Un modèle de souris de sarcome de tissus mous incomplètement réséqué pour l’essai (Neo)adjuvant thérapies

La chirurgie reste l’option de traitement principale pour de nombreuses tumeurs solides¹, y compris le sarcome des tissus mous^2,3. Malgré l’amélioration des techniques de chirurgie du cancer, et des combinaisons avec des thérapies (néo)adjuvant, il ya encore un risque élevé de rechute du cancer et de métastases suite à la résection primaire de tumeur^4,5. Dans le sarcome des tissus mous, les rechutes se produisent particulièrement locorégionally, au site de la chirurgie, ayant pour résultat la morbidité et la mortalité accrues. Dans le cadre clinique, il peut être difficile d’obtenir des marges suffisamment larges (par exemple, en raison de contraintes anatomiques), ce qui entraîne une résection incomplète et une récurrence tumorale subséquente⁶. Le stress chirurgical et le processus ultérieur de cicatrisation des plaies sont connus pour créer un microenvironnement de tumeur immunosuppressive favorable à la répétition de tumeur^7,8. Par conséquent, la découverte et le développement de nouvelles thérapies pour le sarcome des tissus mous, en particulier les immunothérapies, devraient idéalement tenir compte de la réponse chirurgicale de guérison des plaies.

La plupart des études précliniques pour les thérapies adjuvantes sont initialement effectuées à l’aide de modèles de souris syngénéiques ou xénotransplantes sous-cutanées, sans incorporer le stress chirurgical et la réponse de guérison des plaies^9,10. Par conséquent, nous avons développé un modèle syngeneic sous-cutané de sarcome de tissu mou de souris incorporant la résection chirurgicale incomplète. WEHI 164 cellules de fibrosarcome sont inoculés sous-cutanéement, et une fois que les tumeurs sont établies, nous enlevons 50-75% du volume de tumeur (Figure 1A-E). Les tumeurs se repoussent constamment de la tumeur restante. Ce modèle permet de tester des thérapies adjuvantes tout en considérant l’effet du stress chirurgical et de la cicatrisation des plaies. Des modèles chirurgicaux similaires de résection incomplète ont été utilisés dans un certain nombre d’études par plusieurs groupes et se sont avérés reproductibles et efficaces^11,12,13. Ici, nous fournissons une description détaillée de ce protocole.

Les animaux utilisés dans ces expériences ont été obtenus auprès du Centre de ressources animales (Perth, Australie-Occidentale). Les animaux ont été maintenus dans des conditions standard exemptes d’agents pathogènes à l’installation du Nord du Harry Perkins Institute of Medical Research (Perth, Australie-Occidentale). Toutes les expériences ont été réalisées suivant le protocole approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Institut Harry Perkins. Des souris BALB/c de 8-12 semaines ont été employées dans ces expériences. La lignée cellulaire du fibrosarcome WEHI 164 a été obtenue auprès de CellBank Australia (Westmead, NSW).

