics normalisés de contrôle des versions digérées et non digérées de chaque échantillon fournit le rapport de dosage de méthylation d'un échantillon d'ADN. Ici, MSPA est utilisé pour détecter les effets des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome (VE) sur le statut de méthylation de l'élément nucléaire entrecoupé à long (LINE-1) dans les cellules souches mésenchymales. Les LINE-1 sont des éléments d'ADN répétitifs qui subissent généralement une hypométhylation dans le cancer et, à ce titre, peuvent servir de biomarqueur. L'ultracentrifugation est également utilisée comme méthode rentable pour séparer les vésicules extracellulaires des fluides biologiques (c.-à-d. lors de la préparation du sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques [FBS] et de l'isolation des VE à partir des médias conditionnés par l'ostéosarcome [centrifugation différentielle]). Pour l'analyse de méthylation, les sondes LINE-1 personnalisées sont conçues pour cibler trois sites de méthylation dans la séquence de promoteur LINE-1 et sept sites de contrôle. Ce protocole démontre l'utilisation de MSPA pour l'analyse de méthylation LINE-1 et décrit la préparation de LA SF APPAUVRIe par ultracentrifugation.

Introduction

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La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique majeure qui se produit dans les cellules humaines. La méthylation de l'ADN fait référence au lien entre les groupes méthyliques et les résidus de cytosine dans les dinuccléotides du CpG. De tels dinucleotides se trouvent habituellement dans les grappes (îles CpG) à la région de 5' des gènes1. Dans les cellules normales, la plupart de ces dinucléotides existent dans un état non méthylé, ce qui permet la transcription de l'ADN. Incidemment, de nombreux cancers sont associés à des îles cpG hyperméthylées et au silençage transcriptomique2, en particulier dans les gènes suppresseurs de tumeurs, qui à leur tour contribuent à diverses caractéristiques du cancer3.

D'autre part, les éléments nucléaires entrecoupés de longue durée-1 (LINE-1 ou L1) sont des éléments d'ADN répétitifs et transposables qui ont normalement des niveaux élevés de méthylation dans les îles CpG. La méthylation de LINE-1 empêche la translocation et aide à maintenir l'intégrité du génome. Dans plusieurs types de cancer, LINE-1 est hypométhylé, ce qui entraîne l'activation et l'instabilité chromosomique rétrotransposition-négociée subséquente4. LINE-1 représente près de 17% du génome humain5, et son statut de méthylation peut servir d'indicateur des niveaux de méthylation génomique mondiale6. L'hypométhylation globale de LINE-1 est considérée pour précéder la transition des cellules à un phénotype de tumeur7; par conséquent, il est prometteur comme marqueur potentiel pour l'début précoce du cancer.

Actuellement, il existe plusieurs méthodes pour l'analyse de la méthylation, y compris le pyrosequencing, la méthylation spécifique PCR, microarrays, et l'immunoprécipitation de chromatine1. L'utilisation du séquençage de nouvelle génération a également permis d'intégrer des approches à l'échelle du génome pour la détection de la méthylation de l'ADN. Bon nombre de ces méthodes reposent sur l'ADN traité au bisulfite, dans lequel les cytosines non méthylées sont converties en uracil et les cytosines méthylées restent inchangées. Cependant, le travail avec l'ADN bisulfite-traité a plusieurs pièges, tels que les conversions incomplètes des cytosines unmethylées à l'uracil, l'amplification biaisée des séquences, et les erreurs de séquençage8.

