Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Lindsey  K. Sablatura; Kristin  M. Bircsak; Peter Shepherd; Karla Queiroz; Mary  C. Farach-Carson; Pamela  E. Constantinou; Anthony Saleh; Nora Navone; Daniel A. Harrington

doi:10.3791/60872

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Article de méthode

Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

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DOI :

10.3791/60872

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5 décembre 2020

Lindsey K. Sablatura¹ , Kristin M. Bircsak² , Peter Shepherd³ , Karla Queiroz⁴ , Mary C. Farach-Carson¹^,⁵^,⁶ , Pamela E. Constantinou¹^,⁷ , Anthony Saleh² , Nora Navone³ , Daniel A. Harrington¹^,⁵^,⁶

¹Department of BioSciences, Rice University, ²Mimetas US Inc, ³Department of Genitourinary Medical Oncology Research, Division of Cancer Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, ⁴Mimetas B.V., ⁵Department of Bioengineering, Rice University, ⁶Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center, ⁷Sheikh Ahmed Center for Pancreatic Cancer Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Résumé

Les xénogreffes d’origine patiente (PDX), générées lors de la résécation du tissu tumoral du patient, sont greffées directement en souris immunocompromisées, demeurent biologiquement stables, préservant ainsi les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques, ainsi que l’hétérogénéité de la tumeur originale. Toutefois, l’utilisation de ces modèles pour effectuer une multitude d’expériences, y compris le dépistage des drogues, est prohibitif tant en termes de coût que de temps. Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) sont largement considérés comme des plates-formes dans lesquelles les cellules cancéreuses conservent leur intégrité biologique grâce aux interactions biochimiques, à la morphologie et à l’architecture. Notre équipe a une vaste expérience de la culture des cellules PDX in vitro à l’aide de matrices 3D composées d’acide hyaluronique (HA). Afin de séparer les cellules stromal fibroblastes de souris associées aux PDX, nous utilisons la culture de rotation, où les cellules stromal adhèrent à la surface des plaques traitées par culture tissulaire tandis que les cellules tumorales DISSOCIées pdx flottent et s’associent en grappes multicellulaires. Les cellules simples, souvent mortes, qui présentent un défi dans la collecte de clusters PDX viables pour l’encapsulation en aval dans les hydrogels pour la culture cellulaire 3D, flottent également dans le surnatant. Afin de séparer ces cellules simples des grappes cellulaires vivantes, nous avons utilisé la centrifugation de gradient d’étape de densité. Le protocole décrit ici permet l’épuisement des cellules célibataires non viables de la population saine des grappes cellulaires qui seront utilisées pour d’autres expérimentations in vitro. Dans nos études, nous intégrons les cultures 3D dans des plaques microfluidiques qui permettent la perfusion des médias pendant la culture. Après avoir évalué les cultures qui en résultent à l’aide d’un test de viabilité basé sur l’image fluorescente des cellules purifiées par rapport aux cellules non purifiées, nos résultats montrent que cette étape de séparation supplémentaire a considérablement réduit le nombre de cellules non viables de nos cultures.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, le domaine de la recherche sur le cancer a démontré un regain d’enthousiasme pour les xénogreffes dérivées du patient (PDX) comme outil d’évaluation de la dépendance aux voies cancéreuses et de la susceptibilité^{aux médicaments 1}. Les modèles PDX les plus courants sont établis par implantation sous-cutanée ou orthotopique de cellules tumorales humaines — un fragment tumoral, un groupe de cellules dérivées de tumeurs dissociées ou un échantillon de cellules tumorales circulantes isolées (CTC) — dans un hôte de rongeurs. Si la tumeur « prendre » est un succès, les cellules xénogreffe proliférera, vasculariser, et ....