Un protocole d’extraction du génome guidé par spectrométrie de masse est établi et décrit ici. Il est basé sur l’information sur la séquence génomique et l’analyse LC-MS/MS et vise à faciliter l’identification des molécules à partir d’extraits microbiens et végétaux complexes.
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Article de méthode
L’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’espace chimique couvert par les produits naturels est immense et largement méconnu. Par conséquent, des méthodologies pratiques pour effectuer une évaluation de grande envergure de leurs fonctions dans la nature et les avantages humains potentiels (p. ex., pour les applications de découverte de médicaments) sont souhaitées. Ce protocole décrit la combinaison de l’extraction du génome (GM) et du réseautage moléculaire (MN), deux approches contemporaines qui correspondent aux annotations codées par les grappes génétiques dans le séquençage du génome entier avec des signatures de structure chimique provenant d’extraits métaboliques bruts. C’est la première étape vers la découverte de nouvelles entités naturelles. Ces concepts, lorsqu’ils sont appliqués ensemble, sont définis ici comme l’exploitation du génome guidée par la SP. Dans cette méthode, les composants principaux sont auparavant désignés (à l’aide de MN), et les nouveaux candidats structurellement liés sont associés à des annotations de séquences génomiques (à l’aide de GM). La combinaison de GM et de MN est une stratégie rentable visant à cibler de nouvelles colonnes dorsales de molécules ou à récolter des profils métaboliques afin d’identifier les analogues des composés déjà connus.
Introduction
Les études sur le métabolisme secondaire consistent souvent à filtrer des extraits bruts pour des activités biologiques spécifiques suivies de la purification, de l’identification et de la caractérisation des constituants appartenant à des fractions actives. Ce processus s’est avéré efficace, favorisant l’isolement de plusieurs entités chimiques. Cependant, aujourd’hui, cela est considéré comme irréalisable, principalement en raison des taux élevés de redécouverte. Comme l’industrie pharmaceutique a révolutionné sans connaître les rôles et les fonctions des métabolites spécialisés, leur identification a été effectuée dans des conditions de laboratoire qui ne représent....
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Protocole
1. Extraction du génome pour les grappes de gènes biosynthétiques
- Effectuer le séquençage du génome entier (WGS) comme première étape vers l’élection d’un groupe génétique biosynthétique (BCG) pour l’extraction du génome guidé par la SP. L’ébauche du génome entier de la souche d’intérêt (bactéries) peut être obtenue par la technologie Illumina MiSeq en utilisant ce qui suit avec l’ADN génomique de haute qualité: fusil de chasse TruSeq PCR-Free bibliothèque de préparation et Nextera Mate Paire Library Preparation Kit33.
REMARQUE : Après séquençage, la bibliothèque de fusils de chasse Illumina et la bibliothèque de paires Illumina ma....
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Résultats
Le protocole a été illustré avec succès à l’aide d’une combinaison d’extraction du génome, d’expression hétérogène et d’approches guidées par le MS/code pour accéder à de nouvelles molécules spécialisées d’analogues de la valinomycine. Le flux de travail génome-molécule pour la cible, la valinomycine (VLM), est représenté dans la figure 8. Streptomyces sp. CBMAI 2042 projet génome a été analysé dans silico, et le faisceau de gène VLM a ensuite été identifié et transféré à un hôte hé.......
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Discussion
L’avantage le plus fort de ce protocole est sa capacité à déposifier rapidement les profils métaboliques et à combler l’information génomique avec les données de la SP afin d’élucider les structures de nouvelles molécules, en particulier les analogues structurels2. Sur la base d’informations génomiques, différents produits naturels chemotypes peuvent être étudiés, tels que les polyketides (PK), peptides nonribosomal (NRP), et les produits naturels glycosylés (PNB), ainsi que les BGCs cryptiques. L.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le soutien financier apporté à cette étude a été fourni par la Fondation de recherche de Sao Paulo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 et 2014/50249-8 à L.G.O; 2013/12598-8 et 2015/01013-4 à R.S.; et 2019/08853-9 à C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A., et L.G.O. ont reçu des bourses du Conseil national pour le développement scientifique et technologique - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, et 313492/2017-4). L.G.O. est également reconnaissant pour le soutien de subvention fourni par le programme Pour les femmes en sciences (2008, Édition brésilienne). Tous les auteurs reconnaissent capeS (Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur) pour soutenir ....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acétonitrile | Tedia | AA1120-048 | Gélose de qualité HPLC |
| Oxoid | LP0011 | NA | |
| Apramycine | Sigma Aldrich | A2024 | NA |
| Carbenicilline | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| Centrifugeuse | Eppendorf | NA | 5804 |
| Chloramphénicol | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| Colonne C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å ;, 2,1 x 50 mm, 1,8 & micro ; m, 1200 bar limite de pression P/N 757700-902 |
| Kanamycin | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Microcentrifugeuse | Eppendorf | NA | 5418 |
| Acide nalidixique | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | |
| NA Q-TOF Spectromètre de masse | Agilent technologies | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarose P.A.- A.C.S. | Synth | NA | |
| NA Shaker/Incubator | Marconi | MA420 | NA |
| Chlorure de sodium | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Extrait de soja | NA | NA NA | |
| Sucrose | Synth NA | P. A. - ACS | |
| Thermal Cycles | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | NA |
| Tryptone Bouillon de soja | Oxoid CM0129 | ||
| NA UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 Infinity LC System |
| Extrait de levure | Oxoid | LP0021 | NA |
Références
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
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Réimpressions et autorisations