1. Inoculation des cellules

1. Préparation des cellules et des animaux
   1. Assurez-vous que la ligne de cellule est maintenue dans le support recommandé. Par exemple, maintenir la ligne cellulaire WEHI 164 dans le Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen complété par 2 mM L-glutamine, 10% sérum bovin fœtal, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL pénicillin, et 100 μg/mL streptomycine.
      REMARQUE : Cellules de passage au moins 3 et jusqu’à 5 fois après avoir été retirées du stockage cryogénique. Pour assurer une viabilité cellulaire optimale, les cellules doivent être divisées lorsqu’elles sont comprises entre 70 et 80 % de confluentes. Les lignées cellulaires tumorales doivent être testées pour le mycoplasme, car l’infection peut altérer la croissance cellulaire et influencer la réponse immunitaire in vivo.
   2. Un jour avant l’inoculation, raser les souris sur le flanc inférieur droit à l’aide de tondeuses.
      REMARQUE : Des souris femelles BALB/c, âgées de 8 à 12 semaines, de poids normal (16 -22 grammes) ont été utilisées dans cette expérience.
   3. Le jour de l’inoculation, récolter les cellules WEHI 164 lorsque 70-80% confluent par trypsinisation.
      1. Apirate le milieu de culture des flacons de culture tissulaire, puis ajouter la solution tamponnée de phosphate stérile (1x PBS), pour enlever les traces restantes de sérum bovin foetal (FBS).
      2. Apirate le PBS des flacons de culture tissulaire. Ajouter 3 ml de trypsine de 0,05 % (pour une fiole T75) puis faire tourbillonner la fiole de sorte que toute la surface de la fiole avec des cellules soit recouverte de trypsine.
      3. Incuber la fiole à 37 °C, incubateur de CO₂ à 5 % pendant 3 min. Vérifiez périodiquement les cellules en tapant sur les côtés de la fiole pour voir si les cellules se sont délogées.
      4. Retirez les flacons de l’incubateur de culture cellulaire et ajoutez 5 ml de support complété par FBS pour neutraliser la trypsine.
         REMARQUE : Ne laissez pas les cellules dans la trypsie plus longtemps que nécessaire, car cela peut endommager les cellules et conduire à une faible viabilité cellulaire.
      5. Suspension pipet plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse conique.
      6. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
   4. Laver les cellules trois fois en 1x PBS.
      1. Resuspender les cellules dans 50 mL de 1x PBS stérile et laver les cellules par la suspension de cellules de canalisation de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
      2. Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans 15 mL de 1x PBS stérile. Laver les cellules par la suspension cellulaire de canalisation de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
      3. Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans exactement 10 mL de 1x PBS stérile. Laver les cellules à l’étape 1.1.4.2 et transférer une petite quantité (environ 100 μL) de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse pour le comptage. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
   5. Déterminez le numéro de cellule à l’aide de la méthode d’exclusion bleue Trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Resuspender les cellules dans 1x PBS stériles à une concentration de 5 x 10⁶ cellules/mL. Gardez la suspension cellulaire sur la glace.
      NOTE : La viabilité des cellules tumorales devrait être égale ou supérieure à 80 % pour assurer la croissance reproductible de tumeur.
2. Inoculation sous-cutanée
   1. Mélanger soigneusement la suspension cellulaire et remplir une seringue d’une aiguille de 26 G avec 100 μL de suspension cellulaire (5 x 10⁵ cellules) en 1x PBS stérile. Répéter le mélange des cellules avant de charger la seringue suivante.
      REMARQUE : Gardez les cellules sur la glace tout au long de la procédure pour maintenir leur viabilité.
   2. Retenez la souris de manière appropriée, assurant l’accès au flanc inférieur droit. Inoculer la souris sous-cutanéement sur le flanc bas droit rasé.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’inoculation n’est pas dans le péritoine en soulevant légèrement l’aiguille, qui doit être visible sous la peau. Une boule de bulle devrait se former sous la peau après l’inoculation.
   3. Surveiller les souris selon les besoins de l’approbation éthique applicable et effectuer la résection chirurgicale lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50 mm².

2. Résection chirurgicale partielle de la tumeur

REMARQUE : Ce protocole nécessite DEUX chercheurs; l’un pour les interventions chirurgicales (SURGEON), et l’autre pour la surveillance de la souris (ASSISTANT).

