Method Article

Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

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1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de cette méthode est de déterminer la densité CR1 dans les érythrocytes de n’importe quel sujet en comparant avec trois sujets dont la densité érythrocyte CR1 est connue. La méthode utilise la cytométrie de flux après immunostaining des érythrocytes des sujets par un anticorps monoclonal anti-CR1 couplé à un système amplifié utilisant la phycoerythrine (PE).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (CD35, Récepteur de complément de type 1 pour C3b/C4b) est une glycoprotéine à forte membrane de poids moléculaire d’environ 200 kDa qui contrôle l’activation de complément, transporte des complexes immunitaires, et participe à des réponses immunitaires humoristiques et cellulaires. CR1 est présent à la surface de nombreux types de cellules, y compris les érythrocytes, et présente des polymorphismes de longueur, de structure (Knops, ou KN, groupe sanguin) et de densité. La densité moyenne de CR1 par érythrocyte (CR1/E) est de 500 molécules par érythrocyte. Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Nous présentons ici une méthode robuste de cytométrie de flux pour mesurer la densité de CR1/E, y compris dans les sujets exprimant une basse densité, avec l’aide d’un système d’immunostaining amplificateur. Cette méthode nous a permis de montrer l’abaissement de l’expression érythrocyte CR1 dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer (SA), le lupus erythematosus systémique (LE), le sida ou le paludisme.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (récepteur de complément de type 1, CD35) est un 200 kDa transmembrane glycoprotéine présente à la surface de nombreux types de cellules, tels que les érythrocytes1, B lymphocytes2, cellules monocytiques, certaines cellules T, cellules dendritiques folliculaires3, astrocytes foetaux4, et podocy glomerular5tes. CR1 interférant avec ses ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, un sous-unité de la première composante de complément, C1q10 et MBL (lectine mannan-contraignant)11 inhibe l’activation du complément et est impliqué dans la réponse immunitaire humoristique et cellulaire.

Chez les primates, y compris les humains, l’érythrocyte CR1 est impliqué dans le transport de complexes immunitaires vers le foie et la rate, pour purifier le sang et prévenir leur accumulation dans les tissus vulnérables tels que la peau ou les reins12,13,14. Ce phénomène d’adhérence immunitaire entre les complexes immunitaires et les érythrocytes dépend du nombre de molécules CR115. Chez l’homme, la densité moyenne de CR1/E n’est que de 500 (c.-à-d. 500 molécules de CR1 par érythrocyte). Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Certaines personnes de phénotype "null" expriment moins de 20 CR1/E16.

La densité de CR1/E est réglementée par deux allèles autosomiques co-dominants liés à une mutation ponctuelle dans l’intron 27 du codage génétique pour CR1-117,18. Cette mutation produit un site de restriction supplémentaire pour l’enzyme HindIII. Les fragments de restriction obtenus après digestion avec HindIII dans ce cas sont 7,4 kb pour l’allèle lié à une expression forte de CR1 (H: allèle élevé) et 6,9 kb pour l’allèle lié à une faible expression CR1 (L: faible allèle). Ce lien se trouve chez les Caucasiens et les Asiatiques, mais pas chez les personnes d’ascendance africaine19.

Le niveau d’expression de l’érythrocyte CR1 est également corrélé avec la présence de mutations nucléotides ponctuelles dans l’exon 13 codant SCR 10 (I643T) et dans l’encodage exon 19 SCR16 (Q981H). Il est élevé en homozygous 643I/981Q et faible en homozygous 643T/981H individus20. Ainsi, les personnes « faibles » expriment environ 150 CR1/E, les individus « moyens » expriment environ 500 CR1/E, et les individus « élevés » expriment environ 1 000 CR1/E.

En plus de ce polymorphisme de densité érythrocyte, CR1 se caractérise par un polymorphisme de longueur correspondant à quatre allotypes de tailles différentes : CR1-1 (190 kDa), CR1-2 (220 kDa), CR1-3 (160 kDa), et CR1-4 (250 kDa)21 et un polymorphisme antigénique correspondant au groupe sanguin KN22.

