Method Article

Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de cette méthode est de déterminer la densité CR1 dans les érythrocytes de n’importe quel sujet en comparant avec trois sujets dont la densité érythrocyte CR1 est connue. La méthode utilise la cytométrie de flux après immunostaining des érythrocytes des sujets par un anticorps monoclonal anti-CR1 couplé à un système amplifié utilisant la phycoerythrine (PE).

Abstract

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CR1 (CD35, Récepteur de complément de type 1 pour C3b/C4b) est une glycoprotéine à forte membrane de poids moléculaire d’environ 200 kDa qui contrôle l’activation de complément, transporte des complexes immunitaires, et participe à des réponses immunitaires humoristiques et cellulaires. CR1 est présent à la surface de nombreux types de cellules, y compris les érythrocytes, et présente des polymorphismes de longueur, de structure (Knops, ou KN, groupe sanguin) et de densité. La densité moyenne de CR1 par érythrocyte (CR1/E) est de 500 molécules par érythrocyte. Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Nous présentons ici une méthode robuste de cytométrie de flux pour mesurer la densité de CR1/E, y compris dans les sujets exprimant une basse densité, avec l’aide d’un système d’immunostaining amplificateur. Cette méthode nous a permis de montrer l’abaissement de l’expression érythrocyte CR1 dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer (SA), le lupus erythematosus systémique (LE), le sida ou le paludisme.

Introduction

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CR1 (récepteur de complément de type 1, CD35) est un 200 kDa transmembrane glycoprotéine présente à la surface de nombreux types de cellules, tels que les érythrocytes1, B lymphocytes2, cellules monocytiques, certaines cellules T, cellules dendritiques folliculaires3, astrocytes foetaux4, et podocy glomerular5tes. CR1 interférant avec ses ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, un sous-unité de la première composante de complément, ....

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Protocol

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Le protocole de collecte et de manipulation du sang humain a été examiné et approuvé par le comité régional d’éthique (RPC Est II), et le numéro de protocole est 2011-A00594-37. Étant donné que le protocole suivant décrit la manipulation du sang humain, les lignes directrices institutionnelles pour l’élimination du matériel biorisque devraient être suivies. L’équipement de sécurité de laboratoire, tel que les blouses de laboratoire et les gants, doit être porté.

1. Lavage d’érythrocyte

REMARQUE : La veille de la manipulation, préparez un tampon PBS-BSA avec saline tampon de phosphate (PBS) contenant 0,15 % de l’alb....

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Results

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Les érythrocytes de trois sujets dont la densité de CR1 est connue (sujet « faible » [180 CR1/E], sujet « moyen » [646 CR1/E], et sujet « élevé » [966 CR1/E]), et de deux sujets dont la densité CR1 devait être déterminée étaient immunostained par un anticorps anti-CR1 couplé à un système d’amplification utilisant le fluorochrome de phycoerythrine. Au début, la densité CR1 des sujets de la gamme basse-élevée a été déterminée par la méthode de Scatchard29 utilisant des anticorps radiolacdés. Les nor.......

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Discussion

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Plusieurs techniques sont disponibles pour déterminer la densité de l’érythrocyte CR1 (CR1/E). Les premières techniques utilisées étaient l’agglutination des globules rouges par les anticorps anti-CR131 et la formation de rosettes en présence d’érythrocytes enduits de C3b32. Ces techniques rudimentaires ont été rapidement remplacées par des méthodes d’immunostaining à l’aide d’anticorps anti-CR1 radiolactés1,33. Il .......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Nous remercions tous les membres de l’URCACyt, la plate-forme technique de cytométrie des flux, le personnel du Département d’immunologie, et le personnel du Département de médecine interne et de gériatrie, qui ont contribué à l’optimisation et à la validation du protocole. Ces travaux ont été financés par les Hôpitaux Universitaires de Reims (numéro de subvention AOL11UF9156).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Epipetage d’échantillons
1-100 & micro ; L Biseauté, pointe filtranteStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AllemagneS1120-1840pipetage d’échantillons
Anticorps monoclonal biotinylé anti-CR1 (J3D3)Production à domicile d’anticorps monoclonaux non commerciaux, avec l’aimable autorisation du Dr J. Cookimmunocoloration Protection
chemisier
Albumine sérique Bovin (7,5 %)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037
cytométrie CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917 centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytométrie
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060P
rack Cytometer Setup & Kit de billes de suiviBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytométrie
Solution de formaldéhyde 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µ ; L Gradué, pointe filtranteStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AllemagneS1121-3810pipetage d’échantillons
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytométrie
Microman Pistons capillairesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathPipetage d’échantillons
067494 Micronic 1,40 mL tubes à fond rondDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379pipetage d’échantillons
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytométrie
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952pipetage d’échantillons
sans poudre Nitrile Examen gantsMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802protection d’échantillon
Référence 2 pipette, 0,5-10 & micro ; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024pipette d’échantillon
Référence 2, 20-100 & micro ; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059pipetage d’échantillons
Référence 2, 100-1000 & micro ; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083pipetage d’échantillons
Solution de rinçageBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytométrie
Tube à fond rondSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579
cytométrie Safe-Lock Tubes, 1,5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidine R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunomarquage
Tubes à centrifuger coniques 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vecteur anti streptavidine biotineEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunomarquage
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, États-UnisMélange SI-0236
du

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.

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Erythrocyte Complement Receptor 1Flow Cytometry AnalysisCR1 Density MeasurementImmunostaining ProtocolAntibody Amplification SystemBlood Cell PreparationFluorescence DetectionReceptor QuantificationDisease Biomarker AnalysisCell Surface Markers

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