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Localisation et quantification des bégomovirus dans les tissus de la mouche blanche par immunofluorescence et PCR quantitatif

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DOI :

10.3791/60731

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8 février 2020

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1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode d’immunofluorescence et quantitative de PCR pour la localisation et la quantification des bégomovirus dans les tissus d’insecte. Le protocole d’immunofluorescence peut être utilisé pour colocaliser les protéines virales et vectorielles. Le protocole pcR quantitatif peut être étendu pour quantifier les virus dans des corps entiers de mouche blanche et des plantes infectées par le virus.

Résumé

Les begomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae)sont transmis par les mouches blanches du complexe Bemisia tabaci d’une manière persistante et circulative. Compte tenu des dommages considérables causés par les bégomovirus à la production agricole dans le monde entier, il est impératif de comprendre l’interaction entre les begomovirus et leur vecteur de mouche blanche. Pour ce faire, la localisation et la quantification du virus dans les tissus vectoriels sont cruciales. Ici, en utilisant le virus de boucle jaune de feuille de tomate (TYLCV) comme exemple, nous décrivons un protocole détaillé pour localiser des bégomovirus dans les midguts de mouche blanche, les glandes salivaires primaires, et les ovaires par immunofluorescence. La méthode est basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques contre une protéine de couche virale, des anticorps secondaires étiquetés colorants et un microscope confocal. Le protocole peut également être utilisé pour colocaliser les protéines bégomovirales et les protéines de la mouche blanche. Nous décrivons en outre un protocole pour la quantification de TYLCV dans les mouches blanches midguts, glandes salivaires primaires, hémolymphe, et ovaires par PCR quantitatif (qPCR). À l’aide d’amorces spécialement conçues pour TYLCV, les protocoles de quantification permettent de comparer la quantité de TYLCV dans différents tissus de la mouche blanche. Le protocole décrit est potentiellement utile pour la quantification des bégomovirus dans le corps d’une mouche blanche et d’une plante infectée par le virus. Ces protocoles peuvent être utilisés pour analyser la voie de circulation des bégomovirus dans la mouche blanche ou comme complément à d’autres méthodes pour étudier les interactions whitefly-begomovirus.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les bégomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae) ont causé de graves dommages à la production de nombreux légumes, fibres et cultures ornementalesdansle monde 1 . Les begomovirus sont transmis de manière persistante par la mouche blanche Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), qui est une espèce complexe contenant plus de 35 espèces cryptiques2,3. Les begomovirus peuvent affecter directement ou indirectement la physiologie et le comportement des mouches blanches, tels que la fécondité4, la longévité4, et la préférence de l’hôte5,6. En outre, l’efficacité de transmission d’une espèce/souche de bégomovirus donnée varie pour différentes espèces cryptiques de mouches blanches même dans les mêmes conditions expérimentales7,8,9,10, indiquant qu’il existe une interaction complexe entre les bégomovirus et les mouches blanches. Pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux interactions entre la mouche blanche et le bégomovirus, la localisation et la quantification du virus dans les tissus de la mouche blanche sont essentiels.

Le virus de la courbure jaune de la tomate (TYLCV) est un bégomovirus qui a été signalé pour la première fois en Israel, mais qui cause aujourd’hui de graves dommages à la production mondiale de tomates11,12. En raison de son importance économique, il est l’un des bégomovirus les mieux étudiés13. Comme d’autres bégomovirus monopartites, TYLCV est un virus de l’ADN circulaire à brin unique dont la taille du génome est d’environ 2 800 nucléotides14. Bien que toujours en débat, plusieurs lignes de preuve soutiennent la réplication de TYLCV chez les mouches blanches15,16,17. En outre, l’interaction des particules TYLCV et des protéines de la mouche blanche a été signalée6,18,19,20. Pour la transmission du virus, les mouches blanches acquièrent le TYLCV en se nourrissant de plantes infectées par le virus, les virions passent le long du canal alimentaire pour atteindre l’œsophage, pénètrent dans la paroi intermédiaire pour atteindre l’hémolymphe, puis se translocalisent dans les glandes salivaires primaires (GS). Enfin, les virions sont égeées avec de la salive le long du conduit salivaire dans le phlomevégétal 21. En outre, plusieurs études montrent que TYLCV est capable d’être transmis transovarialement des mouches blanches femelles à leur progéniture22,23. En d’autres termes, pour atteindre une transmission productive, le virus doit surmonter les barrières cellulaires à l’intérieur de la mouche blanche pour transloquer d’un tissu à l’autre. Pendant le franchissement de ces barrières, des interactions entre la mouche blanche et les protéines virales sont susceptibles de se produire, ce qui déterminera probablement l’efficacité avec laquelle les virus sont transmis.