Dans l'amplification de sonde méthylation-spécifique (MSPA), les sondes composées de deux oligonucléotides ciblent des séquences d'ADN contenant un emplacement de restriction (GCGC) pour l'enzyme de restriction méthylation-sensible HhaI9. Une fois que les sondes s'hybrident à l'ADN, chaque échantillon est divisé en deux ensembles. Les sondes dans le premier ensemble subissent une ligature, tandis que les sondes dans le deuxième ensemble subissent une ligature suivie d'une digestion Médiée par HhaI sur les sites CGCG non méthylés. Les deux ensembles d'échantillons sont ensuite amplifiés par PCR, et les produits sont séparés par l'électrophorèse capillaire. Les sondes sur les sites non méthylés sont digérées par HhaI et ne sont pas amplifiées pendant le PCR, ce qui n'entraîne aucun signal de pointe. En revanche, les sondes sur les sites méthylés sont protégées de la digestion et sont donc amplifiées pendant pcR, générant par la suite des signaux de pointe10.

MSPA a plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives. Tout d'abord, il nécessite une faible quantité d'ADN (50 à 100 ng) et est bien adapté pour l'analyse de l'ADN à partir d'échantillons de paraffine fixée parlinanine formaline10. Il ne nécessite pas d'ADN bisulfite-traité; en fait, il est impropre à l'ADN qui est modifié de cette façon. De nombreux échantillons peuvent être analysés en même temps, et les sondes MSPA peuvent être conçues de telle sorte qu'elles ciblent plusieurs gènes ou séquences simultanément. En outre, les sondes sont spécifiques et sensibles pour l'ADN méthylé que le site de restriction HhaI correspond à une séquence qui est typique des îles CpG10.

Cette étude a étudié les effets des vésicules extracellulaires (VES) dérivées de l'ostéosarcome (OS) sur la méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales dérivées du tissu adipeux (AT-MSCs; Figure 1). Les véhicules électriques sont des vésicules à l'échelle nanométrique et membranaire sécrétées par la plupart des types de cellules. Ils transportent des protéines, des lipides, de l'ARNm, des microARN et des molécules supplémentaires provenant des cellules parentes11,12. Les véhicules électriques jouent la médiation de la communication intercellulaire et jouent des rôles importants dans plusieurs conditions pathophysiologiques13,14. Une étude récente a montré que les véhicules électriques dérivés du cancer peuvent transférer le LINE-1 actif aux cellules receveuses15. Il a été rapporté plus tôt que les véhicules électriques de la lignée cellulaire HOS-143B peuvent modifier le statut de méthylation de LINE-1 dans les MSC, en plus d'autres effets génétiques16.

Lors de la culture des cellules pour l'isolement des véhicules électriques, il est important d'utiliser le sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques dans le milieu de croissance, puisque les véhicules électriques dérivés du FBS peuvent interférer avec les véhicules électriques provenant d'autres sources et entraver les résultats17,18. L'ultracentrifugation est l'une des méthodes les plus courantes pour épuiser les véhicules électriques de FBS. Il s'agit d'une procédure relativement simple et rentable par rapport à des alternatives telles que l'ultrafiltration et commerciale EV-appauvri FBS19. Ici, le protocole montre également comment préparer EV-appauvri FBS par ultracentrifugation.

Cet article présente un protocole détaillé pour les techniques susmentionnées, de l'isolement des véhicules électriques d'une lignée cellulaire OS à l'analyse de méthylation de LINE-1 dans les MSC traités PAR OS-EV (Figure 1).

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Protocole

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Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique d'Helsinki et le district hospitalier d'Uusimaa (approbation éthique D. No. 217/13/03/02/2015).

1. Préparation de FBS EV-appauvri par ultracentrifugation

  1. Prenez FBS dans des tubes (ultra)centrifugeurs et placez-les dans des seaux ultracentrifuges. Pour s'assurer que l'ultracentrifugation fonctionne sans heurts et en toute sécurité, équilibrez les seaux à moins de 10 mg les uns des autres.
  2. Chargez les seaux sur un rotor oscillant (type SW28, k-facteur 246). Placer le rotor dans l'ultracentrifuge et courir à 100 000 x g pendant 19 h à 4 oC.
  3. Recueillir soigneusement la couche supérieure de couleur claire du supernatant (environ neuf dixièmes) et transférer dans un tube de 50 ml. Ne pas déranger ou pipette la granule brun foncé, car il contient des véhicules électriques de FBS.
  4. Passer le supernatant à travers un filtre de 0,22 m dans un nouveau tube de 50 ml.
  5. Ajoutez le FBS stérilisé par filtre et appauvri par les véhicules électriques aux milieuis de culture cellulaire lors de la croissance des cellules pour l'isolement des véhicules électriques.

