In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Résumé

Des endonucleases de restriction avec une nouvelle spécificité de séquence peuvent être développées à partir d’enzymes reconnaissant une séquence partiellement dégénérée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé que nous avons utilisé avec succès pour modifier la spécificité de la séquence de l’enzyme NlaIV. Les ingrédients clés du protocole sont la compartimentation in vitro de la réaction de transcription/traduction et la sélection de variantes avec de nouvelles spécificités séquences.

Résumé

L’ingénierie de spécificité de restriction d’endonuclease (REase) est extrêmement difficile. Ici, nous décrivons un protocole multistep qui aide à produire des variantes REase qui ont une spécificité plus stricte que l’enzyme parentale. Le protocole nécessite la création d’une bibliothèque de cassettes de sélection d’expressions (ESC) pour les variantes de la REase, idéalement avec une variabilité dans les positions susceptibles d’affecter la liaison de l’ADN. L’ESC est flanquée d’un côté par une séquence pour l’activité du site de restriction souhaitée et une étiquette de biotine et de l’autre par un site de restriction pour l’activité indésirable et un site d’amorce annealing. Les CES sont transcrits et traduits dans une émulsion d’eau dans l’huile, dans des conditions qui rendent peu probable la présence de plus d’une molécule d’ADN par gouttelette. Par conséquent, l’ADN de chaque molécule de cassette n’est soumis qu’à l’activité de l’enzyme traduite et codée. Les variantes REase de la spécificité souhaitée enlèvent l’étiquette de biotine mais pas le site d’amorce. Après avoir brisé l’émulsion, les molécules d’ADN sont soumises à un retrait de biotine, et seuls ceux dans le supernatant sont conservés. Cette étape assure que seuls les ESC pour les variantes qui n’ont pas perdu l’activité souhaitée sont conservés. Ces molécules d’ADN sont ensuite soumises à une première réaction de PCR. Le décolleté dans la séquence indésirable coupe le site de fixation d’apprêt pour l’une des amorces. Par conséquent, PCR amplifie uniquement les CSE des gouttelettes sans l’activité indésirable. Une deuxième réaction pcR est alors effectuée pour réintroduire le site de restriction pour la spécificité souhaitée et l’étiquette de biotine, afin que l’étape de sélection puisse être réitérée. Les cadres de lecture ouverts sélectionnés peuvent être surexprimés dans les cellules bactériennes qui expriment également la méthyltransferase cognate de la REase parentale, parce que le REase nouvellement évolué ne cible qu’un sous-ensemble des sites cibles de méthyltransferase.

Introduction

L’ingénierie de spécificité de séquence est extrêmement difficile pour les REases de classe II. Dans cette classe d’endonucleases, la reconnaissance de séquence et la catalyse sont étroitement liées, probablement comme une protection évolutive contre la création d’une endonuclease de spécificité plus large que sa méthyltransferase cognée, qui endommagerait l’ADN hôte. L’évolution dirigée de nouvelles spécificités dans les cellules est encore compliquée par la nécessité de protéger l’ADN hôte contre l’activité nouvellement conçue d’endonuclease. Par conséquent, il n’y a que quelques tentatives réussies de l’ingénierie REase signalé et tous exploitent les caractéristiques uniques d’une enzyme particulière^{1,2,3,4,5,6,7}.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’ingénierie de spécificité qui peut être utilisé pour générer des variantes d’endonuclease qui ont une spécificité plus étroite qu’une enzyme parentale qui est basée sur notre ingénierie réussie d’une endonuclease NlaIV⁸. Pour une telle enzyme avec une séquence de reconnaissance arbitraire, une spécificité supplémentaire peut être introduite pour les bases sur les flancs. Pour les enzymes parentales qui reconnaissent les séquences partiellement dégénérées (comme NlaIV avec sa cible GGNNCC), une spécificité supplémentaire peut également être introduite dans la séquence de reconnaissance. Comme la spécificité supplémentaire exigera probablement des contacts protéine-ADN, les bases nouvellement reconnues devraient se trouver dans l’empreinte de l’endonuclease parentale sur l’ADN. En principe, des schémas de sélection peuvent être mis en place pour toute spécialisation souhaitée de la séquence de reconnaissance. Cependant, la plupart des REases qui reconnaissent les séquences de cibles palindromic et presque palindromic sont des dimers fonctionnels qui ne reconnaissent qu’un demi-site du palindrome. Par conséquent, il est peu probable que la sélection de nouvelles spécificités qui violent la symétrie des interactions nucléiques protéiques fonctionne. Pour le NlaIV dimerique, par exemple, la séquence GGNNCC peut théoriquement être réduite au CCGCC, mais il devrait être plus difficile de réduire la spécificité jusqu’au CCGACC. Notre régime implique une sélection à la fois positive et négative.

Le processus est plus efficace lorsque la sélection négative est également utilisée pour supprimer les spécificités capables de fendre toutes les séquences autres que la spécificité plus étroite préférée. Par exemple, la sélection du CCGCG pourrait être combinée avec l’antisélection contre le GGBVCC (où B est une base autre que A, et V est toute base autre que T). Lorsque certaines des séquences cibles possibles ne sont pas couvertes, le résultat de l’expérience de sélection dépend de l’efficacité de la sélection positive et négative. Dans notre travail NlaIV, nous avons choisi pour le GGATCC, et contre GGSSCC (où S est G ou C), et obtenu une spécificité qui, ignorant les cibles de rupture de symétrie, pourrait être décrit comme GGWWCC (où W est A ou T), suggérant que dans ce cas particulier, la sélection négative était plus une sélection importante que positive.