L’immunofluorescence est une technique couramment utilisée pour l’analyse de la distribution de protéines. La spécificité des anticorps se liant à leur antigène forme la base de l’immunofluorescence. En raison de l’importance économique de TYLCV, des anticorps monoclonaux contre la protéine de couche TYLCV ont été développés, offrant un moyen très sensible de localiser le virus24. Le PCR quantitatif (qPCR) permet une quantification sensible et spécifique des acides nucléiques. Cette technique est le plus souvent basée sur l’utilisation de sondes hydrolysques (p. ex. TaqMan) ou de colorant fluorescent (p. ex., SYBR Green). Pour le qPCR à base de sonde d’hydrolyse, des sondes spécifiques sont nécessaires, ce qui augmente le coût. Le qPCR à base de colorant fluorescent est plus simple et plus rentable, car les sondes d’hybridation étiquetées spécifiques à l’amplicon ne sont pas nécessaires25. Jusqu’ici, plusieurs études ont employé l’immunofluorescence et le qPCR avec d’autres méthodes pour étudier les interactions complexes de begomovirus-whitefly. Par exemple, Pan et coll. ont effectué l’analyse qPCR et l’immunofluorescence du virus dans les tissus de la mouche blanche et ont constaté que la différence dans la capacité de transmettre le virus de la pousse bouclée du tabac (TbCSV) entre les espèces de mouches blanches AsiaII 1 et Moyen-Orient Asie mineure 1 (MEAM1) était due au fait que le virus était capable de traverser efficacement la paroi intermédiaire d’AsiaII1 mais pas MEAM18. De même, alors que les mouches blanches méditerranéennes (MED) peuvent facilement transmettre TYLCV, elles ne transmettent pas le virus de la chine de courbure jaune de tomate (TYLCCNV). La transmission sélective a été étudiée à l’aide de la détection d’immunofluorescence du virus dans les PSG, qui a montré que TYLCCNV ne traversent pas facilement les PSG des mouches blanchesMED 26. La colocalisation d’immunofluorescence de TYLCV CP et de la protéine de marqueur d’autophagie ATG8-II dans les mouches blanches montre que l’autophagie joue un rôle critique dans la répression de l’infection de TYLCV dans la mouche blanche27.

Ici, en utilisant TYLCV comme exemple, nous décrivons un protocole pour la localisation des begomovirus dans les mouches blanches, les PSG et les ovaires par une technique d’immunofluorescence. La technique comprend la dissection, la fixation et l’incubation avec des anticorps secondaires primaires et étiquetés par colorant. Les signaux de fluorescence montrant l’emplacement des protéines virales dans les tissus de la mouche blanche peuvent alors être détectés sous un microscope confocal. Plus important encore, ce protocole peut être utilisé pour colocaliser les protéines bégomovirales et les protéines de la mouche blanche. Nous décrivons en outre un protocole pour la quantification de TYLCV utilisant le qPCR à base verte de SYBR dans les midguts de mouche blanche, les PSG, les hémolymphes, et les ovaires, qui peut être employé pour comparer la quantité de virus dans différents échantillons de tissu de mouche blanche.

