Method Article

Un modèle de souris de sarcome de tissus mous incomplètement réséqué pour l’essai (Neo)adjuvant thérapies

DOI:

10.3791/60882

⸱

July 28th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3College of Science, Health, Engineering and Education, Murdoch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, nous décrivons un modèle de souris de résection chirurgicale incomplète du sarcome de tissu mou pour tester (neo)thérapies adjuvantes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chirurgie est souvent le premier traitement pour de nombreuses tumeurs solides. Cependant, les rechutes locales se produisent fréquemment suivant la résection primaire de tumeur, en dépit des thérapies adjuvantes ou néo-adjuvantes. Ceci se produit lorsque les marges chirurgicales sont insuffisamment sans tumeur, ce qui entraîne des cellules cancéreuses résiduelles. D’un point de vue biologique et immunologique, la chirurgie n’est pas un événement nul; l’environnement de cicatrisation des plaies est connu pour induire des voies pro- et anti-tumorigenic. En conséquence, les modèles précliniques pour le développement de médicaments visant à prévenir la rechute locale devraient intégrer la résection chirurgicale lors de l’essai de nouvelles thérapies (néo)adjuvantes, pour modéliser les paramètres cliniques chez les patients traités par la chirurgie.

Ici, nous décrivons un modèle de souris de résection chirurgicale incomplète du sarcome de tissu mou de WEHI 164 qui permet l’essai des thérapies (néo)adjuvantes dans le arrangement d’une réponse de guérison de blessure. Dans ce modèle, 50% ou 75% de la tumeur est enlevée, laissant derrière elle quelques tissus cancéreux in situ pour modéliser la maladie résiduelle brute après la chirurgie dans le cadre clinique. Ce modèle permet de tester des thérapies dans le contexte de la chirurgie tout en considérant la réponse de guérison des plaies, qui peut affecter l’efficacité des traitements (néo)adjuvants. La résection chirurgicale incomplète résulte dans la repousse reproductible de la tumeur dans toutes les souris en l’absence de thérapie adjuvante. Le traitement adjuvant avec le blocus de point de contrôle a des résultats dans la repousse réduite de tumeur. Ce modèle est donc approprié pour tester des thérapies dans le contexte de la chirurgie de débulking et sa réponse de guérison des plaies associée et peut être étendu à d’autres types de cancer solide.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chirurgie reste l’option de traitement principale pour de nombreuses tumeurs solides1, y compris le sarcome des tissus mous2,3. Malgré l’amélioration des techniques de chirurgie du cancer, et des combinaisons avec des thérapies (néo)adjuvant, il ya encore un risque élevé de rechute du cancer et de métastases suite à la résection primaire de tumeur4,5. Dans le sarcome des tissus mous, les rechutes se produisent particulièrement locorégionally, au site de la chirurgie, ayant pour résultat la morbidité et la mortalité accrues. Dans le cadre clinique, il peut être difficile d’obtenir des marges suffisamment larges (par exemple, en raison de contraintes anatomiques), ce qui entraîne une résection incomplète et une récurrence tumorale subséquente6. Le stress chirurgical et le processus ultérieur de cicatrisation des plaies sont connus pour créer un microenvironnement de tumeur immunosuppressive favorable à la répétition de tumeur7,8. Par conséquent, la découverte et le développement de nouvelles thérapies pour le sarcome des tissus mous, en particulier les immunothérapies, devraient idéalement tenir compte de la réponse chirurgicale de guérison des plaies.

