Évaluation morphologique et fonctionnelle des axones et de leurs Synapses pendant la mort d’Axon dans Drosophila melanogaster

Résumé

Ici, nous fournissons des protocoles pour effectuer trois simples essais de dégénérescence d’axone induits par les blessures (mort d’axone) dans Drosophila melanogaster pour évaluer la préservation morphologique et fonctionnelle des axones coupés et de leurs synapses.

Résumé

La dégénérescence d’axon est une caractéristique partagée dans la maladie neurodégénérative et lorsque les systèmes nerveux sont défiés par des forces mécaniques ou chimiques. Cependant, notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la dégénérescence de l’axone reste limitée. La dégénérescence causée par les blessures sert de modèle simple pour étudier comment les axones sectionné exécutent leur propre démontage (mort d’axone). Au cours des dernières années, une cascade de signalisation de la mort d’axone axon absorbée par l’évolution a été identifiée des mouches vers les mammifères, ce qui est nécessaire pour que l’axone séparé dégénère après une blessure. Inversement, la signalisation atténuée de la mort d’axone entraîne la conservation morphologique et fonctionnelle des axones coupés et de leurs synapses. Ici, nous présentons trois protocoles simples et récemment développés qui permettent l’observation de la morphologie axonale, ou fonction axonale et synaptique des axones coupés qui ont été coupés du corps cellulaire neuronal, dans la mouche des fruits Drosophila. La morphologie peut être observée dans l’aile, où une blessure partielle entraîne la mort d’axone côte à côte des axones de contrôle non blessés dans le même faisceau de nerf. Alternativement, la morphologie axonale peut également être observée dans le cerveau, où le faisceau entier de nerf subit la mort d’axone déclenchée par l’ablation d’antenne. La préservation fonctionnelle des axones coupés et de leurs synapses peut être évaluée par une approche optogénétique simple couplée à un comportement de toilettage post-synaptique. Nous présentons des exemples utilisant une mutation de perte de fonction de fil élevé et en exprimant sur-exprimant le dnmnat,tous deux capables de retarder la mort d’axone pendant des semaines à des mois. Fait important, ces protocoles peuvent être utilisés au-delà des blessures; ils facilitent la caractérisation des facteurs d’entretien neuronal, du transport axonal et des mitochondries axonales.

Introduction

L’intégrité morphologique des neurones est essentielle pour une fonction soutenue du système nerveux tout au long de la vie. La grande majorité du volume neuronal est prise par les axones^1,2; ainsi l’entretien à vie des axones particulièrement longs est un défi biologique et bioénergétique majeur pour le système nerveux. De multiples mécanismes de soutien axonaux-intrinsèques et glial-extrinsèques ont été identifiés, assurant la survie axonale à vie. Leur affaiblissement entraîne la dégénérescence d’axon³, qui est une caractéristique commune des systèmes nerveux étant contestés dans la maladie, et par des forces mécaniques ou chimiques^4,5. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents de la dégénérescence d’axone restent mal compris dans n’importe quel contexte, rendant le développement de traitements efficaces pour bloquer la perte d’axone difficile. Le développement de thérapies efficaces contre ces maladies neurologiques est important, car ils créent un énorme fardeau dans notre société⁶.

La dégénérescence causée par les blessures sert de modèle simple pour étudier comment les axones coupés exécutent leur propre démontage. Découverte et nommée d’après Augustus Waller en 1850, la dégénérescence wallérienne (DEO) est un terme générique qui comprend deux processus distincts et moléculairement séparables⁷. Tout d’abord, après une blessure axonale, les axones séparés de leur corps cellulaire exécutent activement leur propre autodestruction (mort axone) à travers une cascade de signalisation de la mort axone évolutivement conservée dans un jour après la blessure⁸. Deuxièmement, les gliales environnantes et les phagocytes spécialisés s’engagent et dégagent les débris axonaux qui en résultent dans un délai de trois à cinq jours. L’atténuation de la mort d’axone signalant des axones coupés qui restent conservés pendant des semaines^9,10,11,12, tandis que l’atténuation de l’engloutissement gliale culmine dans des débris axonaux qui persiste pendant des semaines dans vivo^13,14,15.

La recherche sur les mouches, les souris, les rats et les poissons zèbres a révélé plusieurs médiateurs évolutivement conservés et essentiels de la mort d’axone^{signalant 8}. Les mutants de la mort d’Axon contiennent des axones et des synapses coupés qui ne subissent pas la mort d’axone ; ils restent morphologiquement et fonctionnellement préservés pendant des semaines, en l’absence de support corporel cellulaire^{9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23}. La découverte et la caractérisation de ces médiateurs ont conduit à la définition d’une voie moléculaire exécutant la mort d’axone. Fait important, la signalisation de la mort d’axone est activée non seulement lorsque l’axone est coupé, écrasé ou étiré^24,25; il semble également être un contributeur dans des modèles animaux distincts de maladies neurologiques (par exemple, lorsque les axones dégénérer d’une manière indépendante des blessures⁴, mais avec une gamme de résultats bénéfiques^4,8). Par conséquent, comprendre comment la mort d’axone exécute la dégénérescence d’axone après blessure pourrait offrir des perspicacités au-delà d’un modèle simple de blessure ; il pourrait également fournir des cibles d’intervention thérapeutique.