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Protocole

1. Whitefly, Virus, Plantes, et l’acquisition du virus

  1. Les mouches blanches arrière (MEAM1) sur coton (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) dans des cages à l’épreuve des insectes dans une serre à 26 '1 'C avec un cycle clair:10 de 14:10 et 60 - 10% d’humidité relative.
  2. Effectuer PCR conventionnel basé sur la mouche blanche mitochondriale cytochrome oxidase I gène pour déterminer la pureté de la population de moucheblanche.
    1. Recueillir 20 mouches blanches adultes et les transférer individuellement dans un tube PCR contenant 30 l de tampon de lyse (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45 % [wt/vol] Tween-20, 0,2 % [wt/vol] gélatine, 0,45 % [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinase K).
    2. Ajouter 5 à 7 perles de céramique (2 mm de diamètre) dans chaque tube DE PCR et moudre les échantillons pour effectuer la lyse tissulaire.
    3. Incuber tous les échantillons à 65 oC pendant 1 h, puis 10 min à 100 oC, puis centrifuger brièvement. Utilisez ce supernatant comme modèle pour l’amplification PCR.
      REMARQUE : Le temps d’incubation à 65 oC peut être augmenté si nécessaire.
    4. Préparer la réaction PCR comme suit : 1 U de polymérase d’ADN Taq, 2 L de tampon de 10x (avec Mg2),1,6 l de mélange dNTP (2,5 mL), 0,5 L de chaque apprêt (10 M chacun), 2 l de lysate de tissu de mouche blanche supernatant, et l’eau distillée à un volume total de 20 l par réaction. La séquence d’amorce avant est 5'-TTGATTTTTTGGTCATCATCCAGAAGT-3' et la séquence d’amorce inversée est de 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
      REMARQUE : Un contrôle négatif où l’ADN est substitué à de l’eau sans nucléane et un contrôle positif avec l’ADN de la mouche blanche MEAM1 précédemment vérifié devrait être inclus.
    5. Effectuer pcR en utilisant les paramètres de cycle suivants : dénaturation initiale à 95 oC pendant 3 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95 oC pour 30 s, d’annealing à 50 à 55 oC pour 30 s, et d’extension à 72 oC pendant 1 min, suivie de 72 oC pendant 10 min.
    6. Dig le produit amplifié avec l’enzyme de restriction Taq I. Pour ce faire, préparer le mélange de digestion avec 0,1 L (1 U) d’enzyme, 1 L de 10x Taq I Buffer, 1 L de BSA, 5 'L de produit amplifié, et double de l’eau distillée à un volume total de 10 'L. Incuber à 65 oC pendant 1 h dans un thermocycleur.
    7. Effectuer l’électrophorèse de gel d’agarose des échantillons en chargeant 5 à 7 l de chaque produit digéré et une échelle d’ADN (100-2 000 pb) dans les puits d’un gel agarose de 1 %. Ensuite, observez les tailles de bande d’ADN par coloration rouge gel dans une machine de documentation de gel utilisant la lumière UV. Comparez la taille des bandes des produits digérés au contrôle positif pour déterminer la pureté de la population de mouches blanches.
  3. Agro-inoculer le clone infectieux de TYLCV (numéro d’adhésion GenBank AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) en 3-4 vraies plantes de tomate à stade folique(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
    1. Inoculer 10 ml de milieu Luria-Bertani (LB) contenant de la kanamycine (50 g/mL) et de la rifampicine (50 g/mL) avec une seule colonie. Incuber à 28 oC en secouant à 200 tr/min jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 1,5.
    2. Récolter les agrobactéries par centrifugation à 4 000 x g pendant 10 min. Jeter le supernatant.
    3. Resuspendre les granulés dans 10 ml de tampon d’infiltration, composé de 200 m d’acétosyringone, 10 mM 2-(N-morpholino) d’acide sulfonique d’éthane (MES) et 10 mM MgCl2. Incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h et 2 h.
    4. Infiltrer les feuilles végétales de 2 à 3 à l’aide du mélange à partir de l’étape 1.3.3 avec une seringue sans aiguille de 1 ml. Maintenir les plantes dans une serre à 26 o1 oC.
  4. Environ 1 mois plus tard, effectuez une inspection visuelle et choisissez des plantes montrant la feuille de boucle jaune et les symptômes de cascade.
  5. Transférer les adultes de la mouche blanche non virulife sur des plants de tomates infectés par TYLCV pendant 48 h pour l’acquisition du virus.

2. Dissection et collection de Midguts, Glandes salivaires primaires (PSG), ovaires et hémolymphiques des mouches blanches femelles