Nous présentons notre méthode basée sur la cytométrie d’écoulement pour déterminer la densité de CR1/E. À l’aide de trois sujets dont la densité CR1/E est connue, exprimant un faible niveau de densité (180 CR1/E), un niveau de densité moyenne (646 CR1/E) et un niveau de densité élevée (966 CR1/E), il est facile de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) de leurs érythrocytes ou globules rouges (RBC), ou RBC MFI, après l’immunodétoïx anti-CR1 à l’aide d’un cytomètre. On peut ensuite tracer une ligne standard représentant l’IMF en fonction de la densité CR1/E. En mesurant l’IMF des sujets dont la densité CR1/E n’est pas connue et en la comparant à cette ligne standard, il est possible de déterminer la densité CR1/E des individus. Cette technique a été utilisée pendant de nombreuses années en laboratoire, et nous a permis de détecter une réduction de l’expression de l’érythrocyte CR1 dans de nombreuses pathologies telles que le lupus erythématosus systémique (LLE)23, syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA)24, paludisme25, et récemment la maladie d’Alzheimer (AD)26,27. Le développement de médicaments ciblant CR1 pour coupler avec des érythrocytes, comme dans le cas des médicaments anti-thrombotiques28 nécessite l’évaluation de la densité CR1/E, et la disponibilité d’une technique robuste pour quantifier CR1.

Le protocole présenté fonctionne en singlicate. Il est adaptable de déterminer la densité de CR1/E sur de nombreuses personnes utilisant des plaques de puits 96 disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux). À cette fin, il est facile d’adapter notre méthode à n’importe quelle plaque de puits 96. Pour chaque échantillon, une suspension cellulaire des érythrocytes (0,5 x 106x 1 x 106 érythrocytes) est distribuée par puits. Pour chaque puits, d’abord l’anticorps anti-CR1 primaire est ajouté, puis streptavidin PE, l’anticorps anti-streptavidine secondaire, et encore une fois streptavidin PE, en utilisant les mêmes dilutions que celles de notre méthode, mais en adaptant les volumes et en respectant la proportionnalité.

Les échantillons de sang provenant de sujets de la gamme et des sujets à quantifier pour LE CR1 doivent être prélevés en même temps, stockés au réfrigérateur à 4 oC et manipulés à 4 oC (sur glace et/ou au réfrigérateur).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole de collecte et de manipulation du sang humain a été examiné et approuvé par le comité régional d’éthique (RPC Est II), et le numéro de protocole est 2011-A00594-37. Étant donné que le protocole suivant décrit la manipulation du sang humain, les lignes directrices institutionnelles pour l’élimination du matériel biorisque devraient être suivies. L’équipement de sécurité de laboratoire, tel que les blouses de laboratoire et les gants, doit être porté.

1. Lavage d’érythrocyte

REMARQUE : La veille de la manipulation, préparez un tampon PBS-BSA avec saline tampon de phosphate (PBS) contenant 0,15 % de l’albumine de sérum bovin (BSA) et placez-le au réfrigérateur à 4 oC. Ce tampon sera utilisé comme tampon de lavage et comme tampon de dilution.

  1. Pipette 20 mL de PBS-BSA dans un tube de 50 mL.
  2. Aspirer 250 l’acide tétratacétique à l’éthylènediamine de sodium (EDTA) anticoagulé du sang des tubes de stockage du sang et ajouter au tube contenant les 20 ml de PBS-BSA. Fermez le tube en visser le bouchon. Mélanger délicatement en inversant le tube 2x.
  3. Centrifuge le tube pendant 10 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant à l’aide d’une pipette de 10 ml. Réutilisez la pastille dans le volume résiduel de supernatant par tuyauterie douce et soigneuse.
  4. Ajouter 20 ml de PBS-BSA froid (4 oC) dans le tube contenant la granule. Centrifuge le tube pendant 10 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant à l’aide d’une pipette de 10 ml.
  5. Ajouter 20 ml de PBS-BSA froid (4 oC) dans le tube contenant la granule. Centrifuge le tube pendant 10 min à 4 oC à 430 x g. Laissez le tube dans la centrifugeuse à 4 oC et allez à la section 2.