La mouche des fruits Drosophila melanogaster (Drosophila) s’est avérée être un système inestimable pour la signalisation de la mort d’axone. La recherche à la mouche a révélé quatre gènes essentiels de mort d’axone conservés évolutionairement: highwire (hiw)^11,14, dnmnat^12,26, dsarm¹⁰ et axundead (axed)¹². La modification de ces médiateurs - mutations de perte de fonction de hiw, dsarm et hache,et surexposition de dnmnat - bloque puissamment la mort axone pour la durée de vie de la mouche. Tandis que les axones sauvages coupés subissent la mort d’axone dans un jour, les axones coupés et leurs synapses manquant de hiw, dsarm ou hacher restent non seulement morphologiquement, mais aussi fonctionnellement préservés pendant des semaines. Reste à déterminer si la préservation fonctionnelle peut également être obtenue grâce à des niveaux élevés de dnmnat.

Ici, nous présenterons trois protocoles simples et récemment développés pour étudier la mort d’axone (par exemple, la morphologie et la fonction des axones coupés et leurs synapses au fil du temps) en l’absence de soutien du corps cellulaire. Nous démontrons comment la mort atténuée d’axones entraîne des axones coupés qui sont morphologiquement préservés avec une mutation de perte de fonction de hiw (hiw^N) et comment la mort atténuée d’axone entraîne des axones et des synapses coupés qui restent fonctionnellement préservés pendant au moins 7 jours avec surexposition de dnmnat (dnmnat^OE). Ces protocoles permettent l’observation de la morphologie axonale et synaptique individuelle soit dans le système nerveux central, ou périphérique (CNS et PNS, respectivement)^13,14, tandis que la préservation fonctionnelle des axones coupés et leurs synapses dans le SNC peut être visualisée par l’utilisation d’une configuration optogénétique simple combinée avec le toilettage comme une lecture comportementale¹².

Protocole

1. Observation de la morphologie d’Axon pendant la mort d’Axon dans le PNS

1. Blessures à l’aile : blessure partielle des faisceaux d’essieux
   1. Utilisez 5 femelles vierges et 5 mâles du génotype droit(figure 4A,génération P₀₎ pour effectuer des croisements à température ambiante (RT). Passer P₀ en flacons neufs tous les 3 à 4 jours. Recueillir la progéniture adulte fraîchement éclos (F₁ génération) tous les jours et les vieillir pendant 7-14 jours.
   2. Anesthésiez les mouches sur des plaquettes de CO_2. Utilisez des micro ciseaux pour couper la veine antérieure de l’aile grossièrement au milieu de l’aile(figure 1A). Utilisez une aile pour la blessure et l’autre aile comme un contrôle non blessé assorti à l’âge. Appliquer une blessure par aile, et assurez-vous d’obtenir suffisamment d’ailes blessées (environ 15 ailes).
      REMARQUE : L’aile entière peut être coupée à travers, mais elle suffit pour couper seulement la veine antérieure d’aile. C’est la partie la plus forte de l’aile.
   3. Récupérez les mouches dans des flacons contenant de la nourriture.
2. Dissection et visualisation d’ailes
   1. Étendre 10 L d’huile de halocarbone 27 avec une pipette le long d’une glissière en verre entier(figure 1B).
   2. Couper les blessés, ainsi que l’aile de commande non blessée aux points de temps souhaités (p. ex., 1 ou 7 jours après une blessure). Utilisez des micro ciseaux pour couper, et des pincettes pour saisir l’aile. Monter maximum 4 ailes dans l’huile de halocarbone 27(figure 1B) et les couvrir d’une glissière de couverture.
   3. Imagez immédiatement l’aile à l’aide d’un microscope à disque tournant. Acquérir une série de sections optiques le long de l’axe z avec 0,33 m step-size et compresser z-stacks dans un seul fichier pour les analyses ultérieures.
      REMARQUE : Ne saisissez pas la veine antérieure de l’aile où les corps cellulaires et les axones sont logés. Attrapez l’aile au centre. Le tissu dans les ailes n’est pas fixe; garder le temps de monter des ailes à l’imagerie ces moins de 8 min.

Figure 1 : Observation de la morphologie de l’axon lors de la mort d’axone dans l’aile. (A) Aile volante schématique avec deux neurones sensoriels peu étiquetés GFP, qui sont également indiqués séparément ci-dessous. Le site des blessures et le champ d’observation sont indiqués. (B) Configuration schématique pour l’imagerie des ailes. Les ailes de commande blessées et non blessées (gris) sont montées dans de l’huile de halocarbone 27 (rouge) sur une glissière en verre (bleu clair) et recouvertes d’une glissière de couverture (noir). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Observation de la morphologie d’Axon et de Synapse pendant la mort d’Axon dans le SNC