Notre approche commence par la création d’une cassette de sélection d’expressions (ESC). Le CES est structuré en sections. Sur la section centrale intérieure, il existe des variantes du cadre de lecture ouverte (ORF) de la REase, sous le contrôle du promoteur T7. Cette section centrale de l’ESC ne peut contenir aucun site cognate pour le REase conçu. Le noyau est pris en sandwich entre deux sites cognate pour le type sauvage REase : un site de clivage pour l’activité indésirable (séquence sélectionnée en contre, GGSSCC dans cet exemple) et un site de clivage pour l’activité désirée (séquence sélectionnée, GGATCC dans l’exemple). La dernière étape de la préparation de l’ESC en PCR ajoute de la biotine proche de l’activité désirée à l’extrémité 5' et crée une variété de séquences de compteur sélectionnés (GGSSCC dans l’exemple). La stratégie de sélection repose sur l’utilisation d’amorçistes soigneusement conçus au protocole de réaplification de l’ESC après un protocole in vitro de transcription/traduction/sélection(figure 1A). La bibliothèque ESC est exprimée dans une traduction de transcription in vitro compartimentée émulsion d’eau dans l’huile^9,10,11. Dans chaque gouttelette, la spécificité de l’enzyme exprimée affecte l’état de l’ESC(figure 1B, étape I). Pour l’arrangement décrit, l’activité de clivage souhaitée de la protéine traduite élimine l’étiquette de biotine de l’ADN, mais n’affecte pas l’autre extrémité ESC avec la séquence sélectionnée par compteur. Lorsque l’émulsion est cassée, les fragments biotinylés sont enlevés par le retrait de l’affinité de streptavidine, de sorte que seuls les fragments des gouttelettes avec l’activité désirée restent(figure 1B, étape II). Cette étape supprime les variantes inactives REase. La fraction supernatante de l’étape de traction est ensuite amplifiée par PCR. Dans les premières amorces de réaction PCR F2 et R1 sont utilisés (Figure 1A,B, étape III). Primer F2 se lie à la section ESC entre la séquence sélectionnée par compteur et l’extrémité de la molécule. Par conséquent, les ESC exprimant des variantes capables de clélire la séquence sélectionnée par compteur (et, par conséquent, de séparer les sites de liaison pour les amorces F2 et R1 en deux molécules d’ADN différentes) ne sont pas amplifiées et sont donc retirées de la bibliothèque. L’amorce R1 se lie entre le site sélectionné et le cœur de l’ESC afin qu’il ne soit pas affecté par l’état de clivage du site sélectionné et restaure le site de clivage pour l’activité désirée (GGATCC). Le cycle est fermé par un deuxième PCR (avec amorce F1 et R2) qui ajoute de la biotine à l’extrémité 5' près du site sélectionné et restaure la variation conçue au comptoir choisi site près de l’extrémité opposée de l’ESC(figure 1B, étape IV). Le mélange d’ADN qui en résulte est prêt pour une autre ronde de sélection.

Le succès du protocole de sélection dépend fortement du choix approprié de la nouvelle séquence de reconnaissance cible plus rigoureuse et de la conception minutieuse de la stratégie mutagène et de sa mise en œuvre efficace. Parce qu’il est beaucoup plus facile d’améliorer les légères préférences préexistantes de la REase que de les surmonter, nous vous recommandons de commencer par une étude cinétique de toutes les préférences préexistantes. La nécessité d’une conception mutagénieuse soigneuse résulte de la taille limitée d’une bibliothèque mutante qui peut être traitée par le protocole présenté (10⁹ clones dans une seule expérience). Par conséquent, les 20 substitutions possibles d’acide aminé peuvent être testées efficacement en quelques positions (voir Discussion). La mutanèse aléatoire, telle que le PCR (EP-PCR) sujet aux erreurs présenté comme une méthode alternative, entraînera un sous-échantillon profond de la complexité existante. Si des informations concernant les positions potentielles d’acide aminé impliquées dans des contacts avec l’ADN (ou même situées à proximité des nucléotides dégénérés dans une séquence cognate) sont disponibles, il devrait certainement être utilisé pour sélectionner quelques acides aminés pour la mutageèse guidée de saturation oligonucléotide (étapes de protocole 1.6-3.10).

Protocole

1. Préparation des CSE

1. Clone méthyltransferase du système de restriction-modification à concevoir dans un plasmid à faible copie (pACYC184 ou pACYC174 ou leurs dérivés).
   REMARQUE: La souche d’hôte bactérienne doit être capable de tolérer la méthylation introduite par l’enzyme clonée et de fournir l’expression inductible de la polymérase d’ARN T7. L’utilisation de la souche ER2566 (portant des mutations McrA, McrBC et Mrr) est recommandée.
2. Confirmez que l’ADN plasmide recombinant est protégé contre le clivage par l’endonucléase cognate en traitant 0,5 g d’ADN plasmide avec 10 unités de REase cogné dans le tampon et la température recommandées par le fournisseur d’enzymes pendant 2 h.
3. Préparer les cellules compétentes de cette souche.
   REMARQUE: N’importe quelle méthode peut être utilisée. Le projet d’ingénierie NlaIV a utilisé une simple méthode de chlorure de calcium¹².
4. Construisez un plasmide recombinant avec l’ORF pour la REase sous contrôle du promoteur T7 d’un groupe d’exclusion différent et avec un marqueur de sélection différent de celui contenant le gène de la méthyltrasferase à l’étape 1.1. Les vecteurs pET28 et pET30 peuvent être utilisés.
5. Retirez tous les sites de reconnaissance de l’enzyme conçue de la section du plasmide recombinant entre le promoteur T7 et le codon d’arrêt de l’enzyme ORF en introduisant des mutations silencieuses(figure 2, tableau 1A).
   REMARQUE : Si plus d’un de ces sites doit être enlevé, plusieurs cycles de mutation seront nécessaires (étapes 1.5.1-1.5.7).
   1. Utilisez une réaction PCR à l’intérieur qui amplifie le plasmide pleine longueur avec des variations conçues introduites aux 5' extrémités des amorces (tableau 2A).
   2. Retirez l’ADN du modèle en ajoutant 10 U d’endonuclease de DpnI aux 50 L de la réaction de PCR, et incuber pendant 2 h à 37 oC.
   3. Résoudre les produits par électrophoresis gel agarose. Découpez la bande correspondant au plasmide intégral et purifiez-le avec un kit commercial.
   4. Ajouter 10x tampon de ligature (à une concentration de 1x) et compléter avec ATP (à 1 mM). Ajouter 10 U de T4 polynucléotide kinase et incubate pendant 20 min à 37 oC. Inactiver l’enzyme en chauffant à 70 oC pendant 10 min.
   5. Ajouter PEG 4000 à 5%, supplément à nouveau avec ATP (à 1 mM), et ajouter 5 U de T4 ADN ligase. Incuber pendant 2 h à température ambiante (RT).
   6. Transformez-vous en une souche bactérienne compétente portant la méthyltransferase cognate (étape 1.1).
   7. Isoler l’ADN plasmide à petite échelle et confirmer l’introduction des changements de séquence par le séquençage dideoxy.
6. Introduire des sites de restriction uniques à proximité de la séquence (s) ciblés par la mutagèse guidée par l’oligonucleotide(figure 2, tableau 1B). Suivez les étapes 1.5.1-1.5.7 pour chaque site.
   REMARQUE: Cette étape n’est effectuée que lorsqu’une mutanèse ciblée est utilisée. Si vous faites de la mutagèse aléatoire, sautez les étapes 2-3 et passez à l’article 3 à la place. Dans l’exemple présenté, tous les sites ont été introduits en amont des régions ciblées, mais ils peuvent également être introduits en aval.
7. Amorce de conception pour l’amplification de l’ESC (tableau 1C).
   1. Concevoir une introduction inversée liant en aval de l’ORF endonuclease qui présentera le site de reconnaissance sélectionné (R1) et sa version plus courte (R2) qui se lie en dehors de la séquence NlaIV sélectionnée et contient de la biotine à l’extrémité 5' (voir la figure 1).
   2. Concevoir une introduction vers l’avant (F1) liant à l’ESC en amont du promoteur T7. Cette amorce devrait également introduire des variantes de contre-sélections de la séquence de reconnaissance originale (c.-à-d. le maximum de variations de séquences reconnues par l’enzyme originale à l’exception de la séquence inverse sélectionnée).
      REMARQUE: Une version plus courte de cette amorce (F2) qui couvre la séquence distale à la séquence de compteurs seront utilisées plus tard dans le PCR sélectif (étape 5.9).