1. Configuration de la chirurgie
   1. Le jour 12 après l’inoculation, lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50 mm², les souris dose avec 100 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine s.c. dans le éraflures du cou, 30 minutes avant la chirurgie.
   2. Installez la zone chirurgicale avec un coussin chauffant recouvert d’un manteau de banc et installez un cône de nez pour l’anesthésie. Stériliser les outils chirurgicaux avant l’utilisation, et entre chaque animal à l’aide d’un stérilisateur de perles thermiques, permettant aux outils de refroidir avant l’utilisation. Demandez à l’équipement chirurgical suivant de nettoyer et de le toucher : chlorhexidine, écouvillon, gaze, gel pour les yeux, deux forceps incurvés, ciseaux, applicateur de clip, démaquillant, pinces de recharge (Figure 2A, 2B).
   3. Chauffer la chambre chauffante à 37 °C et mettre en place un autre coussin chauffant pour la récupération (figure 2C). Placez les outils stérilisés sur une surface stérile comme les coussinets autoclaved.
2. Anesthésie
   1. Placez la souris dans la chambre d’induction et anesthésiez la souris avec 4% d’isoflurane (4% en oxygène à 100% à un débit de 1 L/min) jusqu’à ce que le taux de respiration ralentisse à environ 60 respirations par minute (1 par seconde) (cela prend habituellement <1 min).
      REMARQUE : Ne laissez pas la souris dans la chambre trop longtemps, car cela peut entraîner une asphyxie et la mort. N’ont qu’une souris sous anesthésie à la fois.
   2. Transférer la souris sur le bloc thermique sur la table de chirurgie, placer la souris avec son nez dans le cône de nez et maintenir l’état anesthésique avec 3-4% isoflurane dans 100% d’oxygène à un débit de 0,5 L/min. Surveiller le taux de respiration pour s’assurer que la profondeur de l’anesthésie est maintenue.
      REMARQUE : L’ASSISTANT doit surveiller la respiration de la souris tout au long de la chirurgie pour s’assurer que le niveau correct d’anesthésie est maintenu. Réduisez la concentration anesthésique si la respiration devient trop lente ou augmentez la concentration si la profondeur de l’anesthésie est trop faible. Si la souris commence à haleter, retirer la souris du cône de nez, diminuer la concentration anesthésique, et attendre jusqu’à ce que la respiration se normalise avant de placer sur le cône de nez à nouveau.
   3. Effectuez un « test de pincement » et un « test réflexe cornéen »¹⁴ pour s’assurer que la souris est entièrement anesthésiée avant de commencer la chirurgie.
      REMARQUE : Le mouvement de n’importe quelle partie de la souris est une indication que la souris n’est pas entièrement anesthésiée. L’animal doit immédiatement recevoir un anesthésique supplémentaire en augmentant la concentration anesthésique.
   4. Couvrez les yeux de la souris d’une petite quantité de gel ophtalmique pour éviter la sécheresse oculaire.
3. Intervention chirurgicale (SURGEON)
   1. Prélever la zone chirurgicale 3 fois avec la chlorhexidine alcoolique. À l’aide de forceps et d’une paire de ciseaux, faire une incision droite de 1 cm le long du côté dorsal, à 3 mm de la tumeur (Figure 3A, 3B).
      REMARQUE : La normalisation de l’incision à 1 cm dans chaque souris (à l’aide d’une règle) permet une évaluation uniforme de la cicatrisation des plaies entre souris. Localiser l’incision à 3 mm de la tumeur permet une thérapie adjuvante intratumorale ultérieure sans fuite de la plaie.
   2. À l’aide de pinces à épiler, retirez la facia et le tissu adipeux sous-cutané entre la tumeur et le péritoine. La tumeur sous-cutanée est normalement attachée au côté de la peau.
   3. Ouvrez la plaie en tenant doucement la peau sur le côté porteur de la tumeur à l’aide de pinces à épiler, et « nvertir » la tumeur de sorte qu’elle soit visible à l’extérieur (Figure 3C, 3D).
      NOTE: La section de la tumeur à débulked doit être le plus proche de l’ouverture, d’avoir assez de peau pour fermer la plaie. Veillez à ne pas couper la peau lors de l’ablation de la tumeur.
   4. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper la capsule tumorale de la moitié pour enlever, à partir de la base de la tumeur la plus proche de l’ouverture.
   5. Pour 50% de chirurgie debulk, couper à travers le milieu de la tumeur. À l’aide de forceps incurvés, ramasser la section de la tumeur à enlever (50%); ramasser tous les restes de la zone débulked.
   6. Pour 75% debulk, effectuer un débulk de tumeur de 50% comme dans la partie 2.3.5 ci-dessus. Puis couper dans la moitié des 50% restants de la tumeur et ramasser 25% de la tumeur, en utilisant des forceps incurvés comme décrit ci-dessus.
4. Fermeture du site chirurgical
   1. Placez la tumeur restante de nouveau sous la peau, et utilisant des forceps, tirez les volets de peau ensemble et alignez la peau le long de la blessure.
   2. Maintenez la peau ensemble à 5 mm du bord de la plaie et utilisez des pinces chirurgicales pour refermer la plaie, en commençant par le côté le plus proche des forceps. Appliquez autant de clips que nécessaire pour vous assurer qu’aucun tissu sous-jacent n’est exposé. En général, trois à quatre clips sont appliqués avec des écarts de 2 mm entre les clips.
      REMARQUE : Si des clips ne sont pas bien appliqués, supprimez-le à l’aide d’un dissolvant de clip et remplacez-le par de nouveaux clips.
5. Récupération de souris (ASSISTANT)
   1. Permettre aux souris de récupérer en les mettant dans la chambre chauffante (37 °C).
   2. Placez la cage de la souris sur le bloc de chaleur. Surveillez les souris dans la chambre chauffante jusqu’à ce qu’elles se soient remises de l’anesthésique (éveillée et marchante) puis remettez les souris dans la cage. Laissez la cage sur le coussin chauffant pendant 10 minutes supplémentaires, jusqu’à ce que les souris soient devenues plus actives.
   3. Donnez aux souris des aliments humides et mous. Surveillez les souris 1 heure après la chirurgie pour la récupération et assurez-vous que les clips restent en place. Assurez-vous que la cage est à moitié sur / la moitié hors de la plate-forme de chaleur pour permettre aux animaux d’auto-réguler la température pendant qu’ils sont sans surveillance.
   4. Dose de souris avec 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL sous-cutanéement dans le col), 6-8 heures après la chirurgie (à la fin de la journée). Surveiller les souris tôt le lendemain matin et doser à nouveau les souris avec 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL sous-cutanéement dans les éraflures du cou). Donnez plus de nourriture humide au besoin.
   5. Surveillez les souris tous les jours pendant les sept prochains jours. Les clips peuvent être supprimés après sept jours à l’aide du dissolvant de clip.
6. Traitement adjuvant ou néoadjuvant
   1. Traiter les souris de façon périopératoire avec une thérapie (néo)adjuvante à tout moment, selon le traitement de l’intérêt.
   2. Par exemple, traiter les souris avec une dose de 100 μg d’anti-CTLA-4 intrapéritoneally (i.p.) le jour 15 après l’inoculation, ou avec trois doses de 200 μg anti-PD-1 i.p. les jours 15, 17 et 19 après inoculation.
7. Contrôles expérimentaux
   1. Lors de l’utilisation de ce modèle pour évaluer les effets de l’inflammation / cicatrisation des plaies, envisager d’utiliser les groupes témoins suivants: 1) Contrôle sans chirurgie (les traitements peuvent encore être administrés intratumoral); 2) Contrôle de chirurgie de sham : Une incision chirurgicale est faite dans la peau ; la tumeur est manipulée et exposée, mais aucun tissu de tumeur n’est enlevé ; la blessure est fermée avec des clips.