1. Ablation d’Antennal : blessure des faisceaux entiers d’axone
   1. Utilisez 5 femelles vierges et 5 mâles du génotype droit(figure 5A,génération P₀₎ pour effectuer des croisements à RT. Pass P₀ en flacons neufs tous les 3-4 jours. Recueillir la progéniture adulte fraîchement éclos (F₁ génération) tous les jours et laissez-les vieillir pendant 7 jusqu’à 14 jours.
   2. Anesthésiez les mouches sur des plaquettes de CO_2. Utilisez des pincettes pour abler le segment droit des antennes de 3^rd pour une ablation unilatérale; ou à la fois gauche et droite 3^rd segments antennes pour l’ablation bilatérale(figure 2A-C). Cela permettra d’éliminer les corps cellulaires neuronaux étiquetés GFP, tandis que leurs projections axonales restent dans le SNC.
      REMARQUE : L’ablation d’Antennal coupe l’ensemble du faisceau d’axone. Si l’ablation unilatérale est effectuée, le faisceau d’axone sur le côté contralatéral (l’antenne non imlatée) sert de contrôle interne. Assurez-vous d’effectuer suffisamment d’ablations d’antenne (environ 15 animaux).
   3. Récupérez les mouches dans des flacons contenant de la nourriture.
2. Dissection cérébrale et visualisation des axones
   1. Mélanger la base d’élastomère en silicone (9 ml) et l’agent de durcissement (1 ml) dans un rapport de volume de 10:1. Transférer chaque mélange de 5 ml dans une plaque de culture tissulaire de 35 mm et réduire l’air introduit en mélangeant avec une agitation douce dans le capot de fumée pendant la nuit. Le mélange se solidifie dans les 24 h.
      REMARQUE : Les plaques de dissection ne doivent être préparées qu’une seule fois et peuvent être utilisées plusieurs fois.
   2. Anesthésiez les mouches sur les plaquettes de CO₂ et décapiter les têtes adultes à l’aide de deux pincettes aux points de temps souhaités (p. ex., 1 ou 7 jours après l’ablation des antennes). Utilisez une pince à épiler pour saisir le cou, et l’autre pince à épiler pour réparer le thorax. Tirez doucement le cou et la tête du thorax.
      REMARQUE : Laissez les têtes décapitées sur le tampon DE CO₂ jusqu’à ce que le nombre désiré soit atteint, mais assurez-vous de passer à l’étape suivante dans un délai de 30 min.
   3. Transférer toutes les têtes dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL contenant 1 ml de solution de fixation contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA) et 0,1 % De Triton X-100 en saline tamponnée par phosphate (PBS) à l’aide de pincettes qui ont été trempées dans la solution de fixation.
      REMARQUE : Les têtes volantes collent bien sur les pinces humides. Il est possible de transférer toutes les têtes facilement dans le tube de microcentrifuge.
   4. Fixer les têtes pendant 20 min avec une douce agitation à RT. Mettez le tube de microcentrifuge sur la glace, les têtes graviteront vers le fond du tube de microcentrifuge. Retirez le supernatant à l’aide d’une pipette et répétez cette procédure avec cinq lavages de 2 min avec 1 ml de tampon de lavage contenant 0,1% De Triton X-100 dans PBS avec une douce agitation à RT, pour supprimer la solution de fixation résiduelle.
      REMARQUE: Vidéos sur la façon de disséquer les cerveaux adultes Drosophila sont facilement disponibles²⁷.
   5. Transférer les têtes avec une pipette en verre dans une assiette de dissection remplie de tampon de lavage. Utilisez une pince à épilette pour saisir et tirer le proboscis de la tête, tout en tenant la tête avec l’autre pince à épilette. Cela laissera un trou si le proboscis était attaché à l’exosquelette.
   6. Utilisez deux pincettes pour enlever l’exosquelette entre le trou et chaque œil composé. Cela permettra d’ouvrir la structure de la tête avec les deux pincettes, et de gratter doucement le cerveau à l’intérieur.
   7. Nettoyez chaque cerveau en enlevant la trachée ou la graisse qui y est collée(figure 2D, dessus). Une fois que le cerveau est nettoyé, mettez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge contenant 1 ml de tampon de lavage sur la glace.
      REMARQUE : Les lobes optiques endommagés ou perdus n’affecteront pas le lobe olfactif au centre du cerveau(figure 2D, en haut).
   8. Remplacer le tampon de lavage par 1 ml de solution de fixation une fois que tous les cerveaux sont recueillis et accumulés au fond du tube de microcentrifuge. Fixer les cerveaux pendant 10 min avec basculer à RT, suivie de cinq lavages de 2 min en 1 ml de tampon de lavage avec bascule à RT.
   9. Appliquer les anticorps primaires (1:500) dans le tampon de lavage pendant la nuit avec des basculement à 4 oC, suivi de 10 lavages sur 2 h à l’aide de 1 mL de tampon de lavage avec bascule à RT.
   10. Appliquer des anticorps secondaires (1:500) dans le tampon de lavage 2 h avec basculer à RT et envelopper le tube de microcentrifuge dans du papier d’aluminium pour bloquer la lumière. Gardez le tube de microcentrifuge recouvert de papier d’aluminium pour le reste de la procédure. Appliquer dix lavages avec 1 ml de tampon de lavage sur 2 h avec bascule à RT.
   11. Retirez le supernatant et utilisez une seule goutte de réactif d’antifade pour couvrir le cerveau dans le tube de microcentrifuge. Incuber les cerveaux pendant au moins 30 min à 4 oC avant de les préparer au montage et à l’imagerie.
   12. Préparer une glissière de couverture, coller du ruban adhésif sur elle, et découper une forme de « T » de la bande(figure 2D, bas). L’espace qui en résulte sert de zone où le réactif d’antifade contenant le cerveau²⁸ sera canalisé dans, de préférence dans les deux chambres.
       REMARQUE : Utilisez une pointe de pipette de 20 à 200 l où 3 mm de la pointe ont été coupés pour élargir l’ouverture de la pipette. Cela permettra de pipette le cerveau contenant un réactif d’antifade. Couvrez soigneusement le cerveau avec une glissière de couverture.
   13. Utilisez l’argile pour préparer deux petits rouleaux uniformes. Assurez-vous que les rouleaux d’argile ne sont pas plus élevés que la hauteur d’une glissière en verre. Coller les rouleaux d’argile sur la glissière en verre(figure 2D, bas). Placez le sandwich à la glissière de couverture contenant le cerveau sur les rouleaux d’argile.
       REMARQUE : Les axones étiquetés GFP et leurs synapses sont situés à l’avant du cerveau. Il est donc plus facile de les imaginer de l’avant. Cependant, les cerveaux seront soit face vers le haut, ou face vers le bas sur le sandwich de glissière de couverture. Les rouleaux d’argile servent de porte-sandwich, et pendant l’imagerie, le sandwich peut être retourné à l’envers. Cela permettra d’acquérir des images de l’avant de chaque cerveau.
   14. Acquérir une série de sections optiques le long de l’axe z avec 1,0 m step-size à l’aide d’un microscope confocal, et compresser z-stacks dans un seul fichier pour les analyses ultérieures, pour évaluer le nombre de projections axonales restant intactes.

