Surveillance de l’assemblage eIF4F en mesurant l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes qui permettrait à l’utilisateur d’évaluer la perturbation induite par les médicaments de la dynamique complexe eIF4F dans les formats de dépistage.

Abstract

La formation du complexe eIF4F s’est montrée être le nœud clé en aval pour la convergence des voies de signalisation qui subissent souvent une activation oncogène chez l’homme. eIF4F est un complexe de fixation de bouchons impliqué dans la phase de recrutement de l’ARNm-ribosome de l’initiation à la traduction. Dans de nombreux modèles cellulaires et précliniques de cancers, la déréglementation de l’eIF4F conduit à une traduction accrue de sous-ensembles spécifiques d’ARNm impliqués dans la prolifération et la survie du cancer. eIF4F est un complexe hétéro-trimeric construit à partir du sous-unité de fixation de bouchon eIF4E, de l’héliase eIF4A et du sous-unité d’échafaudage eIF4G. L’interaction protéine-protéine entre les protéines eIF4E et les protéines eIF4G est essentielle pour l’assemblage de complexes eIF4F actifs. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour mesurer l’assemblage eIF4F qui surveille l’état de l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes. L’analyse d’interaction protéine-protéine à base de cellules eIF4e:4G permet également d’évaluer avec précision et fiabilité les changements induits par les médicaments dans l’intégrité du complexe eIF4F. Nous envisageons que cette méthode puisse être appliquée pour vérifier l’activité des composés disponibles dans le commerce ou pour le dépistage plus avant de nouveaux composés ou modalités qui perturbent efficacement la formation du complexe eIF4F.

Introduction

Le contrôle de l’expression des gènes joue un rôle central dans l’exécution correcte des programmes cellulaires tels que la prolifération de la croissance et la différenciation. Un mécanisme de contrôle réglementaire peut être exercé soit au niveau de la transcription des gènes, soit au niveau de la traduction de l’ARNm. Au cours de la dernière décennie, il est devenu de plus en plus évident que le contrôle translationnel par modulation du processus d’initiation plutôt que par les étapes ultérieures de l’allongement et de l’arrêt peut réguler finement la synthèse de sous-ensembles spécifiques de protéines qui jouent un large éventail de fonctions biologiques.

Protocol

La lignée cellulaire HEK293 a été utilisée pour le protocole et a été cultivé dans le milieu modifié de l’aigle de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline/streptocotomycine. Les cellules ont été cultivés à 37 °C avec 5% de CO₂ dans un environnement humidifié.

1. Évaluation quantitative des perturbations complexes eIF4F via eIF4E:eIF4G^604-646 test de complémentarité

1. Culture cellulaire et passagère transitoire de l’eIF4E:eIF4G^604-646 test de complémentarité
   1. Utilisez des cellules fraîchement décongelées avec moins de 20 passages pour tout....

Results

Afin de valider la sensibilité du système de complémentarité eIF4E:eIF4G^604-646, l’inhibition 4EBP1 de l’assemblage complexe eIF4F a été évaluée à l’aide d’inhibiteurs mTOR. En inhibant la phosphorylation dépendante de la kinase mTORC1 de la famille des protéines 4EBP, l’inhibition du mTOR améliore l’association 4EBP1 à l’eIF4E et, par conséquent, le démontage eIF4F¹⁵. Deux classes d’inhibiteurs mécanistes différents des kinases mTOR ont été testées : le.......

Discussion

La méthode décrite dans cet article utilise un test de complémentarité basé sur la luciferase pour surveiller quantitativement l’assemblage complexe eIF4F par mesure directe de l’interaction eIF4G-eIF4E dans les cellules vivantes. Nous avons fourni des détails pour l’utilisation du système de complémentarité eIF4E-eIF4G et nous avons également montré que le système est extrêmement précis dans la mesure de la dissociation médicamenteuse induite par 4EBP1 de l’interaction eIF4E-eIF4G¹⁶. Afin de faci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellules 293FT	Thermo Fisher Scientific	R70007
Microplaque de culture cellulaire 96 puits, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Titre cellulaire Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	non applicable
Finnpipette F2 Pipettes multicanaux 12 canaux 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Pipettes multicanaux 12 canaux 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Sérum réduit Mediun, sans rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	11058021
Agitateur orbital	Eppendorf	non applicable
&gamma ;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S