La plupart des études précliniques pour les thérapies adjuvantes sont initialement effectuées à l’aide de modèles de souris syngénéiques ou xénotransplantes sous-cutanées, sans incorporer le stress chirurgical et la réponse de guérison des plaies9,10. Par conséquent, nous avons développé un modèle syngeneic sous-cutané de sarcome de tissu mou de souris incorporant la résection chirurgicale incomplète. WEHI 164 cellules de fibrosarcome sont inoculés sous-cutanéement, et une fois que les tumeurs sont établies, nous enlevons 50-75% du volume de tumeur (Figure 1A-E). Les tumeurs se repoussent constamment de la tumeur restante. Ce modèle permet de tester des thérapies adjuvantes tout en considérant l’effet du stress chirurgical et de la cicatrisation des plaies. Des modèles chirurgicaux similaires de résection incomplète ont été utilisés dans un certain nombre d’études par plusieurs groupes et se sont avérés reproductibles et efficaces11,12,13. Ici, nous fournissons une description détaillée de ce protocole.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les animaux utilisés dans ces expériences ont été obtenus auprès du Centre de ressources animales (Perth, Australie-Occidentale). Les animaux ont été maintenus dans des conditions standard exemptes d’agents pathogènes à l’installation du Nord du Harry Perkins Institute of Medical Research (Perth, Australie-Occidentale). Toutes les expériences ont été réalisées suivant le protocole approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Institut Harry Perkins. Des souris BALB/c de 8-12 semaines ont été employées dans ces expériences. La lignée cellulaire du fibrosarcome WEHI 164 a été obtenue auprès de CellBank Australia (Westmead, NSW).

1. Inoculation des cellules

  1. Préparation des cellules et des animaux
    1. Assurez-vous que la ligne de cellule est maintenue dans le support recommandé. Par exemple, maintenir la ligne cellulaire WEHI 164 dans le Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen complété par 2 mM L-glutamine, 10% sérum bovin fœtal, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL pénicillin, et 100 μg/mL streptomycine.
      REMARQUE : Cellules de passage au moins 3 et jusqu’à 5 fois après avoir été retirées du stockage cryogénique. Pour assurer une viabilité cellulaire optimale, les cellules doivent être divisées lorsqu’elles sont comprises entre 70 et 80 % de confluentes. Les lignées cellulaires tumorales doivent être testées pour le mycoplasme, car l’infection peut altérer la croissance cellulaire et influencer la réponse immunitaire in vivo.
    2. Un jour avant l’inoculation, raser les souris sur le flanc inférieur droit à l’aide de tondeuses.
      REMARQUE : Des souris femelles BALB/c, âgées de 8 à 12 semaines, de poids normal (16 -22 grammes) ont été utilisées dans cette expérience.
    3. Le jour de l’inoculation, récolter les cellules WEHI 164 lorsque 70-80% confluent par trypsinisation.
      1. Apirate le milieu de culture des flacons de culture tissulaire, puis ajouter la solution tamponnée de phosphate stérile (1x PBS), pour enlever les traces restantes de sérum bovin foetal (FBS).
      2. Apirate le PBS des flacons de culture tissulaire. Ajouter 3 ml de trypsine de 0,05 % (pour une fiole T75) puis faire tourbillonner la fiole de sorte que toute la surface de la fiole avec des cellules soit recouverte de trypsine.
      3. Incuber la fiole à 37 °C, incubateur de CO2 à 5 % pendant 3 min. Vérifiez périodiquement les cellules en tapant sur les côtés de la fiole pour voir si les cellules se sont délogées.
      4. Retirez les flacons de l’incubateur de culture cellulaire et ajoutez 5 ml de support complété par FBS pour neutraliser la trypsine.
        REMARQUE : Ne laissez pas les cellules dans la trypsie plus longtemps que nécessaire, car cela peut endommager les cellules et conduire à une faible viabilité cellulaire.
      5. Suspension pipet plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse conique.
      6. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
    4. Laver les cellules trois fois en 1x PBS.
      1. Resuspender les cellules dans 50 mL de 1x PBS stérile et laver les cellules par la suspension de cellules de canalisation de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
      2. Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans 15 mL de 1x PBS stérile. Laver les cellules par la suspension cellulaire de canalisation de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
      3. Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans exactement 10 mL de 1x PBS stérile. Laver les cellules à l’étape 1.1.4.2 et transférer une petite quantité (environ 100 μL) de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse pour le comptage. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.
    5. Déterminez le numéro de cellule à l’aide de la méthode d’exclusion bleue Trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Resuspender les cellules dans 1x PBS stériles à une concentration de 5 x 106 cellules/mL. Gardez la suspension cellulaire sur la glace.
      NOTE : La viabilité des cellules tumorales devrait être égale ou supérieure à 80 % pour assurer la croissance reproductible de tumeur.
  2. Inoculation sous-cutanée
    1. Mélanger soigneusement la suspension cellulaire et remplir une seringue d’une aiguille de 26 G avec 100 μL de suspension cellulaire (5 x 105 cellules) en 1x PBS stérile. Répéter le mélange des cellules avant de charger la seringue suivante.
      REMARQUE : Gardez les cellules sur la glace tout au long de la procédure pour maintenir leur viabilité.
    2. Retenez la souris de manière appropriée, assurant l’accès au flanc inférieur droit. Inoculer la souris sous-cutanéement sur le flanc bas droit rasé.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’inoculation n’est pas dans le péritoine en soulevant légèrement l’aiguille, qui doit être visible sous la peau. Une boule de bulle devrait se former sous la peau après l’inoculation.
    3. Surveiller les souris selon les besoins de l’approbation éthique applicable et effectuer la résection chirurgicale lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50 mm2.