Figure 2 : Observation de la morphologie de l’axone et du synapse pendant la mort d’axone dans le cerveau. (A) Vue latérale d’une tête de mouche schématique avec des corps cellulaires étiquetés GFP, des axones et des synapses. (B) Vue avant de grossissement élevé des neurones récepteurs olfactifs étiquetés GPF et de leurs axones et synapses. Les corps cellulaires sont logés dans le segment des antennes de 3^rd, et leur projet d’axones dans le SNC. Les axones forment des synapses dans un glomerulus dans le lobe olfactif gauche, traversent la ligne médiane et forment des synapses dans les glomerulus sur le lobe olfactif contralatéral. (C) Exemples de têtes volantes avec ablation unilatérale d’antenne. Haut : Contrôle indemne. Milieu: Ablation du segment 3^rd antennes. En bas: Ablation des 2^nd (et donc aussi 3^rd) segment d’antenne. (D) Préparation cérébrale. Haut : Cerveau de mouche disséqué schématique avec lobes olfactifs indiqués et projections axonales dans le champ de vision. En bas : Configuration schématique pour l’imagerie cérébrale. Deux rouleaux d’argile (vert) sont montés sur un toboggan en verre (bleu clair), ils portent un sandwich à la glissière de couverture, qui contient des cerveaux de mouche (gris). Les cerveaux sont montés dans un réactif d’antifade (violet), entourés d’une bande de laboratoire (orange) et recouverts de deux toboggans de couverture (noir). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Toilettage induit par l’optogénétique comme readout pour Axon et Synapse Function

1. Configuration optogénétique
   1. Effectuez l’expérience optogénétique dans une pièce sombre. Assurez-vous que la configuration se compose d’un projecteur infrarouge de 850 nm (IR) LED pour éclairer les mouches dans l’obscurité(figure 3A), un projecteur CLIGNOTANT de LED rouge de 660 nm pour activer les neurones exprimant CsChrimson, et une caméra monochrome avec un filtre longpass de 700 nm, qui empêche l’enregistrement des clignotements de lumière rouge.
   2. Utilisez une imprimante 3D pour générer une minuscule chambre de comportement circulaire d’un diamètre de 1 cm, recouvrir d’une glissière de couverture et placer un émetteur de 860 nm couplé au projecteur LED rouge à côté de la chambre(figure 3B).
      REMARQUE : L’émetteur indique quand le projecteur LED rouge est allumé, activant ainsi les neurones.
   3. Montez les projecteurs LED et la caméra sur le dessus de la chambre (figure 3A, C).
   4. Activer les neurones par 10 clignotements Hz pendant 10 s. La durée de l’activation peut être ajustée en fonction de la conception expérimentale.
2. Préparation des mouches pour l’optogénétique
   1. Faire fondre les aliments à la mouche au micro-ondes. Après la refroidissement des aliments, avant la solidification, ajouter 1:100 de 20 mM tous trans-rétinaux dans l’éthanol (EtOH) à une concentration finale de 200 m. Bien mélanger, et verser la nourriture immédiatement dans des flacons vides.
      REMARQUE : Évitez d’ajouter tous les trans-rétinaux aux aliments chauds, ce qui pourrait entraîner une optogénétique moins efficace.
   2. Couvrir les flacons contenant des aliments solidifiés avec des bouchons ou des boules de coton. Envelopper les flacons de papier d’aluminium. Ensuite, entreposez les flacons contenant de la nourriture dans une pièce sombre et froide.
   3. Utilisez 5 femelles vierges et 5 mâles(figure 6A, génération P₀) à partir du génotype droit pour effectuer des croisements à RT. Pass P₀ en flacons neufs tous les 3-4 jours. Recueillir la progéniture adulte fraîchement éclose (génération F₁) sur une base quotidienne et laissez-les vieillir pendant 7 jusqu’à 14 jours dans des flacons recouverts d’aluminium contenant 200 m tous trans-rétinaux dans les aliments à mouches.
   4. Recueillir les mouches en les tapant à partir de flacons contenant de la nourriture dans une fiole vide sans nourriture. Refroidir la fiole dans de l’eau contenant de la glace pendant environ 30 s. Les mouches s’endormiront. Placez rapidement des mouches individuelles dans de petites chambres recouvertes d’une glissière de couverture(figure 3B).
      REMARQUE : Dès que les mouches se réchauffent, elles se réveillent. Il est crucial de répartir rapidement les mouches individuelles dans des chambres individuelles chacune. Évitez les tampons de CO₂ pour anesthésier les mouches, ce qui aura un impact sur leur comportement.
   5. Effectuer l’optogénétique pour obtenir le toilettage des antennes. Ici, le protocole se compose des intervalles suivants: 30 s où le feu rouge est absent, suivi de 10 s d’exposition aux feux rouges à 10 Hz. Répétez cette procédure trois fois au total, suivie d’un intervalle supplémentaire de 30 s où le feu rouge est absent^12,29,30.
      REMARQUE : Ce protocole peut être ajusté en fonction de la préférence expérimentale.
   6. Recueillir des mouches individuelles de chaque chambre sur des tampons de CO_2. Soumettez-les à des blessures aux antennes. Ablate à la fois la gauche et la droite 2 segments^{d’antennes nd} (figure 2C). Cela permettra d’enlever les corps cellulaires des neurones de l’organe de Johnston (JO), tandis que les projections axonales restent dans le SNC. Récupérez les mouches dans des flacons recouverts d’aluminium contenant 200 m tous trans-rétinaux.
      REMARQUE : Pour le toilettage des antennes induite par l’optogénétique, les corps sensoriels des cellules neuronales sont logés dans le segment des antennes de 2^nd (figure 2C).
   7. Aux points de temps correspondants (p. ex., 7 jours après l’ablation des antennes), soumettez les mouches à un autre essai de toilettage (retour à l’étape 3.2.4).