2. Synthèse split-and-mix of Mutagenic Primers

REMARQUE: Cette étape n’est utilisée que pour les projets qui nécessitent une mutagénie de subsaturation sur plus d’un site. Un synthétiseur avec plusieurs colonnes de synthèse est nécessaire. Attribuez des colonnes pour la synthèse des triplets de codon NNS randomisés et des triplets de codon de type sauvage selon les fréquences mutanèses. Par exemple, si sept colonnes de synthèse de volume égal sont disponibles, et qu’un taux de mutagèse de 0,3 est souhaitable à un site donné, ajoutez des codons NNS randomisés dans 0,3 x 7 ou deux colonnes, et des codons de type sauvage dans 0,7 x 7 ou cinq colonnes(figure 3).

1. Décidez des sites de subsaturation mutagenesis. Choisissez les fréquences mutanèses en fonction de l’importance hypothétique des sites (c’est-à-dire, plus le site est important, plus la fréquence est élevée), en gardant à l’esprit les limites de la complexité globale de la bibliothèque (voir Discussion).
2. Synthèse des oligonucléotides dans toutes les colonnes, jusqu’au triplet immédiatement précédant le deuxième site de mutagènes de subsaturation comptant à partir du 3'-end. N’enlevez pas le groupe protecteur 5'trityl lors du dernier cycle de synthèse (utilisez l’option de trityl-on sur le synthétiseur). Le groupe de protection sera supprimé au début du prochain cycle de synthèse (étape 1 de la figure 3).
3. Ouvrez les colonnes de synthèse. Recueillir le support de synthèse en verre de pore contrôlé (CPG) dans un tube sec de 1,5 mL et mélanger par vortexing. Repartition la résine mixte CPG dans de nouvelles colonnes de synthèse. Évitez d’introduire l’humidité, car elle diminuera le rendement global (étapes 2 et 4 dans la figure 3).
4. Continuer la synthèse, à partir du triplet du site de mutagèse de subsaturation. Attribuez des colonnes à des triplets NNS randomisés ou à des triplés de type sauvage selon la fréquence de mutagenesèse souhaitée (voir note ci-dessus). Si d’autres sites de subsaturation sont présents, ne procéder qu’au triplet précédant le prochain site de mutanèse de subsaturation. Encore une fois, laissez un groupe de 5'-trityl à la fin (5'-trityl-on option sur le synthétiseur) (étape 3 dans la figure 3). Ensuite, continuez avec l’étape 2.3.
5. Si plus aucun site de subsaturation n’est présent en aval, terminez la synthèse, laissant un groupe de 5'-trityl à la fin (option 5'-trityl-on sur le synthétiseur) (étape 5 dans la figure 3).
6. Déprotectez et purifiez la bibliothèque d’oligonucléotide selon les instructions du fabricant de cartouches de purification.
   REMARQUE: Les oligonucleotides libérés par la déprotection du CPG peuvent également être purifiés dans la phase inverse de haute performance chromatographie liquide (HPLC) avec trityl-on suivi d’un retrait manuel de groupe de trityl (1 h traitement avec 80% d’acide acétique à RT) et une deuxième purification HPLC.
7. Vérifiez la qualité de la bibliothèque d’oligonucléotide dans un gel urea-PAGE.

3. Générer des bibliothèques de variantes

REMARQUE: Utilisez le plasmide recombinant de l’étape 1.6.

1. Générer les bibliothèques par l’oligonucleotide dirigé mutagèse.
   REMARQUE : Par ailleurs, utilisez le protocole EP-PCR (étape 3.2).
   1. Amplifier une section du promoteur T7 au site unique d’enzymes de restriction flanquant la séquence ciblée avec mutagenesis (en cas de NlaIV : SalI, EcoRI, ou Eco52I) (Tableau 1B-C, Tableau 2B, Figure 4). Amplifier la deuxième partie du site unique d’enzymes de restriction à l’extrémité 3' de l’ESC.
   2. Mélanger séparément 5 l des réactions PCR (de l’étape 3.1.1) avec 8 L d’eau, 1,5 l de tampon d’enzyme de restriction de 10x, et 5 unités des enzymes de restriction appropriées (SalI, EcoRI, ou Eco52I) et incuber à la température appropriée pendant 2 h.
   3. Résoudre les produits des deux réactions à l’aide d’électrophoresis gel agarose. Découpez les bandes de taille attendues et purifiez-les avec un kit commercial.
   4. Exécuter jusqu’à 1/3 des produits purifiés dans un gel d’agarose et mesurer la concentration de chaque bande purifiée par densitométrie.
   5. Mettre en place la ligature de deux parties des ESC dans un rapport de 1:1 molaire avec 1x tampon ligase et 1 U de T4 ADN ligase et incubate pour 2 h à RT.
   6. Résoudre les produits de réaction dans le gel agarose. Découpez les produits de taille attendus et purifiez-le avec un kit commercial.
   7. Amplifier les produits de ligation purifiés dans une réaction PCR avec les amorces F1 et R2 (tableau 1C et tableau 2A). Ne pas exécuter plus de 20 cycles d’amplification.
   8. Fractionner les réactions PCR dans un gel d’agarose. Découpez les produits et purifiez-le avec un kit commercial.
   9. Exécuter un aliquot de 5 L de la bibliothèque purifiée de l’étape précédente dans le gel d’agarose et mesurer la concentration par densitométrie.
   10. Clonez un petit échantillon de la bibliothèque (jusqu’à 5 lL) et séquencez les clones de gt;15 pour vérifier la fréquence et la distribution des mutations(tableau 3). Procédez à l’étape 4.
       REMARQUE: Alternativement, le séquençage à haut débit du petit échantillon des ESC peut être utilisé.
2. Effectuer EP-PCR.
   1. Amplifier le ESC du plasmide obtenu à l’étape 1.5.7 avec les amorces F1 et R1. Exécuter 20 cycles avec Taq I polymérase (tableau 1B).
   2. Gel purifie le produit PCR.
   3. Configurez EP-PCR avec 2 ng de produit PCR purifié de l’étape précédente et exécutez 15 cycles d’EP-PCR(tableau 1C) avec des amorces F1 et R1.
   4. Gel purifiez le produit et le quantifier par densitométrie de gel.
      REMARQUE: En raison de la faible concentration du produit EP-PCR purifié, utilisez environ 1/3 pour la quantification.
   5. Cloner un petit échantillon de la bibliothèque (jusqu’à 1/5) et séquencez les clones pour vérifier la fréquence et la distribution des mutations(tableau 4).
      REMARQUE: Alternativement, effectuer le séquençage à haut débit du petit échantillon des ESC.