2. Résection chirurgicale partielle de la tumeur

REMARQUE : Ce protocole nécessite DEUX chercheurs; l’un pour les interventions chirurgicales (SURGEON), et l’autre pour la surveillance de la souris (ASSISTANT).

  1. Configuration de la chirurgie
    1. Le jour 12 après l’inoculation, lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50 mm2, les souris dose avec 100 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine s.c. dans le éraflures du cou, 30 minutes avant la chirurgie.
    2. Installez la zone chirurgicale avec un coussin chauffant recouvert d’un manteau de banc et installez un cône de nez pour l’anesthésie. Stériliser les outils chirurgicaux avant l’utilisation, et entre chaque animal à l’aide d’un stérilisateur de perles thermiques, permettant aux outils de refroidir avant l’utilisation. Demandez à l’équipement chirurgical suivant de nettoyer et de le toucher : chlorhexidine, écouvillon, gaze, gel pour les yeux, deux forceps incurvés, ciseaux, applicateur de clip, démaquillant, pinces de recharge (Figure 2A, 2B).
    3. Chauffer la chambre chauffante à 37 °C et mettre en place un autre coussin chauffant pour la récupération (figure 2C). Placez les outils stérilisés sur une surface stérile comme les coussinets autoclaved.
  2. Anesthésie
    1. Placez la souris dans la chambre d’induction et anesthésiez la souris avec 4% d’isoflurane (4% en oxygène à 100% à un débit de 1 L/min) jusqu’à ce que le taux de respiration ralentisse à environ 60 respirations par minute (1 par seconde) (cela prend habituellement <1 min).
      REMARQUE : Ne laissez pas la souris dans la chambre trop longtemps, car cela peut entraîner une asphyxie et la mort. N’ont qu’une souris sous anesthésie à la fois.
    2. Transférer la souris sur le bloc thermique sur la table de chirurgie, placer la souris avec son nez dans le cône de nez et maintenir l’état anesthésique avec 3-4% isoflurane dans 100% d’oxygène à un débit de 0,5 L/min. Surveiller le taux de respiration pour s’assurer que la profondeur de l’anesthésie est maintenue.
      REMARQUE : L’ASSISTANT doit surveiller la respiration de la souris tout au long de la chirurgie pour s’assurer que le niveau correct d’anesthésie est maintenu. Réduisez la concentration anesthésique si la respiration devient trop lente ou augmentez la concentration si la profondeur de l’anesthésie est trop faible. Si la souris commence à haleter, retirer la souris du cône de nez, diminuer la concentration anesthésique, et attendre jusqu’à ce que la respiration se normalise avant de placer sur le cône de nez à nouveau.
    3. Effectuez un « test de pincement » et un « test réflexe cornéen »14 pour s’assurer que la souris est entièrement anesthésiée avant de commencer la chirurgie.
      REMARQUE : Le mouvement de n’importe quelle partie de la souris est une indication que la souris n’est pas entièrement anesthésiée. L’animal doit immédiatement recevoir un anesthésique supplémentaire en augmentant la concentration anesthésique.
    4. Couvrez les yeux de la souris d’une petite quantité de gel ophtalmique pour éviter la sécheresse oculaire.
  3. Intervention chirurgicale (SURGEON)
    1. Prélever la zone chirurgicale 3 fois avec la chlorhexidine alcoolique. À l’aide de forceps et d’une paire de ciseaux, faire une incision droite de 1 cm le long du côté dorsal, à 3 mm de la tumeur (Figure 3A, 3B).
      REMARQUE : La normalisation de l’incision à 1 cm dans chaque souris (à l’aide d’une règle) permet une évaluation uniforme de la cicatrisation des plaies entre souris. Localiser l’incision à 3 mm de la tumeur permet une thérapie adjuvante intratumorale ultérieure sans fuite de la plaie.
    2. À l’aide de pinces à épiler, retirez la facia et le tissu adipeux sous-cutané entre la tumeur et le péritoine. La tumeur sous-cutanée est normalement attachée au côté de la peau.
    3. Ouvrez la plaie en tenant doucement la peau sur le côté porteur de la tumeur à l’aide de pinces à épiler, et « nvertir » la tumeur de sorte qu’elle soit visible à l’extérieur (Figure 3C, 3D).
      NOTE: La section de la tumeur à débulked doit être le plus proche de l’ouverture, d’avoir assez de peau pour fermer la plaie. Veillez à ne pas couper la peau lors de l’ablation de la tumeur.
    4. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper la capsule tumorale de la moitié pour enlever, à partir de la base de la tumeur la plus proche de l’ouverture.