Figure 3 : Configuration optogénétique pour induire le toilettage comme lecture pour la fonction axone et synapse. (A) Illustration des composants assemblés requis pour l’optogénétique. Infrarouge (IR) projecteur LED, caméra et rouge LED projecteur (de gauche à droite, respectivement). Les composants, y compris une description détaillée, sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. (B) Illustration de vue supérieure d’une chambre de comportement comprenant un émetteur d’IR pour indiquer l’activation rouge de projecteur de LED. (C) Illustration d’une configuration de montage unique. Un total de trois configurations de montage sont nécessaires pour les deux projecteurs LED et la caméra, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Résultats

Ci-dessus, nous avons décrit trois méthodes pour étudier la morphologie et la fonction des axones coupés et de leurs synapses. La première méthode permet l’observation à haute résolution des axones individuels dans le PNS. Il nécessite des clones générés par la technique MARCM^14,31. Ici, nous avons effectué des croisements pour générer des clones MUTANTs de type sauvage et de haute fil MARCM ( figure4A). Une simple coupure au milieu de l’aile provoque des lésions axones de neurones logés distal (p. ex., du côté externe de l’aile), tandis que les neurones proximales (p. ex., entre le site coupé et le thorax) ne sont pas blessés. Cette approche permet d’observer la mort d’axone côte à côte des axones de contrôle non blessés dans le même faisceau de nerfs(figure 1A, figure 4B). Ici, nous avons utilisé un fond génétique résultant en un faible nombre de clones étiquetés GFP (par exemple, deux dans chaque expérience¹⁴). Nous présentons des exemples de 1 et 7 jours après des blessures d’axones de type sauvage, pour fournir des exemples d’axones de contrôle, d’axones subissant la mort d’axone, et de fragments axonaux étant effacés par les glia environnants, respectivement. En outre, nous avons répété des dommages axonaux dans les mutants de fil élevé où nous avons analysé les résultats 7 jours après la blessure.

Les ailes de contrôle non blessées abritent deux clones de type sauvage, donc deux axones de type sauvage étiquetés GFP(figure 4B, type sauvage, contrôle non blessé). Un jour après avoir coupé le milieu de l’aile par l’utilisation de micro ciseaux, la mort d’axone est induite dans les axones étiquetés GFP où les corps cellulaires sont distal au site coupé, tandis que les axones des corps cellulaires à abris proximaux servent de contrôle interne dans le même faisceau de nerfs(figure 4B, type sauvage, 1 jour après la blessure). Notez la trace de débris axonaux dans la partie supérieure indiquée par la flèche. 7 jours après une blessure axonale, les débris axonaux étiquetés GFP sont déblayés par les glia environnantes, tandis que les axones de contrôle non blessés étiquetés GFP restent dans le faisceau nerveux(figure 4B, type sauvage, 7 jours après une blessure, flèche). En revanche, les axones mutants à haut fil qui ont été sectionnés pendant 7 jours restent morphologiquement préservés, compatibles avec les résultats précédents^11,14 (figure 4B, highwire, 7 jours après la blessure, flèche). Ces résultats démontrent la puissante résolution visuelle de l’aile Drosophila. La mort d’Axon peut être observée côte à côte des contrôles non blessés dans le même faisceau de nerfs. Alors que les axones de type sauvage subissent la mort d’axone dans un jour après les blessures et que les débris qui en résultent sont déblayés dans les 7 jours, les mutants à fil élevé déficients de la mort d’axone restent morphologiquement préservés pendant 7 jours.

Figure 4 : Approche pour étudier la mort d’axone des axones sensoriels étiquetés GFP dans l’aile. (A) Croix schématiques pour générer des clones de type sauvage et de fil haut dans l’aile (génération P₀ et F_1, respectivement). Les femelles vierges sont à gauche, les mâles à droite. Voir Tableau des matériaux pour les détails du génotype. (B) Exemples de contrôle et d’axones étiquetés GFP blessés. Le champ de vision est indiqué dans(figure 1A). De gauche à droite : axones de contrôle de type sauvage non blessés, axones de type sauvage 1 jour après une blessure, axones de type sauvage 7 jours après une blessure, axones mutants à fil élevé 7 jours après une blessure, respectivement. Les flèches indiquent des axones coupés, barre d’échelle à 5 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La deuxième méthode décrit comment visualiser des faisceaux d’axone entiers projetant dans le SNC où ils forment des synapses, qui appartiennent à des neurones logés dans les antennes gauche et droite(figure 2A-C). Ici, nous avons effectué des croisements pour générer des clones MUTANTs de type sauvage et de haute fil MARCM ( figure5A). Les axones non blessés et étiquetés GFP et leurs synapses peuvent être visualisés de plusieurs jours à plusieurs semaines, en l’absence de blessures(figure 5B, type sauvage, contrôle non blessé). Alternativement, les animaux peuvent être soumis à^l’ablation du segment d’antenne de 3 rd, et les axones étiquetés GFP et leurs synapses peuvent être observés pendant un cours de temps pendant des heures à des jours. Nous nous sommes concentrés sur 7 jours après l’ablation des antennes, parce qu’à ce moment-là, les axones et leurs synapses ont subi la mort d’axone, et les débris qui en résultent sont déblayés par les glia environnantes. Si l’ablation unilatérale de l’antenne droite est effectuée, alors le faisceau d’axone droit est sectionné et se démontera et les débris résultants sont entièrement dégagés 7 jours après la blessure(figure 5B, type sauvage, ablation unilatérale, 7 jours après les blessures, flèches), compatible avec les résultats précédents¹³. Alternativement, les antennes droites et gauches peuvent être ablées, ce qui coupera à la fois les faisceaux d’axone, et 7 jours après la blessure, les axones et leurs synapses ont disparu(figure 5B, type sauvage, ablation bilatérale, 7 jours après la blessure, flèche). En revanche, l’ablation unilatérale des antennes droites chez les mutants à fil élevé entraîne des axones sectionnaux qui restent préservés 7 jours après une blessure, compatibles avec les résultats précédents^11,14 (figure 5B, highwire, ablation unilatérale, 7 jours après une blessure, flèche). Ces résultats démontrent que les axones de type sauvage coupés subissent la mort d’axone et que les débris qui en résultent sont déblayés dans les 7 jours, tandis que les mutants à fil élevé déficients de mort d’axone ne subissent pas la mort d’axone et restent morphologiquement préservés pendant 7 jours.