4. Effectuer une réaction de traduction in vitro compartimentée de transcription in vitro

1. Testez l’expression endonuclease et l’activité enzymatique dans la transcription in vitro-traduction.
   1. Préparer un substrat court (200-500 bp) avec un seul site de reconnaissance pour l’endonuclease situé près du centre de la molécule afin que la réaction de clivage puisse être facilement détectée.
      REMARQUE: La façon la plus simple de préparer le substrat est par l’amplification PCR d’un fragment approprié de toute molécule d’ADN. Le substrat peut être radiolabeled ou étiqueté fluorescent pour simplifier la détection de clivage.
   2. Configurez 50 L d’une réaction de transcription-traduction avec 0,5 g d’ESC de type sauvage selon les recommandations du fabricant. Ajouter le sel de magnésium (MgCl₂, MgSO₄, et l’acétate de magnésium peut être testé) à 1,5 mM et la quantité appropriée de substrat de l’étape précédente (au moins 0,5 g en cas d’ADN non étiqueté).
      REMARQUE: Tout kit de transcription/traduction qui ne contient pas de nucléase activée par le magnésium peut être utilisé. Certains fournisseurs de trousses utilisent des nucléases pour éliminer la contamination de l’ADN pendant la production, puis ajouter des chélatateurs comme inhibiteurs de la nucléase. Ces kits ne sont pas compatibles avec cette méthode.
   3. Incuber la réaction de transcription-traduction selon les instructions du fabricant. Ensuite, transférer le mélange de réaction à la température optimale pour l’enzyme de restriction pour 2 h.
   4. Analyser le clivage du substrat dans un gel d’agarose suivi d’une détection appropriée (p. ex., coloration de l’ADN, visualisation de fluorescence ou autoradiographie) (figure 5).
      REMARQUE: Au moins un clivage partiel du substrat est nécessaire avant de procéder à la compartimentation. Si cela n’est pas réalisé, une optimisation plus poussée de la forme chimique de magnésium ou de sa concentration est nécessaire.
2. Préparer un mélange de surfactants à l’huile en ajoutant 225 ll de l’envergure 80 et 25 'L de Tween 80 à 5 mL d’huile minérale dans un tube conique de 15 mL. Mélanger soigneusement en inversant doucement le tube 15x.
3. Pour chaque bibliothèque, transférer 950 L du mélange de surfactants à l’huile dans un flacon cryogénique rond de fond de 2 ml, l’étiquette avec un nom de bibliothèque et le transfert sur la glace. Mettre une petite barre cylindrique en remuant (5 x 2 mm²⁾dans chaque flacon.
4. Préparer un mélange in vitro de réaction de transcription-traduction (50 ll pour chaque bibliothèque) selon les suggestions du fabricant. Complétez le mélange de chlorure de magnésium à une concentration finale de 1,5 mM (voir étape 4.1.4).
5. Distribuer 50 aliquots de L en tubes de 1,5 mL sur glace.
6. Ajouter 1,7 fmole de la bibliothèque (de la section 3) au mélange de réaction sur la glace.
   REMARQUE: N’utilisez pas une plus grande quantité de bibliothèque d’expression pour l’efficacité de sélection. Il est crucial de minimiser la fréquence des gouttelettes aqueuses contenant plus d’une molécule d’ADN.
7. Préparer l’émulsion d’eau dans l’huile consécutivement pour chaque bibliothèque.
   1. Mettre un petit bécher (ou grosse tasse à bouteille) rempli de glace sur un agitateur magnétique avec la vitesse de remuation fixée à 1 150 tr/min.
   2. Transférer une fiole cryogénique avec 950 l de mélange de surfactants à l’huile et une petite barre en remuant de l’étape 4.3 à un bécher glacé sur l’agitateur magnétique. Vérifiez que la barre en remuant tourne.
   3. Ajouter cinq aliquots de 10 l du mélange bibliothèque-transcription-traduction in vitro sur une période de 2 minutes dans les intervalles de 30 s et continuer à remuer pendant une minute supplémentaire. Transférer la fiole avec l’émulsion dans un récipient de glace. Procédez à la prochaine bibliothèque en commençant par l’étape 4.7.2.
   4. Après que toutes les bibliothèques sont traitées commencent l’incubation de toutes les bibliothèques selon les recommandations du fabricant de kit.
8. Transférer les flacons à la température optimale pour l’endonucléase conçu pour un supplément de 2 h, puis les mettre sur la glace pendant au moins 10 minutes.