  1. Recueillir les mouches blanches en utilisant l’aspiration, puis les placer sur la glace pour les mettre dans le coma. Ajouter 1x tampon PBS (saline tampon tampon de phosphate) sur une lame de microscope, puis placer les mouches blanches dans le tampon 1x PBS pour la dissection sous un microscope stéréo.
    1. Pour la dissection de l’intestin moyen, briser l’abdomen de la mouche blanche et retirer le midgut à l’aide d’une fine aiguille d’acupuncture (0,25 mm de diamètre). Transférer le midgut pour nettoyer, 1x PBS.
    2. Pour la dissection du PSG, casser le corps de la mouche blanche dans le thorax près de la tête du côté dorsal. Ensuite, insérez une aiguille dans le thorax pour fixer la mouche blanche, et utilisez une autre aiguille pour secouer la mouche blanche jusqu’à ce que les deux glandes salivaires soient séparées du corps. Ensuite, transférer les PSG pour nettoyer, 1x PBS.
    3. Pour la dissection des ovaires, briser complètement l’abdomen de la mouche blanche, et utiliser une aiguille pour séparer les ovaires des autres tissus. Ensuite, retirer l’excès de tissus par pipetting.
    4. Pour la collection d’hémolymphes, ajouter 10 l de tampon DE 1 x PBS sur une lame de microscope, puis placer une mouche blanche dans le tampon. Pour obtenir l’hémolymphe, déchirer doucement un trou dans l’abdomen à l’aide d’une fine aiguille d’acupuncture, et appuyez légèrement sur l’abdomen pour libérer l’hémolymphe dans le tampon. Recueillir 8 L du liquide comme échantillon d’hémolymphe.

3. Localisation de TYLCV dans Whitefly Midgut, Primary Salivary Glands, and Ovaries by Immunofluorescence

REMARQUE: La procédure de localisation de TYLCV dans le midguts est présentée comme un exemple. La méthode peut être utilisée pour les PSG et les ovaires.

  1. Disséquer les mi-guts dans le tampon du SCT (10 mM Tris-HCl, 150 mM de chlorure de sodium, pH à 7,5) tel que décrit à l’étape 2.2.1. Recueillir 15 à 20 mouches blanches, les transférer dans un plat Petri en verre (3,5 cm de diamètre), puis enlever l’excès de tampon TBS.
  2. Ajouter 1 ml de paraformaldéhyde de 4 % pour fixer les mi-guts pendant 2 h à température ambiante, puis retirer la solution fixative. Pipette lentement pour laver les mi-guts 3x dans le SCT pendant 2 min chacun.
  3. Incuber les mi-guts dans 1 ml de 0,5% Triton X-100 pendant 30 min à la perméabilize. Ensuite, retirez la solution de perméabilisation et lavez le midguts 3x avec TBST (1x TBS avec 0,05% Tween 20) comme décrit à l’étape 3.2.
  4. Ajouter 1 ml de 1% de BSA (albumine de sérum bovin préparé en TBST) pour bloquer les mi-guts. Effectuer l’étape de blocage à RT pendant 2 h, puis retirer la solution de blocage et laver les midguts 3x en TBST.
  5. Diluer les anticorps primaires (MAb 1C4 contre la protéine de couche TYLCV) à 1:400 avec TBST24 et ajouter la solution dans le plat Petri pour immerger les mi-guts. Incuber à 4 oC toute la nuit dans l’obscurité. Jeter la solution d’anticorps primaire et laver 3x dans TBST.
  6. Diluer les anticorps secondaires (anti-souris) à 1:400 avec TBST et ajouter la solution dans le plat Petri pour immerger les mi-guts. Incuber le plat pendant 2 h à RT dans l’obscurité. Jetez la solution d’anticorps secondaire et lavez les midguts 3x en TBST.
  7. Transférer les mi-guts sur une lame de microscope claire. Aspirez autant de TBST sur la diapositive que possible. Ajouter 1 goutte de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorure) pour tacher le noyau, puis placer le bordereau et sceller avec du vernis à ongles. Examiner sous un microscope confocal.