La croissance tumorale à une taille de 50 mm2 est une taille idéale pour le débulk partiel. La résection chirurgicale incomplète de 50 mm2 tumeurs entraîne une repousse reproductible de 100% (n=5) des tumeurs en l’absence d’immunothérapie adjuvante (Figure 4A). Nous avons ensuite utilisé le modèle pour tester les immunothérapies adjuvantes à l’aide d’anticorps contre les molécules de point de contrôle Cytotoxique T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4) et Programmed Death Receptor 1 (PD-1). Le traitement des souris atteintes d’anti-CTLA-4 ou d’anti-PD-1 a donné lieu à un taux de guérison de 80 % et de 25 % (n=4-5 par groupe), respectivement(figure 4B, 4C). La réponse avec anti-PD-1 offre l’occasion de tester de nouvelles combinaisons pour améliorer encore le taux de réponse.

Figure 1 : Diagramme schématique de la résection chirurgicale partielle de la tumeur. (A) Les souris BALB/c sont inoculées avec 5 x 105 cellules WEHI-164 sur le flanc inférieur droit. (B) Lorsque la tumeur atteint 50 mm2, la chirurgie peut commencer. (C) La tumeur est partiellement réséquée (50 % montré). (D) Le site chirurgical est fermé avec des clips. (E) La thérapie adjuvante peut être administrée, par voie intraveineuse, intrapéritoneally (montrée) ou intratumoralement dans la zone de blessure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Images représentatives de la chirurgie mise en place. (A) Toute une image de la chirurgie mise en place montrant les outils chirurgicaux (énumérés à l’étape 2.1) et la machine anesthésique. (B) Une image instantanée de la table chirurgicale montrant tous les matériaux à portée de main. (C) Une chambre chauffante et un coussin chauffant pour la récupération de la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Images représentatives de la technique partielle de débulk de tumeur. (A) Une souris entièrement anesthésiée avec une tumeur de 50 mm2 dans la taille avant la chirurgie. (B) Site d’incision à 3 mm de la tumeur; Incision de 1 cm. (C-D) Ouverture de la plaie en tenant doucement la peau sur le côté porteur de tumeur à l’aide de pinces à épiler, et « nverr » la tumeur de sorte qu’elle soit visible à l’extérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Repousse de tumeur suivant la résection et l’immunothérapie incomplètes de tumeur. (A)Courbes de repousse de tumeur des tumeurs partiellement réséquées de WEHI-164 en l’absence d’immunothérapie adjuvante. (B-C) Repousse tumorale après chirurgie et traitement adjuvant avec anti-CTLA-4 (B) ou anti-PD1 (C). La ligne pointillée indique le jour de la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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