5. Poursuite du traitement des bibliothèques et de la sélection

1. Transférer les émulsions des flacons cryogéniques dans des tubes froids de 1,5 ml, ajouter 1 lL de 0,5 M EDTA et les centrifugeuse à 13 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
2. Retirer la phase supérieure de l’huile à l’égard d’une pipette. Si un interphase huile-eau n’est pas visible, incuber le tube pendant au moins 5 minutes à -20 oC pour geler la phase aqueuse, puis immédiatement pipet la phase d’huile liquide.
3. Ajoutez 100 L de 10 mM Tris HCl pH 8.0 et effectuez immédiatement l’extraction avec 150 L de phénol:chloroforme (1:1 v/v) par vortexing court suivi de la séparation de phase par 30 s centrifugation à 13.000 x g. Recueillir la phase aqueuse supérieure.
4. Précipiter l’ADN en ajoutant 0,1 vol (15 l) d’acétate de sodium de 3 M (pH à 5,2), 2,5 à 5 g de glycogène et 2,5 vol (375 ll) d’éthanol. Incuber à -20 oC pour 1 h et centrifugeuse pendant 15 min à 13 000 x g,4 oC. Jeter le supernatant et laver brièvement la granule avec 1 ml d’éthanol froid de 70 %.
5. Séchez l’ADN/granule de glycogène dans un speedvac ou un air sec pendant 5 min.
6. Dissoudre la granule dans 50 ll de 10 mM Tris-HCl (pH - 7,5). Ajouter 5 L de perles magnétiques streptavidin préparées selon les instructions du fabricant et mélanger pendant 1 h à RT, de préférence dans un mélangeur de carrousel ou par vortexing doux.
7. Séparez les perles sur un support magnétique et collectez le liquide enrichi en ADN sans biotine.
8. Concentrer l’ADN par précipitation d’éthanol (étapes 5.4-5.5).
9. Dissoudre l’ADN concentré de l’étape précédente dans 5 'L d’eau et utiliser comme modèle dans une réaction de PCR avec les amorces F2 et R1 (tableau 1A).
   REMARQUE: Pour éviter les problèmes de contamination des modèles et minimiser les artefacts PCR, utilisez la polymérase Taq (pas Pfu ou Phusion) et exécutez 18 à 20 cycles avec le délai d’extension proportionnel à la taille du modèle (1 kb et 1 min) (voir le tableau 2B).
10. Fractionner le produit PCR dans un gel d’agarose et découper le produit de taille prévu. Certains frottis indiquent qu’il existe des produits de différentes tailles (voir la figure 6). Purifiez l’ADN de la dalle de gel avec un kit commercial.
11. Exécutez une deuxième réaction PCR avec jusqu’à 50 ng d’ADN de l’étape 5.10 et les amorces F1 et R2 en utilisant le même protocole que dans l’étape 5.9. Procédez avec la purification du produit comme décrit dans 5.10. L’ADN purifié après quantification par densitométrie de gel d’agarose (pas la spectroscopie UV) peut être employé dans la prochaine ronde de sélection in vitro (étape 4.6).

6. Variantes d’écran pour la spécificité de séquence modifiée

1. Clone variantes sélectionnées.
   1. Digérer le produit de l’étape 5.10 pour 2 h avec 10 U d’enzymes de restriction appropriées pour le clonage de l’ORF dans le vecteur d’expression (pour NlaIV: NcoI et XhoI) dans la température et la mémoire tampon recommandée par le fournisseur d’enzymes. Résoudre les produits avec l’électrophoresis gel agarose et isoler le fragment de taille prévu.
   2. Préparer le vecteur plasmide (pET28) par double clivage avec les mêmes enzymes qu’à l’étape 6.1.1 et gel purifier le produit avec un kit commercial de purification de gel d’ADN.
   3. Estimer les concentrations de vecteur et d’insertion par densitométrie avec l’électrophoresis gel agarose.
   4. Configurez une ligature avec 1-5 U de ligase d’ADN T4 et vecteur : insérer le rapport molaire 1:3-1:5 dans le tampon de ligase 1x recommandé par le fournisseur d’enzymes. Incuber pendant 2 h à RT et introduire dans les bactéries hôtes appropriées (à partir de l’étape 1.3) par la transformation ou l’électroporation¹².
   5. Sélectionnez des extransformants sur les plaques LB contenant l’antibiotique approprié (50 g/mL de kanamycine pour les vecteurs pET28 ou pET30) et 1 % de glucose.
2. Variantes de protéines express.
   1. Inoculer des colonies simples de la transformation (jusqu’à 24 clones peuvent être facilement traités en une seule course) en 2 ml de LB avec la kanamycine (50 g/mL) et 1% de glucose et se développer pendant la nuit à 37 oC avec secousses.
   2. Inoculer 15 ml de LB chaud (37 oC) contenant 100 g de kanamycine et pas de glucose avec 0,75 ml de culture de nuit et incuber à 37 oC avec des secousses vigoureuses.
      REMARQUE: Soit des tubes de centrifugeuse de 50 ml ou des flacons Erlenmayer de 100 ml peuvent être utilisés.
   3. Ajouter 176 L de glycérol à 1 ml de culture de nuit (concentration finale de glycérol et 15 %) bien mélanger et congeler à -70 oC.
   4. Après 2 à 3 h, supplément 15 ml de la culture (de l’étape 6.2.1) avec IPTG à 1 mM et la culture pour un supplément de 5 h.
   5. Recueillir la granule bactérienne par centrifugation (10 000 x g,4 oC, 10 min) et congeler à -70 oC.
3. Purifier les variantes protéiques.
   1. Transférer 20 l de suspension de résine d’affinité de nickel dans un tampon B1 de 200 lL dans un tube de 1,5 mL avec une pointe large de pipette, mélanger doucement et centrifugeuse (5 000 x g,30 s, 4 oC). Retirer le supernatant par tuyauterie et laisser le tube sur la glace.
   2. Réutilisez le granule bactérien de l’étape 6.2.5 dans 300 'L de B1 par vortexing vigoureux. Transférer la suspension dans un tube de 1,5 mL.
   3. Ajouter 3 L de cocktail inhibiteur de protéase 100x et solution lysosome dans B1 (concentration finale de 1 mg/mL). Désintégrer les cellules par sonication avec une sonde équipée d’une pointe. Utilisez six rafales de 10 s par échantillon avec le temps de refroidissement de pointe de 15 s dans la glace entre les deux. Gardez les suspensions cellulaires sur la glace tout le temps.
   4. Pellet débris cellulaires par centrifugation (2 min, 12.000 x g, 4 'C) et transférer 250 L de supernatant à la résine aliquot de l’étape 6.3.1.
   5. Mélanger pendant 15 minutes dans une chambre froide, de préférence dans un mélangeur de carrousel ou en vortexing doux.
   6. Centrifugeuse (5 000 x g,30 s, 4 oC) et aspirez le supernatant à une pipette.
   7. Ajouter 500 L de tampon W et réutilisez délicatement la résine. Centrifugeuse (5 000 x g,30 s, 4 oC) et aspirez le supernatant à une pipette.
   8. Répéter l’étape 6.3.7.
   9. Ajouter 20 L de tampon E, réutiliser délicatement la résine et laisser l’échantillon sur la glace pendant 2 à 5 min. Centrifuge (5 000 x g,30 s, 4 oC) et recueillir le supernatant.
   10. Répéter l’étape 6.3.9. Supernatants de piscine.
   11. Analyser les échantillons de protéines par SDS-PAGE (5 à 10 ll)(figure 7).
4. Écran pour les variantes avec la spécificité altérée.
   1. Activité de clivage d’essai sur l’ADN de lambda bactériophage. L’échantillon de protéines peut représenter jusqu’à 10 % du volume de réaction final. Un total de 2 L d’échantillon de protéines par 0,5 g d’ADN et 2 h de temps de réaction est un bon point de départ.
   2. Analyser les produits de réaction par électrophoresis gel agarose avec les produits générés par l’enzyme de type sauvage. Sélectionnez les clones générant des modèles de clivage clairement distinguables de celui généré par l’enzyme de type sauvage pour une analyse plus approfondie (figure 8).

