Nous avons développé une méthodologie efficace pour l’échantillonnage et l’analyse des signaux d’odeur afin de comprendre comment ils peuvent être utilisés dans la communication animale. En particulier, nous utilisons la microextraction en phase solide de l’espace de tête couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse pour analyser les composants volatils des odeurs animales et des marquages olfacteurs.
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Article de méthode
Échantillonnage et analyse des signaux olfacteurs d’animaux
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous avons développé une méthodologie efficace pour l’échantillonnage et l’analyse des signaux d’odeur, en utilisant la microextraction en phase solide headspace couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse, pour comprendre comment ils peuvent être utilisés dans la communication animale. Cette technique permet l’analyse semi-quantitative des composants volatils des sécrétions odorantes en permettant la séparation et l’identification provisoire des composants de l’échantillon, suivie de l’analyse des rapports de surface de pointe pour rechercher des tendances qui pourraient signifier des composés pouvant être impliqués dans la signalisation. Les principaux points forts de l’approche actuelle sont la gamme de types d’échantillons qui peuvent être analysés; l’absence de nécessité pour toute préparation ou extraction d’échantillons complexes; la capacité de séparer et d’analyser les composants d’un mélange; l’identification des composants détectés; et la capacité de fournir des renseignements semi-quantitatifs et potentiellement quantitatifs sur les composants détectés. La principale limite de la méthodologie concerne les échantillons eux-mêmes. Étant donné que les composants d’intérêt particulier sont volatils et qu’ils pourraient facilement être perdus ou leurs concentrations modifiées, il est important que les échantillons soient stockés et transportés de manière appropriée après leur prélèvement. Cela signifie également que les conditions de stockage et de transport des échantillons sont relativement coûteuses. Cette méthode peut être appliquée à une variété d’échantillons (y compris l’urine, les matières fécales, les cheveux et les sécrétions d’odeurs odorantes). Ces odeurs sont constituées de mélanges complexes, se produisant dans une gamme de matrices, et nécessitent donc l’utilisation de techniques pour séparer les composants individuels et extraire les composés d’intérêt biologique.
Introduction
On sait très peu de choses sur les changements chimiques qui sous-tendent les signaux olfactifs chez les animaux1,également en raison des défis méthodologiques dans l’enregistrement et la quantification des profils chimiques volatils des odeurs2. Il existe plusieurs pièges potentiels lorsque vous travaillez avec des matrices chimiques très complexes; ceux-ci incluent lors de l’échantillonnage et de l’analyse des échantillons d’odeur3.
Au Rosalind Franklin Science Center de l’Université de Wolverhampton, nous entreprenons l’analyse des odeurs et des marques olfactives pour comprendre comment elles peuvent être utilisées par les animaux. Nous combinons la semi-industrie avec l’écologie comportementale, l’endocrinologie et la cytologie pour améliorer notre compréhension du rôle joué par les signaux olfactifs dans la communication animale.
Nous avons développé une méthodologie, puis analysé les odeurs et les marques d’une variété d’espèces, y compris plusieurs primates non humains (c.-à-d. lémuriens couronnés, lémuriens à collerette rouge, macaques japonais, babouins olives, chimpanzés) et d’autres mammifères (c.-à-d. chats, vaches). Nous avons recueilli et analysé une variété d’échantillons, y compris l’urine, les matières fécales, les cheveux et les sécrétions d’odeurs odorantes. Ces odeurs et marques olfactives sont constituées de mélanges complexes de composés et, par conséquent, toute méthodologie utilisée pour leur analyse doit inclure une certaine forme de technique de séparation. Comme illustré, ils se produisent également dans une gamme de matrices qui nécessite l’utilisation de techniques pour extraire les composants d’intérêt.