2. Dilution d’érythrocyte

  1. Pipette 3 ml de PBS-BSA froid dans un tube de 50 ml et le stocker à 4 oC sur une grille dans la glace.
  2. Placez le tube centrifuge contenant les érythrocytes (étape 1.4) sur une grille placée dans la glace.
  3. Pipette 8 ll d’érythrocytes granulés à l’aide de la pipette et ajouter au tube de 50 ml contenant les 3 ml de PBS-BSA pour obtenir la dilution érythrocyte. Mélanger le tube doucement à la main pour obtenir une suspension cellulaire homogène des érythrocytes.

3. Immunostaining d’érythrocyte

  1. Pipette 100 L de dilution érythrocyte (obtenue à la section 4) et ajouter à 1,4 mL tubes.
  2. Centrifuge les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Pendant la centrifugation, préparer une dilution d’anticorps anti-CR1 J3D3 biotinylé à une concentration de 0,05 g/L dans le tampon PBS-BSA.
  3. Une fois la centrifugation terminée, retirer et jeter le supernatant.
  4. Ajouter 20 L d’anti-CR1 J3D3 biotinylé directement à la pastille. Pour préparer le contrôle négatif, ajoutez plutôt 20 L de tampon PBS-BSA. Mélanger délicatement les tubes et incuber pendant 45 minutes à 4 oC.
  5. Après 45 min d’incubation, ajouter 750 L de PBS-BSA aux tubes. Centrifuge les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répéter.
  6. En attendant, préparez une dilution de 1:10 de streptavidin-phycoerythrin dilué dans le tampon PBS-BSA. Pipette 20 L de la dilution de 1:10 de streptavidin-phycoerythrin et ajouter aux tubes. Mélanger délicatement les tubes et incuber pendant 45 minutes à 4 oC.
  7. Ajouter 750 L de tampon PBS-BSA dans les tubes. Bien mélanger et centrifugeuse pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répéter.
  8. Pendant la centrifugation, préparez une dilution de 1:100 d’anticorps anti-streptavidin biotinylé dilués dans le tampon PBS-BSA.
  9. Une fois la centrifugation terminée, retirer et jeter le supernatant.
  10. Pipette 20 L de la dilution de 1:100 de l’anti-streptavidine biotinylé dans les tubes. Mélanger délicatement les tubes. Incuber les tubes pendant 45 min à 4 oC.
  11. Après 45 min d’incubation, pipette 750 L de tampon PBS-BSA et ajouter dans les tubes. Centrifuge les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répéter.
  12. Pipette 20 L de la dilution de 1:10 de streptavidin-phycoerythrin et ajouter dans les tubes. Mélanger délicatement les tubes. Incuber les tubes pendant 45 min à 4 oC.
  13. Pipette 750 L de tampon PBS-BSA et ajouter dans les tubes. Bien mélanger et centrifuger les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répétez cette étape 2x.

4. Fixation d’érythrocyte immunostained

  1. Au cours de la dernière centrifugation, préparer le tampon de fixation, une dilution de 1:100 de formaldéhyde de 37% à l’aide du tampon de lavage PBS-BSA.
  2. Pipette 450 L de tampon de fixation et ajouter dans les tubes d’érythrocyte immunostained (de l’étape 3.13) tout en vortexing pour 5 s.
  3. Pipette toutes les cellules fixes dans des tubes de fond ronds de 5 ml et se conservent au réfrigérateur.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici pour un lever jusqu’à 48 h.

5. Analyse de cytométrie d’écoulement des érythrocytes tachés

REMARQUE : Il est conseillé de se référer au manuel de l’opérateur pour le cytomètre (voir tableau des matériaux) pour savoir comment effectuer les lectures cytométriques. Les paramètres suggérés ci-dessous s’appliquent à l’instrument utilisé et doivent être optimisés pour chaque cytomètre.