Résultats

Ce protocole est juste un outil pour augmenter la fréquence des variantes désirées d’un REase conçu en appauvrissant (mais n’éliminant pas) deux classes indésirables: enzymes inactives et endonucleases avec une spécificité de séquence de type sauvage inchangée. D’autre part, parce que changer la spécificité de REase est extrêmement difficile, trouver même une telle variante produisant un modèle de clivage qui est différent de l’enzyme de type sauvage dans un seul criblage de 24 clones devrait être considéré comme un succès. Dans nos mains, les meilleurs écrans pouvaient identifier jusqu’à 20% des variantes prometteuses(figure 8A).

Le résultat positif dépend fortement de la qualité d’une bibliothèque (c.-à-d. une fréquence limitée des substitutions et de leur distribution aléatoire) et de la capture efficace de la population biotinyée des membres de la bibliothèque (étapes 3.6-3.7). Les deux problèmes peuvent être détectés. La qualité de la bibliothèque doit être vérifiée avant la sélection en séquençant autant de clones que possible (-gt;15) ou par séquençage direct de la bibliothèque par séquençage à haut débit (étape 3.10, tableau 3). Si la majorité des clones sélectionnés ne sont pas actifs, il s’agit d’une indication claire de l’échec de la sélection de capture de streptavidin. Un effet similaire est observé dans le cas des bibliothèques qui subissent de nombreux cycles de sélection, parce que ces bibliothèques sont très probablement dominées par des variantes inactives qui ont échappé à l’étape de sélection de capture de streptavidin(figure 8B). Par conséquent, il est conseillé d’exécuter le dépistage après chaque cycle de sélection et de développer davantage des variantes prometteuses sélectionnées manuellement plutôt que de dépendre de l’itération de sélection.

Figure 1 : Sélection in vitro d’une nouvelle spécificité séquence basée sur l’ingénierie NlaIV. (A) L’organisation de la cassette expression/sélection (ESC) comprend deux sites de reconnaissance pour REase, 1) la séquence sélectionnée (GGATCC) près de l’extrémité droite et 2) la séquence sélectionnée en compteur (GGSSCC) près de l’extrémité gauche, ainsi que le promoteur T7p et T7t-T7 et le terminateur T7. Les sites de fixation d’apprêt sont indiqués ci-dessous. Le clivage par type sauvage et les variantes NlaIV sélectionnées sont montrés comme triangles rouges et verts respectivement. (B) Étapes du cycle de sélection : I) Émulsification des mélanges de réaction de transcription-traduction-clivage avec la bibliothèque DE l’ESC ; II) Tout l’ADN biotinylé est capturé sur des particules magnétiques enduites de streptavidine et enlevées, éliminant ainsi l’encodage des variantes inactives; III) Les ESC codant des REases avec une activité de type sauvage (c.-à-d. ceux capables de fendre la séquence GGSSCC) sont éliminés parce que le clivage de la séquence sépare les sites de liaison pour les amorces avant et inversées. Par conséquent, aucune amplification de ces ESC ne se produit; IV) L’entrée pour le prochain tour de sélection est créée par l’ajout de biotine à l’extrémité droite et la réintroduction de la variation du compteur sélectionné séquences sur l’extrémité gauche. Réimprimé à partir de Czapinska et coll.⁸ avec la permission d’Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Préparation de l’ESC. Fragment dérivé de la construction originale dans un vecteur d’expression contenant NlaIV ORF sous le contrôle du promoteur T7 a été modifié pour être adapté à l’expression / sélection. Le site NlaIV en aval du NlaIV ORF a été supprimé et des sites uniques (SalI, EcoRI et Eco52I) qui ont été utilisés pour mutagiser des positions sélectionnées ont été introduits dans le NlaIV ORF comme mutations silencieuses. La construction finale a été amplifiée avec des amorces flanquantes qui ont introduit deux sites NlaIV flanquants : la séquence sélectionnée contre (GGSSCC) sur la suite gauche et sélectionnée (GGATCC) sur la droite. L’amorce inverse a également introduit la biotine. Les amorces utilisées dans la création d’ECS mutés sont représentées sous forme de flèches bleues et étiquetées ci-dessous (voir tableau 1B,C). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Schéma de synthèse de fractionnement et de mélange. L’exemple fait référence à la synthèse de l’amorce MutB où une séquence NNS a été introduite à 0,8 fréquence à quatre positions (voir aussi tableau 3). Notez que la synthèse chimique est réalisée de 3' à 5' mais toutes les séquences sont montrées dans l’orientation canonique 5'-3' (c’est-à-dire qu’elle passe de droite à gauche dans ce schéma). Les séquences de type sauvage aux positions mutagisées sont affichées en vert tandis que les séquences mutagènes NNS sont en rouge. Le site de reconnaissance SalI qui est ensuite utilisé pour introduire des mutations dans les CSE est souligné. Les points de mélange et de fractionnement des étapes (2 et 4) sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Utilisation de sites uniques d’enzymes de restriction dans la mutagèse ciblée d’oligonucleotide. La stratégie d’introduction de mutation est illustrée sur un exemple de construction des bibliothèques A-C (voir étapes 3.1-3.7). Réimprimé à partir de Czapinska et coll.⁸ avec la permission d’Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Clivage endonucleolytique dans la transcription in vitro-traduction. (A) Clivage d’un substrat d’essai dans un tampon optimal REase : 1) Substrat, produit PCR de 612 bp avec un seul site de reconnaissance NlaIV; 2) Produits de clivage, 355 bp et 257 bp. (B) Clivage dans une réaction in vitro de transcription-traduction (contenant 0,5 g d’ESC) : 1 à 2) 15 aliquots de traduction in vitro de transcription sans substrat (ligne 2 : réaction complétée par 1,5 mM Mg_2); 3 à 4) 15 aliquots de transcription in vitro-traduction avec 1 g de substrat d’essai; (ligne 4 : réaction complétée par 1,5 mM MgCl₂). Marqueur de taille S-ADN (pBR322 digéré avec MspI). Les échantillons ont été résolus dans 6% de PAGE indigène. L’ADN était taché de bromure d’éthidium. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Produits du premier PCR du cycle de sélection. Voir la figure 1B, étape III; l’étape du protocole 5.10. Les ensembles de colonnes 1 et 2 sont des aliquots de deux bibliothèques différentes chargées en triplicate. Norme de taille de l’ADN S (ADN lambda digéré avec HindIII et EcoRI). Flèche indique la position de l’ESC pleine longueur (1 050 bp). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Variantes NlaIV purifiées pour un dépistage plus approfondi en mini-échelle. Voir l’étape 6.3.11. Chaque ligne contient un aliquot de 10 L d’une variante différente. Norme de poids moléculaire S-protéine. La masse moléculaire du sous-unité naIV REase est de 29,9 kDa. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Exemples de dépistage des variantes NlaIV pour l’altération de la spécificité de la séquence. Voir l’étape 6.4.2. (A) Dépistage réussi avec une fréquence élevée de variantes prometteuses. S - marqueur de taille d’ADN, ADN lambda clidé avec HindIII et EcoRI; type sauvage (wt) - ADN lambda clidé avec le type sauvage NlaIV; - substrat d’ADN lambda, pas fendu; d’autres colonnes-variantes avec une activité très faible. Les variantes sont étiquetées ! - variantes prometteuses qui produisent un motif de clivage distinct de l’enzyme de type sauvage; ? - variantes qui pourraient également avoir modifié la préférence de séquence. (B) Dépistage infructueux, avec une majorité de variantes inactives et une variante avec le modèle apparemment inchangé de clivage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9 : Sélection alternative par ligature. Cette alternative peut être utilisée pour tous les REases générant des extrémités collantes. Ici, nous présentons un protocole d’exemple pour un schéma de sélection pour l’enzyme MwoI (non publié). I) Séquence sélectionnée (située à l’extrémité droite de l’ESC) avec des résidus définis indiqués en rouge et une variation sélectionnée de la séquence cognate montrée en bleu. Entre parenthèses, la séquence sélectionnée pour être placée à l’extrémité gauche de l’ESC est montrée ; II) Produit du clivage MwoI; III) Après la fin de la transcription in vitro/traduction, les produits sont purifiés et la ligature est effectuée avec un excès d’adaptateur. Seuls les produits de clivage qui ont été cliscés dans la séquence sélectionnée peuvent participer à la ligature. Par conséquent, les variantes inactives sont éliminées, et l’étape de retrait n’est pas nécessaire. Le produit de clivage dans la séquence de compteur sélectionné (à l’extrémité gauche de l’ESC, non montré) ne peut pas participer à cette ligature parce que l’extrémité saillante de l’adaptateur n’est pas complémentaire à la séquence de compteur sélectionnée; IV) Le PCR sélectif utilise la même stratégie que dans le protocole principal pour éliminer les variantes avec la spécificité dégénérée de type sauvage (F1 primer liant la distique au site sélectionné par compteur) tandis que les variantes inactives sont éliminées par l’amorce inverse sélective qui ne peut pas se lier à l’extrémité droite de l’imprave (et donc non modifiée par la ligature adaptateur). Dans le cycle suivant, le processus peut être itéré en utilisant l’adaptateur qui est identique au produit de clivage de l’étape précédente (c.-à-d. la « cassette fendée » dans le panneau III), et une amorce inverse sélective appropriée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Apprêts utilisés dans l’ingénierie NlaIV. Les séquences des sites de restriction mentionnés dans les commentaires sont soulignées. Les petites lettres indiquent des séquences qui n’ont pas de compléments dans les modèles d’ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).