Figure 5 : Approche pour étudier la mort d’axone des axones sensoriels étiquetés GFP dans le cerveau. (A) Croix schématiques pour générer des clones de type sauvage et de fil élevé dans le cerveau (P₀ et F₁ génération, respectivement). Les femelles vierges sont à gauche, les mâles à droite. Voir Tableau des matériaux pour les détails du génotype. (B) Exemples de contrôle et d’axones étiquetés GFP blessés. De gauche à droite : contrôles de type sauvage non blessés, type sauvage 7 jours après l’ablation unilatérale d’antenne, type sauvage 7 jours après l’ablation bilatérale d’antenne, et mutants de fil élevé 7 jours après l’ablation unilatérale d’antennel, respectivement. Les flèches indiquent des faisceaux d’axones coupés, barre d’échelle à 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La troisième méthode permet d’observer la préservation fonctionnelle des axones coupés et de leurs synapses dans le SNC. Il s’appuie sur la manipulation d’un sous-ensemble de neurones JO logés dans le segment des antennes 2^nd qui sont suffisants pour induire le toilettage des antennes. L’expression d’un canalrhodopsin (CsChrimson) à décalage rouge dans les neurones JO, combinée à une supplémentation alimentaire de tous les trans-rétiniens, est suffisante pour susciter un simple comportement de toilettage post-synaptique lors de l’exposition à la lumière rouge^12,30. Ici, nous avons effectué des croisements pour générer des neurones JO de type sauvage, et les neurones JO sur-exprimant dnmnat (dnmnat^OE) (Figure 6A). Les mouches de type sauvage ou les mouches contenant des neurones JO avec la mort atténuée d’axone(dnmnat^OE), tous deux abritent un comportement de toilettage puissant avant la blessure. Cependant, 7 jours après une blessure (p. ex., ablation bilatérale du segment des antennes 2^nd), le toilettage ne parvient pas à être obtenu par l’optogénétique chez les mouches de type sauvage en raison de la dégénérescence causée par les blessures et de la dégénérescence synapse, tandis que les animaux atteints de décès atténué d’axone continuent de se toiletter(figure 6B, Film 1,2). La mort atténuée d’essieu est donc capable de préserver fonctionnellement les axones coupés et leurs synapses pendant 7 jours.

Figure 6 : Approche pour visualiser la fonction axonale et synaptique après l’axotomie. (A) Croisements schématiques pour générer le type sauvage et dnmnat sur-exprimant les neurones sensoriels JO (P₀ et F₁ génération, respectivement). Les femelles vierges sont à gauche, les mâles à droite. Voir Tableau des matériaux pour les détails du génotype. (B) Éhogrammes individuels du comportement de toilettage induits par l’optogénétique. Haut : éhogrammes individuels de type sauvage vole avant et 7 jours après une blessure (bleu). En bas : éhogrammes individuels de mouches sur-exprimant le dnmnat (dnmnat^OE) dans les neurones JO avant et 7 jours après la blessure (rouge). Chaque bac indique au moins 1 comportement de toilettage dans les 1 s. La ligne noire indique la somme de tous les bacs. (C) Quantification du comportement de toilettage. Les données sont affichées comme moyenne - déviation standard, p 'gt; 0.001 (ANOVA à sens unique, comparaison multiple avec le test post hoc de Tukey). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Film 1 : Comportement de toilettage de type sauvage représentatif obtenu par l’optogénétique avant et 7 jours après l’ablation d’antenne. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Film 2 : Comportement de toilettage représentatif obtenu par l’optogénétique chez les mouches sur-exprimant dnmnat dans les neurones JO avant et 7 jours après l’ablation d’antenne. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Les protocoles décrits ici permettent l’observation robuste et reproductible de la morphologie ainsi que la fonction des axones et de leurs synapses séparés de leur corps cellulaire à Drosophila. L’essai d’aile facilite l’observation de la mort d’axone côte à côte des axones de contrôle non blessés dans le PNS¹⁴, tandis que l’essai d’antenne facilite l’observation de faisceaux entiers de nerfs entiers des axones étiquetés GFP et leurs synapses, pour évaluer à la fois la morphologie et la fonction dans le cerveau (CNS)¹². Il y a des étapes critiques et certains avantages pour chaque approche d’étude de la morphologie qui doivent être prises en considération lors de la conception d’expériences.