2. Isolement des véhicules électriques dérivés de l'ostéosarcome

  1. Cellules d'OS de plaque (ligne cellulaire hos-143B) dans un flacon de T-175 avec rpMI 1640 milieu, complété avec 10% normal FBS et 1% antibiotiques (100 U/mL pénicilline, 0.1 mg/mL streptomycine). Placer le flacon dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2.
  2. Lorsque le flacon est de 70 % à 80 % de confluents, lavez les cellules à l'alin tamponné par le phosphate (PBS) puis développez-les dans des médias contenant 10 % de FBS appauvri par les véhicules électriques (ci-après appelés médias appauvris par les véhicules électriques).
    REMARQUE : 1 x 106 cellules HOS-143B plaquées dans un flacon T175 atteignent 70 % de confluence après environ 60 h.
  3. Au cours des 48 heures suivantes, recueillir les médias conditionnés à partir de cellules d'ostéosarcome après chaque 24 h et ajouter des médias frais EV appauvri.
  4. Centrifuger le support conditionné à 2500 x g pendant 20 min à 4 oC pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Transférer le supernatant dans un nouveau tube, en laissant environ 2 ml de support au fond.
    REMARQUE : S'il n'est pas directement en phase avec l'isolement des véhicules électriques à ce stade, le supernatant peut être stocké à -80 oC.
  5. Verser le supernatant dans des tubes d'ultracentrifuge et les équilibrer plus tôt. Centrifuger les tubes à 100 000 x g pour 2 h à 4 oC.
  6. Jetez soigneusement le supernatant, en laissant environ 1 ml au fond. Ajouter environ 20 ml de PBS (0,1 m filtré) au tube et à la pipette doucement pour laver et suspendre à nouveau le granule EV.
  7. Équilibrez les tubes et effectuez un autre cycle d'ultracentrifugation avec les mêmes réglages.
  8. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille EV en 200 L de PBS par pipetting douce. Conservez les véhicules électriques dans des tubes à faible liaison.
    REMARQUE : Les véhicules électriques peuvent être utilisés immédiatement ou entreposés dans -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.

3. Caractérisation des OS-EV

REMARQUE : Les véhicules électriques purifiés peuvent être caractérisés par des ballonnements occidentaux (WB), l'analyse du suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique de transmission (TEM)16.

  1. Effectuer WB selon le protocole standard16 avec des marqueurs EV CD63, TSG101, et Hsp70, et avec la calnexine comme un contrôle négatif pour indiquer la pureté de l'échantillon EV20.
  2. Pour NTA, diluer d'abord l'échantillon EV dans le PBS filtré de 0,1 m de Dulbecco pour obtenir (idéalement) 30 à 100 particules par image.
    1. Prenez environ 500 l'échantillon dans une seringue de 1 ml et chargez-le dans le port d'entrée de l'instrument NTA. Vérifiez qu'il y a suffisamment de particules par image, pour des mesures précises.
    2. Ouvrez le logiciel NTA et enregistrez cinq vidéos de durée de 60 s, en utilisant le niveau de la caméra 13 à température ambiante. Pendant l'analyse, utilisez le seuil de détection de 5 et le gain de 10.
  3. Analyser les échantillons de véhicules électriques par TEM tel que décrit précédemment21.