Tableau 2 : Conditions de réactions PCR à utiliser dans le protocole. T_m - température de fonte des amorces (si T_m est différent pour les amorces, le T_m inférieur doit être utilisé). S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).

Tableau 3 : Résultats de la vérification de la qualité de deux amorces mutagènes synthétisées avec une stratégie de split-and-mix. Les codons mutagisés sont indiqués avec [XXX]. Un nombre d’index inférieur indique la position d’un acide aminé codé. Adapté de Czapinska et coll.⁸ avec la permission d’Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).

Tableau 4 : Résultats de l’EP-PCR. Principaux paramètres dérivés de l’analyse de séquence de 22 clones d’ECS. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).

Discussion

Le protocole de sélection décrit ici a été testé pour NlaIV⁸, une séquence de reconnaissance de plis PD-(D/E)XK dimerique qui reconnaît un site cible palindromique avec des bases centrales NN et catalyse une coupe d’extrémité émoussée entre les bases NN. NlaIV a été choisi parce que le clivage entre les bases NN suggère que ces bases sont proches de la protéine dans le complexe. En principe, le protocole pourrait être utilisé pour n’importe quelle séquence spécifique restriction endonuclease, monomérique ou dimerique, de tout groupe pli, catalysant les doubles ruptures de brin de n’importe quel échelon, indépendamment du fait que les domaines catalytiques et de spécificité coïncident (comme dans l’exemple NlaIV) ou sont séparés (par exemple, FokI). En outre, le protocole en principe est utile non seulement pour la génération de nouvelles spécificités enzymatiques plus étroites, mais pourrait également être utilisé pour éliminer les activités des étoiles, ou pour créer des endonucleases haute fidélité. Cependant, tout cela n’a pas encore été testé. En particulier, l’élimination ciblée de l’activité des étoiles peut être compliquée, car les mêmes résidus d’acide aminé pourraient être impliqués dans la liaison aux bases désirées et indésirables. Les étapes in vitro décrites dans ce protocole ne se limitent pas à la sélection des spécificités réduites, mais pourraient également être utilisées pour sélectionner des spécificités autrement modifiées. Cependant, il y a alors un problème avec les endonucleases variables : si le spectre des substrats inclut de nouvelles cibles non clivées par l’endonuclease parentale, il n’y a en général aucun bon moyen de protéger les cellules contre les effets nocifs de cette activité. En revanche, si la spécificité de l’endonuclease n’est réduite que, les cibles sont un sous-ensemble des cibles de type sauvage, et donc la méthyltransferase cognate déjà disponible devrait être entièrement protectrice.