Pour observer la morphologie de l’axon dans le PNS dans l’aile, des expériences peuvent être facilement réalisées, en raison de la transparence de l’aile : elle permet de contourner la dissection et l’immunohistochimie. Cependant, en raison du manque de fixation, les ailes doivent être images immédiatement après le montage¹⁴. Actuellement, deux pilotes Distincts Gal4 sont fréquemment utilisés, soit ok371Gal4 ou dpr1Gal4, et les deux références offrent des approches distinctes pour quantifier la dégénérescence^14,26. L’étiquetage clairsemé de quelques neurones est recommandé, en utilisant "Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM)"^14,31, que la résolution de la morphologie axonale est sans précédent. En revanche, l’observation des synapses n’est pas possible dans les ailes, ils sont situés dans le cordon de nerf ventral à l’intérieur du thorax des mouches. En outre, d’autres marqueurs axonaux ne peuvent pas être visualisés par immunohistochimie : la cuticule cireuse le rend impossible pour la diffusion des fixatifs et des anticorps dans le tissu sous-jacent.

Pour observer la morphologie de l’axone et de la synapse dans le SNC, des dissections cérébrales doivent être effectuées. Ils offrent l’avantage de visualiser des marqueurs axonaux et synaptiques supplémentaires par l’utilisation de l’immunohistochimie, et des synapses peuvent être observées aux côtés d’axones dans le même champ de vision^10,13. Une grande collection de neurones récepteurs olfactifs caractérisés (ORN) pilotes Gal4 est facilement disponible³², et souvent, OR22aGal4 est le conducteur de choix. Pour l’ablation des antennes, les corps cellulaires des neurones OR22a sont logés dans le segment 3^rd (figure 2B). Une quantification à base d’intensité de fluorescence est utilisée pour quantifier la dégénérescence des axones ou des synapses¹³. Inversement, les expériences prennent beaucoup de temps en raison de la dissection du cerveau et de la coloration des anticorps.

Pour visualiser la fonction axonale et synaptique après l’axotomie, l’optogénétique est utilisée pour déclencher le toilettage des antennes : elle sert de lecture pour la préservation fonctionnelle des axones sectionnés et de leurs synapses¹². Le circuit de toilettage et les pilotes sensoriels, inter- et motorneuron Gal4 correspondants ont été soigneusement^{décrits 29,30}. GMR60E02Gal4 étiquette un sous-ensemble de neurones sensoriels d’organe de Johnston (JO), qui sont nécessaires et suffisants pour le toilettage^29,30. Pour l’ablation des antennes, les corps cellulaires des neurones JO sont logés dans le segment des antennes 2^nd (figure 2B). Une configuration optogénétique peut facilement être construite à partir de zéro, ou une configuration existante ajustée. Il est important de noter que des expériences doivent être réalisées dans une pièce sombre, et les mouches ainsi visualisées avec un projecteur INFRAROUGE (IR) LED. Lors de l’utilisation de CsChrimson comme un canal, il est crucial de fournir à la nourriture avec tous les trans-rétinaux et un projecteur LED rouge pour activer les neurones JO²⁹. Alternativement, les canaux bleu sensibles à la lumière et un projecteur LED bleu, ou le canal TrpA1 et la température peuvent être utilisés pour l’activation neuronale^29,33. La quantification du comportement de toilettage a déjà été décrite^12,29.

Lorsque ces essais sont utilisés pour étudier spécifiquement la mort d’axone, il est important de noter que le phénotype de la préservation morphologique ou fonctionnelle devrait être robuste au fil du temps. Il y a des cas où la mort d’axone mène à un phénotype cohérent mais moins prononcé dans la conservation morphologique^34,35, et si un tel phénotype se traduit dans la conservation fonctionnelle reste à déterminer.