  1. Allumez le cytomètre d’écoulement, puis allumez l’ordinateur. Laissez la température du système optique se stabiliser en la laissant allumée pendant 30 min. Vérifiez la fenêtre cytomètre du logiciel pour vous assurer que le cytomètre est connecté au poste de travail (le message Cytometer Connected est affiché).
  2. Vérifiez que le conteneur tampon est plein et que le conteneur à déchets est vide. Supprimer les bulles d’air dans le filtre tampon et la ligne tampon à l’aide du système de purge. Primez le système de fluidité en appuyant sur le bouton Prime sur la console du cytomètre. Attendez que le voyant indicateur passe du rouge au vert.
  3. Pour nettoyer les fluides, installez un tube contenant 3 ml d’une solution de nettoyage sur le port d’injection de l’échantillon et laissez la solution de nettoyage fonctionner pendant 5 min avec un débit d’échantillon élevé. Répétez cette opération avec la solution de rinçage avec de l’eau distillée. Laissez le tube contenant de l’eau sur le port d’injection de l’échantillon.
  4. Pour préparer les perles d’étalonnage, pipette 400 L de PBS dans le fond d’un tube rond de fond. Mélanger les stocks de perles fortement en vortexing pour 30 s. Ajouter une goutte au tube rond du bas contenant PBS. Mélanger soigneusement en vortexing pendant 30 s.
  5. Exécutez la vérification des performances. Ouvrez le module de configuration et de suivi du cytomètre dans le logiciel ( figure1A). Vérifiez que la configuration du cytomètre est correcte pour l’expérience à l’aide de l’immunostaining PE. Vérifiez que le lot de perles d’étalonnage est correct avec la configuration.
  6. Installez le tube de perle sur le port d’injection de l’échantillon et laissez-le fonctionner avec un faible débit d’échantillon. Exécutez la vérification des performances, qui prend environ 5 minutes pour terminer). Une fois la vérification des performances terminée, vérifiez que les performances du cytomètre sont satisfaisantes(figure 1B). Fermez le module de configuration et de suivi du cytomètre dans le logiciel.
  7. Pour configurer une expérience et créer des paramètres d’application, cliquez sur le bouton Nouvelle Expérience sur la barre d’outils du navigateur et ouvrez la nouvelle expérience. Spécifier les paramètres en sélectionnant les paramètres de cytomètre appropriés : Diffusion vers l’avant (FSC), Scatter latéral (SSC) et PE du menu déroulant de l’expérience(figure 1C). Sélectionnez le mode linéaire pour le paramètre FSC et le mode Logarithm pour les paramètres SSC et PE.
  8. Dans l’expérience ouverte, sélectionnez Cytometer Paramètres (figure 1D), puis sélectionnez Paramètres d’application, et créez une feuille de travail globale (figure 1E). Utilisez les boîtes grises et les réticules pour guider l’optimisation.
  9. Chargez le tube de commande non conservé sur le cytomètre et exécutez Acquisition. Veiller à ce que la population d’intérêts (c.-à-d. les CR) soit à l’échelle en optimisant les tensions FSC et SSC. Optimiser la valeur seuil FSC pour éliminer les débris sans interférer avec la population d’intérêt.
  10. Dessinez une porte autour des CTC sur le terrain FSC vs SSC. Afficher la population rbc dans la parcelle à points de fluorescence PE. Si nécessaire, augmentez la fluorescence des tensions du tube photomultiplier (PMT) pour placer la population négative dans les boîtes grises. Déchargez le tube de commande non contaminé du cytomètre.
  11. Vérifiez que les populations positives sont à l’échelle. Chargez le tube de commande taché sur le cytomètre et exécutez l’acquisition. Abaissez la tension PMT pour la population positive si elle est hors échelle jusqu’à ce que la population positive peut être vu entièrement sur l’échelle. Déchargez ensuite l’échantillon taché.
  12. Pour enregistrer et analyser des échantillons, sur une nouvelle feuille de travail globale, créez les parcelles suivantes pour prévisualiser les données : 1) FSC vs SSC, et 2) histogram de fluorescence PE. Chargez le premier échantillon sur le cytomètre et exécutez l’acquisition.
  13. Dessinez une porte RBC autour des érythrocytes sur la parcelle FSC vs SSC. Afficher la population de RBC dans l’histogramme de fluorescence PE. De l’avis des statistiques, sélectionnez la moyenne des paramètres de fluorescence PE sur les populations de GR(figure 1F).
  14. Dans le tableau de bord d’acquisition, sélectionnez tous les événements de la porte d’arrêt et 10 000 événements à enregistrer(figure 1G). Cliquez sur Les données d’enregistrement. Lorsque l’enregistrement de l’événement est terminé, retirez le premier tube du cytomètre. Les diagrammes de feuille de travail globaux devraient ressembler à ceux de la figure 2.
  15. Chargez les échantillons suivants et enregistrez-les.