Notre protocole diffère à plusieurs égards de nombreux protocoles d’évolution dirigés. La diversité des cadres de lecture ouverte est générée une fois au début de l’expérience, pas dans toutes les itérations. En outre, il est créé par la synthèse split-and-mix, plutôt que par EP-PCR. Pour les substitutions NNS des codons, comme utilisé dans ce travail, il ya (4 x 4 x 2)⁶ - 1,07 x 10⁹ combinaisons pour six positions. Par conséquent, une variante donnée est présente en moyenne une fois dans 1,7 fmoles de ESC. Cette capacité peut être augmentée à sept positions en utilisant la synthèse avec un mélange de 20 précurseurs de trinucléotide qui est offert par Glen Research ou en diminuant la fréquence de mutation dans des positions moins prometteuses avec la synthèse d’oligoucléotide split-and-mix. Si possible, il est recommandé de limiter l’étendue de la variation à six positions. De toute évidence, un tel ciblage mutagèse nécessite une certaine connaissance préexistante sur au moins les régions de la REase impliquées dans la liaison de substrat. Le protocole de fractionnement pour générer de la diversité présente des avantages évidents par rapport à l’EP-PCR. À l’aide d’EP-PCR, nous avons obtenu des variantes et des séquences inchangées portant huit substitutions pour les CSE NlaIV dans le même EP-PCR(tableau 4). La bibliothèque de l’EP-PCR contient une fraction substantielle de clones qui doivent être évités (séquences de type sauvage, substitutions multiples, frameshift et mutations absurdes, et mutations dans des endroits peu susceptibles d’affecter la spécificité de la séquence).

Notre protocole diffère également de beaucoup d’autres protocoles d’évolution dirigés par la présence de deux étapes de sélection séquentielles. La sélection positive permet de s’assurer que l’activité désirée est conservée, sinon l’étiquette de biotine n’est pas supprimée, et la séquence de codage peut être supprimée par traction vers le bas. Il est techniquement possible que l’émergence fortuite d’une spécificité nouvelle et non chevauchante (p. ex., GCATGC) puisse mener à la rupture de l’étiquette de biotine aussi bien, si un site de clivage approprié est présent près du clivage désiré, mais pas ailleurs. Cependant, cela devrait être très peu probable. La sélection négative supprime les cadres de lecture ouverts qui codent pour les enzymes qui ont encore l’activité indésirable. Cette étape n’est pas strictement obligatoire, car le protocole va encore enrichir la bibliothèque de sortie avec des variantes qui sont capables de fendre la séquence de sélection, mais pas en mesure de fendre ailleurs dans le ESC, ce qui le rend impropre à l’amplification PCR. Cependant, l’efficacité de sélection devrait être plus faible parce que les enzymes avec la spécificité originale de séquence ne seront pas enlevées de la sortie et surpasseront les variantes prometteuses avec la spécificité altérée mais également l’activité enzymatique diminuée. Notez qu’au niveau de la population, les séquences cibles souhaitées et indésirables peuvent, mais n’ont pas besoin d’être, dégénérer. Dans l’exemple du NlaIV, l’anti-cible était dégénérée et la cible non dégénérée. Même lorsqu’il y a dégénérescence au niveau de la population, dans une seule gouttelette, une seule cible (non dégénérée) ou anti-cible est présente. Dans notre protocole, les séquences cibles et anti-cibles sont réintroduites à chaque répétition des étapes de sélection. Par conséquent, un cadre de lecture ouverte doit coder une enzyme capable de clivage de toutes les cibles possibles, et incapable de fendre l’une des cibles anti-cibles, pour survivre à plusieurs tours de sélection. Notez que la nécessité de réintroduire la cible anti-saisie à chaque itération du protocole applique deux PCR séquentiels. Le premier PCR utilise une amorce qui anneals en dehors de l’anti-cible, de sorte que le clivage de l’anti-cible empêche la réaction PCR. Le deuxième PCR nécessite une amorce qui va au-delà de l’anti-cible, et réintroduit anti-cible, pour s’assurer que pendant plusieurs tours de sélection, chaque cadre de lecture ouverte est testé contre toutes les variantes de l’anti-cible.

Pour les enzymes qui génèrent des extrémités collantes, un protocole alternatif connexe basé sur une méthode précédemment décrite pour l’isolement de REase ORF¹⁰ peut être utilisé. L’épuisement des variantes inactives par capture de biotine qui est utilisé dans nos expériences est remplacé dans le protocole alternatif par la ligature de l’adaptateur compatible avec une séquence qui est utilisé comme un site de liaison d’amorce dans un PCR sélectif(figure 9). Seuls les ESC qui produisent des enzymes avec la spécificité sélectionnée génèrent des fins capables de ligation et seront donc sélectionnés. La séquence de l’extrémité collante de la séquence anti-eselected doit être conçue de manière à ce qu’elle ne puisse pas participer à la ligature avec des adaptateurs. L’itération du processus de sélection peut être facilement réalisée en passant d’un adaptateur différent à deux adaptateurs différents et, par conséquent, de deux amorces inversées différentes dans le PCR sélectif.

Même avec de nouveaux protocoles, la tâche d’ingénierie de nouvelles spécificités in vitro est encore très difficile. Pour les REases typiques de type II, la spécificité de séquence et l’activité endonucleolytique dépendent des mêmes régions protéiques. Il est donc difficile de modifier l’un sans affecter l’autre. Le succès est rendu plus probable par une stratégie qui prend en compte l’empreinte de l’enzyme, respecte la symétrie des interactions protéines-ADN, et s’appuie sur des préférences enzymatiques préexistantes, qui devraient être déterminées dès le départ dans les expériences biochimiques, comme cela a été fait pour l’exemple NlaIV⁸.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1000Å ; Support CPG (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	D’autres fournisseurs peuvent également être utilisés
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Extraction	Thermo Scientific	K0691	Tout autre kit peut être utilisé
Cartouche de purification d’ADN Glen-Pak	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
		pET 28a	Tout autre vecteur avec un promoteur T7 en amont du site de plyclonage peut être utilisé à la place
Phusion ADN polymérase haute fidélité	Thermo Scientific	F530S	Tout autre polymérase thermophile haute fidélité et hautement processive peut être utilisé à la place
Feuille d’acier poreuse	Biosset	40-063
Système de traduction rapide RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Restriction endonucléases	Thermo Scientific		De toute évidence, d’autres fournisseurs, enzymes peuvent être utilisés
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	D’autres fournisseurs peuvent également être utilisés. Nous avons testé positivement les lits de Sigma
Produits chimiques de synthèse, y compris les phosphoramidités	Carl Roth		D’autres fournisseurs peuvent également être utilisés
Colonnes de synthèse (différentes tailles)	Biosset
T4 ADN ligase	Thermo Scientific	EL0011	Toute autre ligase peut être utilisée