Des phénotypes de mort d’axone ont également été observés dans les neurones pendant le développement des larves de Drosophila, où les nerfs ont été écrasés plutôt que blessés^11,23. Ici, nous nous sommes particulièrement concentrés sur les neurones adultes Drosophila qui ont terminé le développement. Dans ce contexte, l’utilisation d’une interférence d’ARN³⁶, ou crispR/Cas9³⁷ spécifique aux tissus, peut facilement être mise en œuvre. Fait important, les techniques ci-dessus peuvent être utilisées dans un contexte indépendant de mort axone: ils facilitent la caractérisation des facteurs d’entretien neuronal³⁸, transport axonal³⁹, les changements axonaux de mitochondries dépendantes par l’âge⁴⁰, et la morphologie des mitochondries axonales⁴¹.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince à épiler (haute précision, ultra fine)	EMS	78520-5	Ablation antennaire
Ciseaux MicroPoint (tranchant de 5 mm)	EMS	72933-04	Lésion à l’aile
1,5 mL microtube à centrifuger	Eppendorf	30120086.0000
Boîte de culture tissulaire 35mm	Sarstedt	83.3900
Lames de couverture, épaisseur 1	Thermo Scientific& commerce;
lames de microscope Superfrost	Thermo Scientific&trade ;
Caméra CMOS USB 2.0 haute sensibilité, 1280 x 1024, Global Shutter	Thorlabs	DCC1240M	Configuration de la caméra
SM1 Bague de retenue pour & Oslash ; Tubes et montures d’objectif 1 »	Thorlabs	SM1RR
25mm 1/1,2 » Monture C Objectif	Tamron	M112FM25 Adaptateur avec
filetages externes M27 x 0,5 et filetages internes SM1 Thorlabs		SM1A36
Lentille à condenseur asphérique, & Oslash ; 25 mm, f=20,1 mm, NA=0,60, ARC : 650-1050 nm	Thorlabs	ACL2520U-B
Ø ; Filtre passe-long premium 25,0 mm, longueur d’onde de coupure : 700 nm	Coupleur Thorlabs	FELH0700
SM1 (1.035 »-40), filetages externes, 0,5 » de long	Thorlabs	SM1T2
SM1 Tube d’objectif sans filetage externe, 1 » de long, deux anneaux de retenue inclus	Thorlabs	SM1M10
850 nm, 900 mW (min) LED montée, 1200 mA	Thorlabs	M850L3	Projecteur LED IR
Coupleur SM1 (1.035 »-40), filetages externes, 0,5 » de long	Thorlabs	SM1T2
Tube d’objectif SM1 sans filetage externe, 2 » de long, deux anneaux de retenue inclus	Thorlabs	SM1M20
Lentille de condenseur asphérique, & Oslash ; 25 mm, f=20,1 mm, NA=0,60, ARC : 650-1050 nm	Thorlabs	ACL2520U-B
Ø ; Filtre passe-long haut de gamme de 25,0 mm, longueur d’onde de coupure : 850 nm Bague	de retenue Thorlabs	FELH0850
SM1 pour Ø ; Tubes et montures d’objectif 1"	Thorlabs	SM1RR
660 nm, 940 mW (Min) Monté LED, 1200 mA	Thorlabs	M660L4	Projecteur LED rouge
Lentille de condenseur asphérique, & Oslash ; 25 mm, f=20,1 mm, NA=0,60, ARC : 650-1050 nm	Coupleur Thorlabs	ACL2520U-B
SM1 (1.035 »-40), filetages extérieurs, 0,5 » de long	Thorlabs	SM1T2
SM1 Tube d’objectif sans filetage externe, 2 » de long, deux anneaux de retenue inclus	Thorlabs	SM1M20
15 V, 2,4 A Bloc d’alimentation avec connecteur jack 3,5 mm pour un cube K ou T	Thorlabs	KPS101	LED contrôle
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current	Thorlabs	LEDD1B
150 mm x 300 mm x 12,7 mm Planche d’essai en aluminium, M6 Robinets à double densité	Thorlabs	MB1530/M	Mount base
Ø ; Support de poteau universel de 12,7 mm, vis à oreilles de verrouillage à ressort, L = 75 mm	Monture Thorlabs	UPH75/M	, 3x (LED IR, LED rouge, came)
et Oslash ; Bague collectrice 1,20" pour tubes d’objectif SM1 et tubes d’extension à monture C, robinet M4	Thorlabs	SM1RC/M
& Oslash ; Tige optique de 12,7 mm, acier inoxydable, vis de réglage M4, taraud M6, L = 150 mm	Thorlabs	TR150/M
Ø ; Tige optique 12,7 mm, acier inoxydable, vis de réglage M4, taraud M6, L = 40 mm	Thorlabs	TR40/M
Pince à angle droit pour & Oslash ; Poteaux 1/2", 5 mm Vis d’assemblage hexagonale	Thorlabs	RA90/M
M6 x 1.0, longueur 16 mm, paquet de 25	SH6MS16 Thorlabs		pour montage sur socle
USB-6001 14 bits 20 kéch./s E/S multifonctions et NI-DAQmx	National Instruments	782604-01	Contrôleur de projecteur LED rouge
20k Ohm 1 Gang Potentiomètre linéaire à montage sur panneau	TT Electronics/BI	P230-2EC22BR20K	fintuner pour indicateur
IR (860nm) émetteur, 100 mA radial	Osram	475-1365-ND	voyant de lumière rouge
	-	-	Divers
All-trans rétinien	Sigma	R2625
Éthanol absolu	Vwr	20821.296
Huile halocarbure 27	Sigma	H8773
Mowiol	Merk	81381
Paraformaldéhyde	Sigma	F8775
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma	P5493
Sylgard 184 base en élastomère de silicone	Dow Corning Corp	4019862
Sylgard 184 agent de durcissement en élastomère de silicone	Dow Corning Corp	4019862
Triton X-100	Sigma	T8787
Poulet anti-GFP	anticorps Rockland	600-901-215	Anticorps
Goat Dylight anti-Poulet	Abcam	ab96947
FM7a, B	BDSC	RRID :	X chromosome
FRT19A[hs-neo]	BDSC	RRID :BDSC_1709
hiw[&Delta ; N]	BDSC	RRID :BDSC_51637
hs-FLP[12]	BDSC	RRID :BDSC_1929
tub-Gal80[LL1]	BDSC	RRID :BDSC_5132
w[1118]	BDSC	RRID :BDSC_3605
20xUAS-IVS-CsChrimson ::mVenus	BDSC	RRID :BDSC_55135	2nd chromosome
5xUAS-Gal4[12B]	Kyoto	RRID :Kyoto_108492
5xUAS-HA ::d nmnat	BDSC	RRID :BDSC_39702
5xUAS-mCD8 ::GFP[LL5]	BDSC	RRID :BDSC_5134
ase-FLP[2d]	Freeman laboratory	Neukomm et al., 2014 (PNAS)
CyO	BDSC	RRID :
dpr1-Gal4	BDSC	RRID :BDSC_25083
OR22a-Gal4	BDSC	RRID :BDSC_9952
ey-FLP[6]	BDSC	RRID :BDSC_5577	3rd chromosome
GMR60E02-Gal4	BDSC	RRID :BDSC_39250
TM3,Sb,e	BDSC	RRID :BDSC_3644