Des études antérieures de Vaglio et coll.4 et d’autres auteurs5 ont utilisé l’extraction dynamique de l’espace libre (DHS) avec chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), tandis que l’extraction directe par solvant6 et les extractions complexes par solvant7 ont également été utilisées. En particulier, l’échantillonnage dynamique de l’espace libre implique la purge de l’espace libre avec un volume connu de gaz inerte qui élimine finalement tous les composés volatils à l’exception de ceux montrant une forte affinité pour la matrice de l’échantillon (par exemple, les composés polaires dans les échantillons aqueux).
Pour la méthodologie actuelle, nous avons adopté la technique de la microextraction en phase solide headspace (HS-SPME) couplée à la GC-MS. En particulier, nous avons développé et amélioré la méthodologie déjà utilisée par Vaglio et al. dans son précédent laboratoire GC-MS8,9,10.
Les techniques d’extraction sans solvant sont très efficaces pour analyser de petits composés hautement volatils (qui autrement peuvent être facilement perdus d’un échantillon) car ces méthodes immobilisent les composés sur un support en phase solide et stable. Le HS-SPME utilise une fibre recouverte d’un polymère adsorbant pour capter les composés volatils dans l’espace libre de l’échantillon ou pour extraire des composés dissous par immersion dans un fluide biologique aqueux11. Le revêtement polymère ne lie pas fortement les composés, donc en chauffant dans le port d’injection du GC, ils peuvent être éliminés. Cette méthode est plus puissante que les techniques d’extraction par solvant et aussi plus efficace que le DHS.
Dans l’approche actuelle, les échantillons sont contenus dans des flacons en verre. Ces flacons sont réchauffés à une température de 40 °C pour simuler la température corporelle de l’animal afin de favoriser les composants volatils de la marque olflée pour occuper l’espace de tête du flacon. Une fibre SPME, recouverte de 65 μm de matériau sorbant polydiméthylsiloxane/divinylbenzène (PDMS/DVB), est exposée à l’environnement de l’espace libre et les composants volatils de l’échantillon sont adsorbés sur la fibre. Lors du chauffage de la fibre dans le port d’entrée d’un GC-MS, les composants volatils sont désorbés de la fibre, puis séparés par le GC. Des modèles de fragmentation spectrale de masse sont obtenus pour chaque composant à l’aide de la MS. En comparant ces spectres de masse avec des bases de données spectrales de masse, il peut être possible d’identifier provisoirement les composants de la marque olfique. Grâce à l’utilisation d’un auto-échantillonneur, nous sommes en mesure d’analyser plusieurs échantillons par lots de manière cohérente.
Étant donné que chaque type de fibre SPME a une affinité différente avec les produits chimiques polaires, la fibre est généralement choisie en fonction de la polarité et / ou du poids moléculaire des composés chimiques cibles. De plus, les conditions de GC sont modifiées en fonction du type de colonne de GC et des caractéristiques des composés chimiques cibles.
Cette technique permet l’analyse semi-quantitative des composants volatils des marques olfactif en permettant la séparation et l’identification provisoire des composants de l’échantillon, suivie de l’analyse des rapports de surface de crête pour rechercher des tendances qui pourraient signifier des composants du marquage olfactif pouvant être impliqués dans la signalisation.
Les principales forces de l’approche actuelle sont les suivantes :
- Plage de types d’échantillons qui peuvent être analysés.
- Aucune préparation ou extraction d’échantillon complexe n’est requise.
- La possibilité d’analyser des composants volatils.
- La possibilité de séparer les composants d’un mélange.
- Pour pouvoir identifier les composants détectés.
- La capacité de fournir des informations semi-quantitatives et potentiellement quantitatives sur les composants détectés.
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Protocole
1. Prélèvement d’échantillons
- Échantillonner les odeurs qui sont l’une des suivantes:
- Recueillir spontanément libéré par les sujets habitués à l’étude (p. ex. primates de zoo) au moyen d’un marquage olfactif sur du papier filtre stérile (p. ex. sécrétions d’odeurs olfactive) ou directement dans des flacons (p. ex. urine).