    5. Pour 50% de chirurgie debulk, couper à travers le milieu de la tumeur. À l’aide de forceps incurvés, ramasser la section de la tumeur à enlever (50%); ramasser tous les restes de la zone débulked.
    6. Pour 75% debulk, effectuer un débulk de tumeur de 50% comme dans la partie 2.3.5 ci-dessus. Puis couper dans la moitié des 50% restants de la tumeur et ramasser 25% de la tumeur, en utilisant des forceps incurvés comme décrit ci-dessus.
  4. Fermeture du site chirurgical
    1. Placez la tumeur restante de nouveau sous la peau, et utilisant des forceps, tirez les volets de peau ensemble et alignez la peau le long de la blessure.
    2. Maintenez la peau ensemble à 5 mm du bord de la plaie et utilisez des pinces chirurgicales pour refermer la plaie, en commençant par le côté le plus proche des forceps. Appliquez autant de clips que nécessaire pour vous assurer qu’aucun tissu sous-jacent n’est exposé. En général, trois à quatre clips sont appliqués avec des écarts de 2 mm entre les clips.
      REMARQUE : Si des clips ne sont pas bien appliqués, supprimez-le à l’aide d’un dissolvant de clip et remplacez-le par de nouveaux clips.
  5. Récupération de souris (ASSISTANT)
    1. Permettre aux souris de récupérer en les mettant dans la chambre chauffante (37 °C).
    2. Placez la cage de la souris sur le bloc de chaleur. Surveillez les souris dans la chambre chauffante jusqu’à ce qu’elles se soient remises de l’anesthésique (éveillée et marchante) puis remettez les souris dans la cage. Laissez la cage sur le coussin chauffant pendant 10 minutes supplémentaires, jusqu’à ce que les souris soient devenues plus actives.
    3. Donnez aux souris des aliments humides et mous. Surveillez les souris 1 heure après la chirurgie pour la récupération et assurez-vous que les clips restent en place. Assurez-vous que la cage est à moitié sur / la moitié hors de la plate-forme de chaleur pour permettre aux animaux d’auto-réguler la température pendant qu’ils sont sans surveillance.
    4. Dose de souris avec 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL sous-cutanéement dans le col), 6-8 heures après la chirurgie (à la fin de la journée). Surveiller les souris tôt le lendemain matin et doser à nouveau les souris avec 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL sous-cutanéement dans les éraflures du cou). Donnez plus de nourriture humide au besoin.
    5. Surveillez les souris tous les jours pendant les sept prochains jours. Les clips peuvent être supprimés après sept jours à l’aide du dissolvant de clip.
  6. Traitement adjuvant ou néoadjuvant
    1. Traiter les souris de façon périopératoire avec une thérapie (néo)adjuvante à tout moment, selon le traitement de l’intérêt.
    2. Par exemple, traiter les souris avec une dose de 100 μg d’anti-CTLA-4 intrapéritoneally (i.p.) le jour 15 après l’inoculation, ou avec trois doses de 200 μg anti-PD-1 i.p. les jours 15, 17 et 19 après inoculation.
  7. Contrôles expérimentaux
    1. Lors de l’utilisation de ce modèle pour évaluer les effets de l’inflammation / cicatrisation des plaies, envisager d’utiliser les groupes témoins suivants: 1) Contrôle sans chirurgie (les traitements peuvent encore être administrés intratumoral); 2) Contrôle de chirurgie de sham : Une incision chirurgicale est faite dans la peau ; la tumeur est manipulée et exposée, mais aucun tissu de tumeur n’est enlevé ; la blessure est fermée avec des clips.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La croissance tumorale à une taille de 50 mm2 est une taille idéale pour le débulk partiel. La résection chirurgicale incomplète de 50 mm2 tumeurs entraîne une repousse reproductible de 100% (n=5) des tumeurs en l’absence d’immunothérapie adjuvante (Figure 4A). Nous avons ensuite utilisé le modèle pour tester les immunothérapies adjuvantes à l’aide d’anticorps contre les molécules de point de contrôle Cytotoxique T Lymph...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous fournissons un protocole pour un modèle de souris de résection chirurgicale incomplète du sarcome de tissu mou pour tester des thérapies péri-opératoires. Nous avons également normalisé l’incision chirurgicale pour permettre l’évaluation de la cicatrisation de blessure entre les souris suivant le traitement.