4. Quantification de TYLCV dans Whitefly Midgut, Primary Salivary Glands, Hemolymph, and Ovaries with qPCR

  1. Disséquer les mouches blanches midguts, PSGs, hémolymphe, et les ovaires dans 1x PBS comme décrit ci-dessus.
  2. Extraire l’ADN des mi-guts, des PSG, des hémolymphes et des ovaires.
    1. Après la dissection, lavez les mi-guts, les PSG et les ovaires dans un tampon PBS propre 2 x 3x.
    2. Recueillir 20 midguts ou 20 PSG dans 5 L de 1x PBS et les transférer dans une solution de lyse de 25 L. Transférer chaque ovaire en 5 L de 1x PBS, puis transférer dans une solution de lyse de 25 L individuellement.
    3. Broyer les échantillons de midguts, de PSG et d’ovaires tels que décrits à l’étape 1.2.2.
    4. Recueillir 8 L d’hémolymphe avec 1x PBS dans un tube PCR, puis ajouter 10 L de solution de lyse. Mélanger.
  3. Extraire l’ADN de tous les échantillons tels que décrits dans 1.2.3.
  4. Préparer deux mélanges principaux qPCR distincts (18 l chacun) pour TYLCV et le contrôle interne (gène del’actine) comme suit : 10 l de mélange SYBR Green, 0,8 L de chaque amorce (10 M chacun) et 6,4 l d’eau distillée double par réaction. Pour TYLCV, la séquence d’amorce avant est de 5-GAAGCGACCACGATATAA-3 et la séquence d’amorce inversée est de 5-GGAACATCAGGGCTCGATA-3. Pour l’actine, la séquence d’amorce avant est de 5-TCTCACGCCATCTTTTTTTG-3 et la séquence d’amorce inversée est de 5-CGGTGATTTCCTCCTGCATT-3.
  5. Distribuer 18 l l de la maquette principale en flacons de tubes à bande qPCR ou une plaque de puits de 96. Ensuite, ajoutez 2 ll des échantillons d’ADN dans chaque flacon. Effectuez toutes les réactions avec au moins trois répliques techniques et trois répliques biologiques.
    REMARQUE : L’étape 4.5 doit être effectuée sur la glace.
  6. Fermez les tubes qPCR ou scellez les 96 plaques de puits avec un joint adhésif.
  7. Centrifugeuse pour recueillir le liquide au fond des tubes qPCR ou 96 plaques de puits.
  8. Placez les tubes ou la plaque dans le cycler thermique en temps réel et effectuez qPCR.
    1. Effectuer le qPCR en utilisant les paramètres de cycle suivants : 95 oC pour 30 s, suivi de 40 cycles de 95 oC pour 5 s et de 60 oC pour 34 s pour l’amorce et l’allongement, 1 cycle à 95 oC pour 15 s, se terminant par une courbe de fusion de 60 à 95 oC avec une augmentation de 0,5 oC pour 15 s.
    2. Choisissez SYBR comme colorant fluorophore et inconnu comme type d’échantillon.
  9. Exporter les données quantitatives vers un format de feuille de calcul et analyser la quantité relative d’ADN viral par la méthode 2'CT 28.

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Résultats

Les mouches blanches MEAM1 du complexe B. tabaci et de TYLCV ont été utilisées comme exemple ici pour décrire les procédures. L’aperçu des procédures d’immunofluorescence et de quantification virale décrites dans ce manuscrit est présenté à la figure 1. La figure 2 montre les résultats représentatifs de la détection de l’immunofluorescence des taches tyLCV et DAPI dans les PSG, les intestins intermédiaires et les ovaires, ce qui indique que le TYLCV s’e...

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Discussion

Ici nous décrivons un protocole pour la localisation et la quantification d’un bégomovirus dans les tissus de son vecteur de mouche blanche par immunofluorescence et qPCR. La dissection représente la première étape pour localiser et quantifier le virus dans les tissus de la mouche blanche. Le corps de la mouche blanche mesure environ 1 mm de longueur, ce qui signifie que les tissus sont extrêmement petits et qu’il est difficile de les disséquer. En outre, il existe des liens étroits entre les tissus. Par exemple, les ova...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program (numéro de subvention: 2017YFD0200600), le fonds affecté au Système de recherche agricole de la Chine (numéro de subvention : CARS-23-D07) et la Fondation Bill et Melinda Gates (Investment ID OPP1149777 ). Nous remercions le professeur Jian-Xiang Wu d’avoir fourni des anticorps TYLCV CP.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % ParaformaldéhydeMultiSciencesF0001
4',6-diamidino-2-phé ; nylindole (DAPI)Abcamab104139
Albumine sérique bovine (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Système de détection PCR en temps réelBio-RAD185-5201
Microscopie confocaleZeissLSM800
Dylight 549-chèvre anti-sourisEarthoxE032310-02Anticorps secondaire
Monoclonal anticorps (MAb 1C4)Anticorps primaire
Phosphate Tamponné Saline (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
StéréomicroscopeZeissStemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
ThermocycleurThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI sciences de la vie9002-93-1
Tween 20BBI sciences de la vie9005-64-5

Références

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Localisation du begomovirusDissection des tissus de l aleurodeProtocole d immunofluorescenceMicroscopie confocaleD tection du TYLCVFraction vasculaire stromaleCollecte de l h molympheGlandes salivaires primairesQuantification du virus

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