- Recueillir en frottant les cotons-tiges stériles après l’entraînement des sujets de l’étude en utilisant l’entraînement de renforcement positif.
- Recueillir en frottant les cotons-tiges stériles après sédation des sujets de l’étude.
- Placez les échantillons dans des flacons stériles en verre clair coiffés de vis de 10 mL et scellez-les avec des bouchons à vis incorporant des septa FTFE / silicone. Conservez-les immédiatement à -20 °C.
REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser un équipement de protection individuelle propre, comme des gants en nitrile; les changer fréquemment; éviter tout contact direct avec la peau avec les échantillons et les flacons. Il est préférable d’utiliser des flacons flambant neufs; cependant, en cas de flacons usagés, il est essentiel de pré-nettoyer les flacons, puis d’utiliser le même protocole. - Prenez des blancs environnementaux chaque fois que des marques olfactives sont collectées. Par exemple, prélever le support d’échantillonnage (p. ex. papier filtre ou écouvillon) et un flacon d’espace libre qui sont exposés à l’environnement pendant l’échantillonnage.
2. Préparation de l’échantillon
- Préparer les échantillons sur le terrain en coupant avec une lame un carré d’environ 10 mm à partir d’un papier filtre marqué par l’odeur, ou de la tête de l’écouvillon, et en le plaçant dans un flacon de 10 mL surmonté d’un espace pour la tête.
- Une fois que chaque échantillon a été préparé, jeter ou nettoyer la lame utilisée pour couper le support d’échantillonnage à l’aide d’une lingette antibactérienne appropriée et/ou de l’alcool et sécher soigneusement.
- Conserver tous les échantillons à -20 °C.
REMARQUE: Préféré à -20 °C ou autrement aussi bas que possible sur le terrain.
3. Préparation à l’analyse
- Retirer les échantillons du congélateur et laisser réchauffer naturellement à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Configurez la méthode d’analyse sur le GC-MS comme suit :
- Pour les conditions d’analyse SPME, suivez les instructions du fabricant pour conditionner les fibres SPME avant la première utilisation : précondition des fibres (260 °C pendant 5 min), incubation de l’échantillon (40 °C pendant 2 min), temps d’extraction (15 min), temps de désorption (2 min) et post-condition des fibres (260 °C pendant 20 min).
- Utilisez les conditions de CG suivantes : colonne (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), température de l’injecteur (270 °C), débit (1 mL/min), mode d’injection (splitless), profil du four GC (45 °C pendant 2 min; 4 °C/min à 170 °C; 20 °C/min à 300 °C), ligne de transfert msd (280 °C).
Remarque : pour améliorer la cohérence entre les temps de rétention de l’échantillon, la méthode analytique est le temps de rétention verrouillé). - Utilisez les conditions msd suivantes : retard du solvant (2,5 min) et plage de balayage (29 à 400 amu).
Remarque : une plage de 10 à 400 a été utilisée dans les protocoles précédents4.
- Assurez-vous que l’alimentation en gaz de purge de l’unité de conditionnement des fibres est activée.
REMARQUE: Il est essentiel que l’assemblage SPME soit correctement installé dans l’auto-échantillonneur et qu’il soit aligné sur les plateaux de l’échantillonneur automatique, l’unité de conditionnement de la fibre et le port d’entrée GC. Un alignement incorrect pourrait entraîner des dommages ou la destruction de la fibre SPME.
4. Analyse
- Placez un flacon d’espace libre vide (pour agir comme un blanc système) dans la première position du plateau de l’échantillonneur automatique GC-MS. Placez l’ébauche environnementale dans la deuxième position du plateau de l’échantillonneur automatique. Placez les échantillons à analyser dans les positions suivantes du bac d’auto-échantillonnage.
- Créez une séquence analytique pour analyser chaque échantillon dans le bac à échantillons.