Le placement de tumeur est une partie importante de ce protocole. Nous avons opté pour un modèle de tumeur sous-cutanée pour permettre un accès chirurgical facile au site de tumeur et...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucune divulgation.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu par des subventions de la Sock it au Sarcome! Fondation, l’Australian and New Zealand Sarcoma Association, la Children’s Leukemia & Cancer Research Foundation et Perpetual Philanthropy. W.J.L est soutenu par une bourse Simon Lee et une bourse de recherche du National Health and Medical Research Council et du Cancer Council WA.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Seringue à insuline de calibre 26 0,5 mLBecton Dickinson, Australie326769Aucun
2-MercaptoethanolLife Technologies Australia Pty Ltd21985023Aucun
Machine à gaz anesthétiqueDarvall Vet, AustralieSKU : 2848Aucun
Anti-CTLA-4BioXcell, États-UnisBE0164Aucun
Anti--1BioXcell, États-UnisBP0273Aucun Chlorhydrate
de buprénorphine injectable, 0,3 mg/mLRB healthcare UK Limited, UK55175Ordonnance
Chlorhexidine Surgical Scrub 4 %Perigo Australia, AustraliaCHL01449F(scrubAucun
Sérum de bovin fœtalCellSera, AustralieAU-FBS-PGAucun
Forceps Fine 10,5 cmMaison chirurgicale, Australie-OccidentaleCC74110None
Forceps Fine 12 cm Maison de chirurgie dentelée, Australie-OccidentaleCC74212Aucun
Pince Halsted 14 cmMaison de chirurgie, Australie-OccidentaleCD01114None
Chambre de chauffageDatesand Ltd, UKMini-ThermacageNone
HEPES (1M)Life Technologies Australia Pty Ltd15630080
None IsofluraneHenry Schein Animal Health, AustralieSKU : 29405Ordonnance
Pommade Oculaire LubrifianteAlconn/aAucun
Pénicilline/streptomycine 1000XLife Technologies Australia Pty Ltd15140122None
Solution tamponnée au phosphate 10xLife Technologies Australia Pty Ltd70013-032Aucun
Reflex 7mm ClipsAble scientifique, AustralieAS59038None
Reflex 7mm Wound Clip ApplicatorAble scientific, AustralieAS59036None
Reflex Wound Clip RemoverAble scientific, AustralieAS59037Aucun
Rongeur Qube Anesthésie Circuit de respirationDarvall Vet, Australie#7885Aucun
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Moyen + L-glutamineLife Technologies Australia Pty Ltd21870092Aucun
Ciseaux Iris STR 11 cmMaison chirurgicale, Australie-OccidentaleKF3211Aucun
Ciseaux Iris STR 9 cmMaison chirurgicale, Australie-OccidentaleJH4209Aucun
Petite chambre d’inductionDarvall Vet, AustralieSKU : 9630Aucun
TrypLE express 1xLife Technologies Australia Pty Ltd12604-021Aucun
Germinator 500 Stérilisateur à billes de verreCellpoint Scientific Inc., États-Unis5-1460-DK

References

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