Isolement des cellules monnucléaires tonsillar pour étudier les réponses immunitaires innées Ex Vivo dans un tissu lymphoïde muqueuse humain

Les études sur les organes humains sont limitées en raison de l’accessibilité ainsi que des raisons éthiques évidentes. Cependant, ils sont essentiels pour bien comprendre la complexité de la biologie humaine. Les cultures de cellules isolées (cultures primaires ou lignées cellulaires) sont un système standard dans les études de biologie cellulaire en raison de leur disponibilité. Bien que les cultures cellulaires isolées aient permis des découvertes exceptionnelles, l’utilisation de lignées cellulaires a fait l’objet d’un examen plus approfondi parce qu’elles n’imitent pas entièrement la biologie in vivo des organes. Cependant, la culture des cellules tridimensionnelles ou des explants de tissu est très complexe^4,5,6. En effet, un morceau de tissu ou d’organe est fortement hétérogène parce que sa composition cellulaire diffère selon la localisation dans le tissu. Ainsi, l’utilisation de blocs de tissus nécessite l’analyse de nombreuses répliques techniques et biologiques, conduisant à la nécessité d’un grand nombre de donneurs ou de patients.

Les tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) sont structurellement semblables aux ganglions lymphatiques, mais ont des fonctions uniques, parce que leur rôle principal est de réguler l’immunité muqueuse⁷. Contrairement aux ganglions lymphatiques, qui sont généralement situés à une certaine distance des tissus, MALT sont généralement situés immédiatement en dessous de l’épithélium du tissu muqueuse. Histologiquement, ils sont principalement composés de fortes concentrations de cellules B et T, mais aussi de cellules présentant des antigènes telles que les macrophages et les cellules dendritiques. MALT constituent environ 50% du tissu lymphoïde dans le corps humain. Les MALT sont subdivisés en neuf groupes selon leur emplacement : GALT (intestin-), BALT (bronches-), NALT (nasal-), CALT (conjonctival), LALT (larynx-), SALT (peau-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisé) et D-MALT (diffusé). L’O-MALT est principalement composé des amygdales de l’anneau amygdale de Waldeyer et est le malt le plus accessible^8,9. En effet, les amygdales situées dans l’oropharynx constituent la principale barrière protégeant les voies digestives et respiratoires contre les micro-organismes (potentiels) invasifs¹⁰. En outre, les amygdales sont couvertes par un épithélium squameux non kératinisant stratifié fin, soutenu par une capsule de tissu conjonctif contenant des vaisseaux sanguins, les nerfs et les lymphatiques, offrant un accès facile aux cellules immunitaires^11,12. En outre, l’amygdalectomie, l’acte chirurgical d’enlever les amygdales, est une procédure courante effectuée sur les enfants ayant une respiration trouble du sommeil, ce qui rend les amygdales un tissu facilement disponible¹³ dans les milieux physiologiques.

Les amygdales permettent l’étude de la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse. En effet, dans l’infection par le VIH, parce que les amygdales sont composées d’une forte concentration de cellules immunitaires, ils sont la cible principale de la réplication virale, mais produisent également une grande quantité de cytokines qui ne sont pas détectés dans la circulation^14,15. À des états stables, de rares populations de cellules innées sont présentes dans divers tissus muqueuses, y compris les amygdales, mais sont essentiellement absentes du sang.

Ainsi, les cellules mononucléaires des amygdales (TMC) sont un modèle plus pertinent et complexe que les PBMC et peuvent répondre à des questions plus profondes. D’autre part, l’utilisation d’explants de tissu peut être complexe et pas toujours pertinente pour les études immunitaires innées. Ainsi, nous avons établi un modèle pour étudier l’activation immunitaire muqueuse à l’aide de TMCs¹⁶. Ici, nous décrivons une méthode pour l’isolement efficace des TMCs des amygdales humaines fraîches. Cette méthode permet la récupération d’un grand nombre de cellules immunitaires tout en gardant leur intégrité pour les études ex vivo.

Les spécimens ne sont pas recueillis spécifiquement à des fins de recherche et l’étude n’est pas considérée comme envahissante. Toutefois, la collecte des amygdales humaines nécessite l’approbation éthique des autorités locales compétentes. Dans notre cas, il a été approuvé par le Comité de protection des personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). De plus, le consentement de chaque patient ou représentant légal est demandé pour obtenir les données personnelles des donneurs (p. ex., sexe, âge, antécédents d’infections ORL) qui peuvent aider à interpréter les résultats expérimentaux.

1. Manipulation du tissu amygdaler humain

1. Placez les amygdales de chaque donneur dans un flacon stérile de 50 mL contenant 25 mL PBS 1x et transportez-les au laboratoire selon les recommandations de l’autorité (utiliser trois niveaux de protection : flacons, boîte de sécurité et sac).
   REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être effectué dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2. Tous les spécimens humains doivent être manipulés avec soin car ils n’ont pas été préalablement qualifiés et peuvent contenir des agents infectieux.
2. Nettoyez tous les outils entre chaque utilisation.
   1. Après utilisation, démonter la passoire cellulaire et conserver avec tous les autres instruments (p. ex., pilon, forceps) dans un bain contenant une solution détergente (détergent à volume 1/10 en H₂O) pendant la nuit.
   2. Badigeonner chaque ustensile pour enlever le tissu et laver à l’eau claire.
   3. Bien sécher toutes les pièces, puis préparer la passoire cellulaire (85 mL, 37 mm de diamètre) en plaçant une grille d’acier à mailles de 60 sur une grille en acier à mailles de 10 mailles et fermez étroitement l’anneau.
   4. Placez tous les outils dans des sacs stériles et autoclave.