- Dans l’écran d’accueil de MassHunter, sélectionnez Séquence | Séquence de chargement.
- Complétez le tableau des séquences pour tous les blancs et échantillons en insérant les informations appropriées. Enregistrez la table de séquence terminée.
REMARQUE: Les informations exactes pour le tableau de séquence dépendront de la mise en forme des laboratoires pour le tableau. Les renseignements minimaux comprennent normalement le type d’échantillon, le nom de l’échantillon, l’emplacement et le numéro du flacon, la méthode d’analyse et l’emplacement et le nom du fichier de données (l’attribution d’un nom de fichier de données qui correspond au nom de l’échantillon facilite le traitement futur des données). Des échantillons supplémentaires peuvent être ajoutés à la séquence pendant l’analyse.
- Exécuter la séquence en sélectionnant Séquence | Exécuter la séquence.
- Après analyse, retourner les échantillons au congélateur dès que possible.
NOTA: Il peut être possible de réanalyser des échantillons, mais il convient de noter que certains composants volatils peuvent avoir été totalement extraits lors de l’analyse initiale et que certains composés peuvent avoir subi une décomposition thermique et bactérienne à 40 °C, de sorte que le chromatogramme résultant peut ne pas être complètement représentatif du marquage olfactif d’origine.
5. Analyse des données
NOTE: L’analyse initiale des données comprend l’intégration de chromatogrammes pour obtenir des données sur le temps de rétention et la surface de crête ainsi que l’identification provisoire des pics à l’aide du logiciel ChemStation et des bases de données spectrales de masse du NIST (National Institute of Standards and Technology), version MSD F.01.01.2317. L’analyse des données peut être effectuée manuellement ou par une méthode semi-automatisée. Si la méthode semi-automatisée est utilisée, il est parfois avantageux d’entreprendre un certain degré d’analyse manuelle des données pour vérifier les identifications provisoires.
- Ouvrez le fichier de données en cliquant sur le fichier approprié dans la barre de navigation de gauche. Le chromatogramme ionique total (TIC) sera affiché dans la fenêtre supérieure de l’écran d’analyse des données.
- Pour intégrer le TIC à l’aide de l’intégrateur RTE, sélectionnez Chromatogramme | Intégrer.
- Ajustez les paramètres d’intégration afin que les pics supérieurs à 3 x bruit de base soient intégrés. Sélectionner le | chromatogramme Paramètres d’intégration du signal MS. Dans la zone de sortie, ajustez la zone de crête minimale comme il convient (1.0 produit des résultats acceptables dans nos exemples).
- Pour identifier les pics et générer un rapport de synthèse, sélectionnez Exporter les rapports | Les résultats de la recherche de bibliothèque sont signalés à XLS.
REMARQUE : les bibliothèques spectrales à rechercher ainsi que le nombre de correspondances de bibliothèque à afficher doivent être prédéfinies dans le logiciel avant qu’une recherche de bibliothèque puisse être entreprise. - Le rapport de feuille de calcul qui en résulte contient des données d’intégration pour chaque pic et une correspondance provisoire de la bibliothèque spectrale pour attribuer l’identité. En règle générale, la correspondance qualité/bibliothèque doit être >80 pour accepter l’identification provisoire. Enregistrez la feuille de calcul.
- Identifiez un pic directement à partir du TIC.
- Choisissez le pic d’intérêt.
- Si le pic est petit, effectuez un zoom avant en dessinant une zone autour du pic en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé, étirez la boîte sur le pic et relâchez.
- Placez la ligne du curseur de sorte qu’elle se trouve au point le plus élevé du pic (ou juste après).
- Double-cliquez sur le bouton droit de la souris et le spectre de masse pour le pic apparaîtra dans la fenêtre inférieure de l’écran d’analyse de données.
