Localisation et quantification des bégomovirus dans les tissus de la mouche blanche par immunofluorescence et PCR quantitatif

Summary

Nous décrivons une méthode d’immunofluorescence et quantitative de PCR pour la localisation et la quantification des bégomovirus dans les tissus d’insecte. Le protocole d’immunofluorescence peut être utilisé pour colocaliser les protéines virales et vectorielles. Le protocole pcR quantitatif peut être étendu pour quantifier les virus dans des corps entiers de mouche blanche et des plantes infectées par le virus.

Abstract

Les begomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae)sont transmis par les mouches blanches du complexe Bemisia tabaci d’une manière persistante et circulative. Compte tenu des dommages considérables causés par les bégomovirus à la production agricole dans le monde entier, il est impératif de comprendre l’interaction entre les begomovirus et leur vecteur de mouche blanche. Pour ce faire, la localisation et la quantification du virus dans les tissus vectoriels sont cruciales. Ici, en utilisant le virus de boucle jaune de feuille de tomate (TYLCV) comme exemple, nous décrivons un protocole détaillé pour localiser des bégomovirus dans les midguts de mouche blanche, les glandes salivaires primaires, et les ovaires par immunofluorescence. La méthode est basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques contre une protéine de couche virale, des anticorps secondaires étiquetés colorants et un microscope confocal. Le protocole peut également être utilisé pour colocaliser les protéines bégomovirales et les protéines de la mouche blanche. Nous décrivons en outre un protocole pour la quantification de TYLCV dans les mouches blanches midguts, glandes salivaires primaires, hémolymphe, et ovaires par PCR quantitatif (qPCR). À l’aide d’amorces spécialement conçues pour TYLCV, les protocoles de quantification permettent de comparer la quantité de TYLCV dans différents tissus de la mouche blanche. Le protocole décrit est potentiellement utile pour la quantification des bégomovirus dans le corps d’une mouche blanche et d’une plante infectée par le virus. Ces protocoles peuvent être utilisés pour analyser la voie de circulation des bégomovirus dans la mouche blanche ou comme complément à d’autres méthodes pour étudier les interactions whitefly-begomovirus.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les bégomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae) ont causé de graves dommages à la production de nombreux légumes, fibres et cultures ornementales^dansle monde 1 . Les begomovirus sont transmis de manière persistante par la mouche blanche Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), qui est une espèce complexe contenant plus de 35 espèces cryptiques^2,3. Les begomovirus peuvent affecter directement ou indirectement la physiologie et le comportement des mouches blanches, tels que la fécondité⁴, la lo....

Protocol

1. Whitefly, Virus, Plantes, et l’acquisition du virus

1. Les mouches blanches arrière (MEAM1) sur coton (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) dans des cages à l’épreuve des insectes dans une serre à 26 '1 'C avec un cycle clair:10 de 14:10 et 60 - 10% d’humidité relative.
2. Effectuer PCR conventionnel basé sur la mouche blanche mitochondriale cytochrome oxidase I gène pour déterminer la pureté de la population de moucheblanche.
   1. Recueillir 20 mouches blanches adultes et les transférer individuellement dans un tube PCR contenant 30 l de tampon de lyse (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45 % [wt/vol] Tween-20, 0,2 % [wt/vol] gélatine, 0,45....

Results

Les mouches blanches MEAM1 du complexe B. tabaci et de TYLCV ont été utilisées comme exemple ici pour décrire les procédures. L’aperçu des procédures d’immunofluorescence et de quantification virale décrites dans ce manuscrit est présenté à la figure 1. La figure 2 montre les résultats représentatifs de la détection de l’immunofluorescence des taches tyLCV et DAPI dans les PSG, les intestins intermédiaires et les ovaires, ce qui indique que le TYLCV s’e.......

Discussion

Ici nous décrivons un protocole pour la localisation et la quantification d’un bégomovirus dans les tissus de son vecteur de mouche blanche par immunofluorescence et qPCR. La dissection représente la première étape pour localiser et quantifier le virus dans les tissus de la mouche blanche. Le corps de la mouche blanche mesure environ 1 mm de longueur, ce qui signifie que les tissus sont extrêmement petits et qu’il est difficile de les disséquer. En outre, il existe des liens étroits entre les tissus. Par exemple, les ova.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % Paraformaldéhyde	MultiSciences	F0001
4',6-diamidino-2-phé ; nylindole (DAPI)	Abcam	ab104139
Albumine sérique bovine (BSA)	MultiSciences	A3828
CFX Connect Système de détection PCR en temps réel	Bio-RAD	185-5201
Microscopie confocale	Zeiss	LSM800
Dylight 549-chèvre anti-souris	Earthox	E032310-02	Anticorps secondaire
Monoclonal anticorps (MAb 1C4)			Anticorps primaire
Phosphate Tamponné Saline (PBS)	Sangon Biotech	B548119-0500
Stéréomicroscope	Zeiss	Stemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)	TaKaRa	RR820A	qPCR master mix
Thermocycleur	Thermofisher	A41182
Tissuelyzer	Shaghai jingxin	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI sciences de la vie	9002-93-1
Tween 20	BBI sciences de la vie	9005-64-5