4. Culture AT-MSC

REMARQUE : Le tissu adipeux humain pour l'isolement mésenchymal de cellules souches a été fourni comme aspiration de liposuccion (Département de chirurgie plastique, Laser Tilkka Ltd., Finlande). Le consentement éclairé écrit a été pris des donateurs de lipoaspirate, qui subissaient des procédures électives de liposuccion.

  1. Isoler les AT-MSC des aspirates de la liposuccion en utilisant des méthodes d'isolation mécaniques et enzymatiques standard22.
    REMARQUE : Des MSC d'autres sources (y compris les lignées cellulaires commerciales) peuvent également être utilisés.
  2. Les cellules de culture dans les médias d'DMEM/F-12 ont complété avec 10% FBS et 1% antibiotiques.

5. Traitement des MSC avec OS-EV

  1. Plaque 15 000 AT-MSC par puits dans une assiette de 24 puits.
  2. Après 24 h, retirez les vieux supports, lavez les cellules avec du PBS et changez-les en médias appauvris par les véhicules électriques.
  3. Traiter les cellules avec os-VE (à une concentration de particules de 1 x 106 VÉHICULES électriques par cellule) le jour 1 (24 h après l'adhérence cellulaire), le Jour 3 (48 h après le jour 1) et le Jour 5 (96 h après le jour 1).
    1. Arrêter le traitement OS-EV pour les échantillons de point de temps (TP) 0 le jour 1, les échantillons TP 3 le jour 3 et Les échantillons TP 7 le jour 7 (48 h après le jour 5).
      REMARQUE : D'autres calendriers temporels selon les plans expérimentaux peuvent également être suivis.
  4. Extraire l'ADN des MSC en utilisant une méthode appropriée. Inclure des échantillons de contrôle positifs et négatifs pour l'analyse des données.

6. Ligne-1 méthylation d'assay

  1. Concevoir les amorces de sonde LINE-1 personnalisées, comme cela a déjà été fait par Pavicic et coll.23. Pour les sondes de méthylation, sélectionnez trois séquences contenant le site de restriction HhaI dans la région promoteur de LINE-1. Pour les sondes de contrôle, sélectionnez sept séquences dépourvues du site de restriction HhaI du reste de la séquence LINE-1.
    REMARQUE : La séquence LINE-1 est disponible dans la base de donnéesGenBank 24 (L1.2, accession no. AH005269.2). Utilisez les instructions du fabricant MSPA pour la conception des sondes25.
  2. Diluer 70 ng d'échantillon d'ADN dans un tampon TE à un volume de 5 L.
  3. Effectuer les étapes subséquentes de thermocyclisme et de PCR comme mentionné dans le tableau 1. Chauffer les échantillons pendant 10 min à 98 oC, puis laisser refroidir à 25 oC.
  4. Ajoutez un mélange d'hybridation de sonde de 3 ll à chaque échantillon et exécutez le thermocycleur pour permettre aux sondes de s'hybrider à l'ADN.
  5. À température ambiante (RT), ajouter 13 ll de mélange post-hybridation à chaque échantillon. Transférer 10 l dans un deuxième tube.
  6. Placer les deux ensembles de tubes dans le thermocycler et couver à 48 oC pendant au moins 1 min.
    1. Alors que les échantillons sont à 48 oC, ajouter 10 oL du mélange de ligature à la première série de tubes (série non digérée) et 10 l du mélange ligature-digestion à la deuxième série de tubes (série digérée). Exécutez le prochain programme de thermocycler.
  7. Faites tourner les tubes et fixez simultanément le thermocycleur à 72 oC.
  8. Ajouter 5 ll de mélange de polymérase à chaque tube et placer les tubes dans le thermocycleur. Exécutez le programme PCR.
  9. Pendant que le programme PCR est en cours d'exécution, préparer une solution de 1 ml de formamide contenant 2,5 l de norme de taille. Pipette 10 l de cette solution à chaque puits d'une plaque optique de puits 96 (avec code à barres).
  10. Après PCR, diluer les échantillons non digérés et digérés à 1:100 et 1:200 respectivement dans l'eau ultrapure. Ajouter 2 L de produit PCR dilué à la plaque de puits 96. Centrifuger la plaque à 200 x g pour 15 à 20 s pour enlever les bulles d'air.
  11. Effectuer l'analyse fragmentaire d'échantillons par électrophoresis capillaire.
    REMARQUE : La plaque doit être entreposée à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à l'analyse.