- Pour rechercher dans la bibliothèque spectrale, déplacez le curseur n’importe où dans la fenêtre spectrale et double-cliquez sur le bouton droit de la souris. Les résultats de la recherche de bibliothèque apparaîtront dans une nouvelle fenêtre.
- Pour supprimer le bruit de fond d’un spectre d’intérêt, double-cliquez d’abord sur le bouton droit de la souris sur le pic en question. Ensuite, double-cliquez sur le bouton droit de la souris dans une zone sans pics immédiatement devant le pic d’intérêt. Sélectionner le | chromatogramme Soustraire les spectres. Le spectre soustrait s’affichera dans la fenêtre inférieure de l’écran d’analyse des données et affichera '(-)' à côté des données SCAN dans l’en-tête de la fenêtre.
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Résultats
Suite à ce protocole, nous avons provisoirement identifié un total de 32 composés chimiques volatils à partir de l’analyse de 14 marques olfactives ano-génitales spontanément libérées sur du papier filtre par des lémuriens à collerette rouge(Varecia variegata rubra)et comparé les profils d’odeur avec les caractéristiques dusignaleur 12. Des composés volatils naturels, tels que les hydrocarbures, les terpènes, les alcools terpéniques et les cétones, étaient présents dans ces profils et com...
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Discussion
L’utilisation d’échantillons témoins, qu’il s’agit de contrôles environnementaux créés au moment du prélèvement d’échantillons ou de blancs du système, est cruciale pour l’interprétation des échantillons de marque olfécente. Tous les pics attribués à l’environnement d’échantillonnage ou au système instrumental doivent être exclus des échantillons de marques olfactuelles afin que seuls les pics d’intérêt soient inclus dans toute interprétation. Ces contrôles peuvent également jouer un rôle dans l’évaluation et la surveill...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Keith Holding pour son aide dans les analyses chimiques au Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, et Ben Mantle pour la production de la vidéo. Nous sommes également reconnaissants au Professeur Gloriano Moneti, au Dr Giuseppe Pieraccini et aux membres du Centre de spectrométrie de masse de l’Université de Florence, à Florence, ainsi qu’au Prof. Luca Calamai et au Dr Marco Michelozzi du Laboratoire ARCA du CNR, Florence, pour leur aide dans la mise en place de cette méthodologie. Les projets de recherche qui comprenaient les méthodes d’échantillonnage et d’analyse décrites dans le manuscrit ont été soutenus par deux bourses intra-européennes Marie Skłodowska-Curie (identifiants de convention de subvention: 327083, 703611), une petite subvention(« The sensory enriched primate »)de la Primate Society of Great Britain et une petite bourse de recherche(« Do hunter-gatherers have a special sense of smell? »)de la British Academy/The Leverhulme Trust à S.V. Les travaux de laboratoire nécessaires à la mise en place de cette méthodologie ont également reçu un financement du concours annuel de financement de la Faculté des sciences et du génie (Wolverhampton) à S.V.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Flacons pour passeur d’échantillons de 10 mL | Agilent | 5188-5392 | Flacons de 10 ml avec |
| bouchons de 18 mm | Agilent | 8010-0139 | Magnétique avec septa en PTFE/silicone |
| Échantillonneur automatique | Agilent | GC120 PAL | |
| Colonne capillaire | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0,25 mm ; 0,25 & micro ; m |
| Logiciel d’analyse de données | Agilent-ChemStation | ||
| Chromatographe en phase gazeuse | Agilent | 7890B | |
| Septa d’entrée | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Détecteur sélectif de masse | Agilent | 5977A | |
| Logiciel de rapport | Microsoft-Excel | ||
| Bibliothèque spectrale | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Programme de recherche de bibliothèque spectrale | NIST-MS | Search v.2.2 | |
| Splitless Inlet Liner | Agilent | 5190-4048 | |
| Fibres SPME | Agilent | SU57345U | 65 µ ; m PDMS/DVB fibre |
Références
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).
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