6. Détermination de la densité de l’érythrocyte CR1

  1. Prenez les valeurs des intensités moyennes de fluorescence des échantillons correspondant au sujet « faible »(figure 3, tableau I,RBC MFI), sujet « moyen »(figure 4, tableau D,MFI RBC), sujet « élevé »(figure 4, tableau I,RBC MFI) et à l’échantillon de contrôle négatif(figure 3, tableau I, RBC IMF).
  2. Sur un graphique représentant l’intensité moyenne de fluorescence en fonction de la densité de CR1, placez les quatre points correspondant au contrôle négatif, sujet « faible », sujet « moyen » et sujet « élevé » (points bleus, figure 6).
  3. Dessinez la ligne de régression pour obtenir la ligne d’étalonnage et son équation.
  4. Prenez les valeurs de l’intensité moyenne de fluorescence des échantillons correspondant aux sujets dont la densité doit être déterminée. (Figure 5, Tableaux D et I, RBC MFI).
  5. Obtenez l’équation en remplaçant « Y » en utilisant les valeurs des intensités moyennes de fluorescence, et calculez la densité de CR1/E(figure 6).
  6. Vérifiez sur le graphique que les valeurs d’intensité moyenne de fluorescence et la densité CR1/E déterminée correspondent à un point sur la ligne d’étalonnage(figure 6).

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Results

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Les érythrocytes de trois sujets dont la densité de CR1 est connue (sujet « faible » [180 CR1/E], sujet « moyen » [646 CR1/E], et sujet « élevé » [966 CR1/E]), et de deux sujets dont la densité CR1 devait être déterminée étaient immunostained par un anticorps anti-CR1 couplé à un système d’amplification utilisant le fluorochrome de phycoerythrine. Au début, la densité CR1 des sujets de la gamme basse-élevée a été déterminée par la méthode de Scatchard29 utilisant des anticorps radiolacdés. Les nor...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plusieurs techniques sont disponibles pour déterminer la densité de l’érythrocyte CR1 (CR1/E). Les premières techniques utilisées étaient l’agglutination des globules rouges par les anticorps anti-CR131 et la formation de rosettes en présence d’érythrocytes enduits de C3b32. Ces techniques rudimentaires ont été rapidement remplacées par des méthodes d’immunostaining à l’aide d’anticorps anti-CR1 radiolactés1,33. Il ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions tous les membres de l’URCACyt, la plate-forme technique de cytométrie des flux, le personnel du Département d’immunologie, et le personnel du Département de médecine interne et de gériatrie, qui ont contribué à l’optimisation et à la validation du protocole. Ces travaux ont été financés par les Hôpitaux Universitaires de Reims (numéro de subvention AOL11UF9156).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Epipetage d’échantillons
1-100 & micro ; L Biseauté, pointe filtranteStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AllemagneS1120-1840pipetage d’échantillons
Anticorps monoclonal biotinylé anti-CR1 (J3D3)Production à domicile d’anticorps monoclonaux non commerciaux, avec l’aimable autorisation du Dr J. Cookimmunocoloration Protection
chemisier
Albumine sérique Bovin (7,5 %)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037
cytométrie CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917 centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytométrie
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060P
rack Cytometer Setup & Kit de billes de suiviBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytométrie
Solution de formaldéhyde 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µ ; L Gradué, pointe filtranteStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AllemagneS1121-3810pipetage d’échantillons
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytométrie
Microman Pistons capillairesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathPipetage d’échantillons
067494 Micronic 1,40 mL tubes à fond rondDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379pipetage d’échantillons
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytométrie
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952pipetage d’échantillons
sans poudre Nitrile Examen gantsMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802protection d’échantillon
Référence 2 pipette, 0,5-10 & micro ; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024pipette d’échantillon
Référence 2, 20-100 & micro ; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059pipetage d’échantillons
Référence 2, 100-1000 & micro ; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083pipetage d’échantillons
Solution de rinçageBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytométrie
Tube à fond rondSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579
cytométrie Safe-Lock Tubes, 1,5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidine R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunomarquage
Tubes à centrifuger coniques 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vecteur anti streptavidine biotineEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunomarquage
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, États-UnisMélange SI-0236
du

References

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