7. Analyse des données fragmentaire

  1. Ouvrir l'électrophoresis capillaire entraîne un logiciel d'analyse d'électrophéromigramme.
    1. Sous la colonne Panel, pour l'un des échantillons, choisissez MLPA dans le menu. Cliquez sur l'en-tête du panneau et appuyez sur Ctrl-D pour appliquer MLPA à tous les échantillons.
    2. De la même manière, définir la méthode d'analyse par défaut Microsatellite pour tous les échantillons.
    3. Sélectionnez tous les échantillons et cliquez sur le bouton de lecture verte pour analyser les échantillons selon les paramètres choisis.
    4. Sélectionnez tous les échantillons et cliquez sur le bouton Graphique pour visualiser les pics de la sonde.
    5. Zoom sur la région de pointe pour une résolution plus élevée des pics de sonde individuels. Assurez-vous que les 10 pics correspondant aux sondes du mix de sonde LINE-1 sont étiquetés. Jetez les pics supplémentaires (lt;95 bp et '160 bp).
    6. Dans l'onglet Génotypes, exportez les résultats dans le format des valeurs de virgule séparées (CSV).
  2. Ouvrez le fichier CSV dans un logiciel d'analyse de données et triez les données en colonnes.
    1. Étiquetez les trois pics du site de méthylation en fonction de leur taille approximative (L1-1m à 153 bp, L1-2m à 119 bp, L1-3m à 133 bp). Les sept autres pics correspondent aux sondes de contrôle.
      REMARQUE: Ici, les valeurs des pics de sonde L1-2m sont utilisés, qui ont une taille de 117 bp, puisque cette région a été utilisée dans la plupart des essais de méthylation LINE-123.
    2. Pour chaque échantillon (non digéré et digéré), calculez la superficie maximale des sept pics témoins. Divisez la zone de pointe de chaque sonde LINE-1 par cette somme.
    3. Pour chaque échantillon d'ADN, divisez la valeur de l'échantillon digéré par celle de l'échantillon non digéré pour obtenir le rapport de dosage de méthylation (DM)en utilisant l'équation suivante :
      figure-protocol-1
      Où: DM est le rapport de dosage de méthylation, Ax est la zone sous le pic x (par exemple, L1-2m pic), et Actrl est la zone de pointe de somme des sept sondes de contrôle.

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Résultats

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L'objectif principal de cette étude était d'évaluer les effets épigénétiques des OS-VE sur les MSC. OS-VE ont été isolés à partir de cellules HOS-143B en utilisant la méthode standard de centrifugation différentielle. L'expression des marqueurs EV typiques CD63, Hsp70 et TSG101 par le ballonnement occidental a confirmé la présence d'OS-EV. (Figure 2A). L'absence de signal de calnexin a indiqué la pureté de l'isolat d'OS-EV. D'autres indications de pureté ont été observées av...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude illustre comment MSPA peut être utilisé pour détecter et quantifier le statut de méthylation d'un élément génétique spécifique. LINE-1 a été l'objet ici, mais les sondes peuvent être conçues pour cibler une gamme de gènes et de séquences. En outre, il existe une liste croissante de mélanges de sondes disponibles pour différentes applications. MSPA est une technique simple et robuste pour l'analyse de méthylation de l'ADN qui ne nécessite pas de conversion bisulfite10. La procédure comp...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été financés par le financement du projet de l'Université d'Helsinki (WBS490302, WBS737141112) du financement de l'Hôpital universitaire d'Helsinki pour la recherche en santé au niveau universitaire (Y1014SUL05, TYH2016130), la Fondation médicale finno-norvégienne et la Fondation médicale finno-norvégienne, et Fonds Maja-Lisa Selander (Fondation Minerva). Nous remercions Walter Pavicic d'avoir fourni le protocole MSPA modifié et du soutien technique connexe. Nous sommes reconnaissants à Teemu Masalin (Université d'Helsinki) de nous avoir aidés avec la production vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mLTerumoSS+01T1pour plaque NTA
24 puitsCorning3524MSC
culture cellulaire 3730xl Analyseur d’ADNApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
50 mL Tube à centrifugerCorning430829
Beckman Optima LE-80K UltracentrifugeuseBeckman
BlueStar Prestained Protein MarkerNippon GeneticsMWP03WB : marqueur protéique
Calnexin (clone C5C9)Cell Signaling Technology2679WB, dilution 1:800
CD63 (clone H5C6)BD Biosciences556019WB, dilution 1:1000
Centrifuge 5702 REppendorf5703000010Pour milieux conditionnés et cellules
Centrifuge 5810Eppendorf5810000010Pour la rotation d’une plaque à 96 puits
Tube à centrifuger (polyallomère, 14x95 mm)Beckman331374Ultracentrifugation
DMEM/F-12 + GlutaMAX mediumGibco, Life Technologies31331-028Pour la culture AT-MSC
Sérum fœtal bovinGibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ norme de tailleApplied Biosystems, Life Technologiespour l’électrophorèse
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2-10RXNpour contrôle négatif MSPA
Hi-Di formamideApplied Biosystems, Life Technologies4311320pour l’électrophorèse capillaire
HOS-143B lignée cellulaireATCCCRL-8303
Hsp70 (clone 5G10)BD Biosciences554243WB, dilution 1:1000
IRDye 800CW Chèvre anti-sourisLi-Cor926-32210WB : secondaire
IRDye 800CW Chèvre anti-lapinLi-Cor926-32211WB :
primaire LINE-1 sonde-mixIDTSéquences dans le tableau 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate avec code-barresApplied Biosystems, Life Technologies4306737nécessite également un film d’étanchéité
Micro BCA Kit de dosage des protéinesThermoFisher Scientific23235pour mesurer la concentration en protéines
MiniProtean TGX 10 % gelsBio-Rad456-1034WB : électrophorèse sur gel
NanoSight LM14CMalvern Instrumentspour membrane
nitrocellulosique NTA 0.2 µ ; mBio-Rad1620112WB : transfert de protéines
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50pour l’extraction d’ADN
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000WB : bloquant, anticorps
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Pénicilline-streptomycineGibco, Life TechnologiesDE17-602EAntibiotiques pour milieu de culture
Protein LoBind tube, 0,5 mLEppendorf22431064Pour le stockage Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution KitLi-Cor926-11015WB : coloration des protéines totales
RKO lignée cellulaireATCCCRL-2577pour MSPA contrôle positif
RPMI medium 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010Pour la culture cellulaire HOS-143B
SALSA MLPA HhaI enzymeMRC-HollandSMR50
SALSA MLPA kit de réactifsMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 sonde-mixMRC-HollandP300-100R
Rotor oscillant SW-28Beckman Coulter342207d’ultracentrifugation
, 0,22 & micro ; mJet BiofilFPE-204-030filtre stérile FBS
Tecnai 12FEI Companyéquipé de Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., USA) ; pour TEM
TBS, 1X comprimésMedicago09-7500-100WB : tampon
Trans-Blot TurboBio-RadWB : transfert
ThermocycleurThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021pour la trypsinisation des cellules
TSG101 (clone 4A10)SigmaSAB2702167WB, dilution 1:500
4322682 capillaire Filtre à seringue TCA0096

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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