2. Dissection du tissu amygdale et de l’isolement des cellules mononucléaires tonsillar (TMCs)

1. Placez la passoire cellulaire sur un plat de culture cellulaire de 150 x²⁵ mm 2 (SPL150) et tous les instruments dans un autre SPL150 pour les garder stériles.
2. Transférer les amygdales de la fiole dans la passoire cellulaire à l’aide de forceps stériles. Verser également dans tous les PBS, qui contient quelques cellules qui ont émergé les amygdales. Si nécessaire, ajoutez plus de PBS pour immerger la grille.
   REMARQUE : Le tissu doit être immergé en tout temps pour éviter la dessiccation.
3. Enlever les tissus cautérisés, sanglants et fibromes à l’aide de forceps et d’un scalpel.
   REMARQUE : Les amygdales retirées des enfants n’ont pas besoin de cette étape.
4. Couper les tissus en petits morceaux de moins de 0,5 cm de diamètre à l’aide du scalpel et des pinces courbes. Couper tout le tissu afin que les petits morceaux puissent être immergés en tout temps.
5. Placez quelques morceaux de tissu dans la passoire cellulaire et grattez-les sur la grille à l’aide d’un pilon en verre jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une couche très mince de stroma blanc. Retirez et jetez le stroma pour éviter d’obstruer la grille.
6. Une fois que tous les tissus ont été pressés à travers la grille, utilisez une pipette de 10 mL pour transférer toute la suspension cellulaire sur la grille et la gratter une dernière fois.
7. Transférer la suspension cellulaire avec une pipette de 10 mL dans un flacon stérile. Laver la grille et la passoire cellulaire avec PBS 1x. Laissez reposer la suspension cellulaire pendant 5 min à RT sur le banc. Cette étape permet la précipitation et l’agglomération des restes de stroma, des cellules mortes, et de tout ADN libéré, et facilitera l’étape suivante.
8. Placez un tamis stérile de 70 μm sur un nouveau flacon de 50 mL (retirer soigneusement de l’enveloppe) et transférer délicatement la suspension cellulaire sur elle avec une pipette de 10 mL. Ne mélangez pas la suspension, car une pastille est fréquemment présente. Si le tamis est obstrué, utilisez l’arrière d’une pointe stérile de pipette de 1 mL pour gratter les cellules au tamis. Changer le tamis aussi souvent que nécessaire.
9. Centrifugez les cellules à 250 x g pendant 10 min à 4 °C.
10. Jetez le supernatant et resuspendez le granulé en mélangeant doucement le flacon, puis resuspendez les cellules dans 35 mL de PBS.
11. Dans une nouvelle fiole, placez un nouveau tamis de 70 μm sur le dessus et transférez la suspension cellulaire sur elle avec une pipette de 10 mL. Si le tamis est obstrué, utilisez la technique détaillée à l’étape 2.7.

3. Isolement des TMC par gradient de densité cellulaire

REMARQUE : Les TMC peuvent être utilisés après l’étape 2.10. Cependant, pour obtenir une solution cellulaire plus claire et pour enlever d’autres débris cellulaires et les globules rouges, il est conseillé d’effectuer un isolement de gradient de densité cellulaire des cellules mononucléaires.

1. Ajouter 15 mL du milieu de gradient de densité (d = 1,076 g/mL) dans un nouveau flacon de 50 mL. Verser la solution TMCs au-dessus du milieu de gradient de densité, en prenant soin de minimiser le mélange de la suspension avec le milieu de gradient de densité.
2. Centrifuge la solution à 1000 x g pendant 30 min à RT avec accélération et rupture.
3. Retirer avec une pipette de 10 mL et jeter la couche supérieure (contenant principalement PBS 1x) sans perturber l’interface entre les TMC et le milieu de gradient de densité.
   REMARQUE : Les TMC contiennent un faible nombre d’érythrocytes, donc la solution est claire. Ainsi, l’interface entre la solution des TMCs dans PBS et le milieu de gradient de densité peut être difficile à visualiser. En conséquence, les cellules peuvent être réessupnées en RPMI 1640 complétées par des HEPES de 20 mM (sans FBS) avant que le gradient de densité ne soit effectué.
4. Retirez les TMCs à l’aide d’une pointe stérile de pipette de 1 mL et placez-les dans un nouveau flacon de 50 mL.
5. Laver les cellules en ajoutant 50 ml de PBS contenant 2 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 2 mM EDTA et centrifugez le tube à 250 x g pendant 10 min à 4 °C pour enlever les plaquettes restantes.
6. Répétez l’étape 3.5, mais centrifugez le tube à 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
7. Préparer le milieu de culture (R10) en complétant RPMI 1640 par FBS inactivé à 10 %, 2 mM L-glutamine et la solution antibiotique (100 U/mL penicillium et 100 μg/mL streptomycine).
8. Resuspendez les TMC dans 10 mL de R10 et comptez les cellules. En moyenne, cette technique donne 5 x 10⁸-2 x 10⁹ TMCs par paire d’amygdales. Les cellules peuvent maintenant être utilisées pour des investigations comme les PBMC à partir de sang entier (p. ex., purification de type cellulaire spécifique, culture cellulaire, cytométrie de flux, RT-qPCR, congélation, etc.).
9. Si nécessaire, congeler les cellules pour une utilisation ultérieure en utilisant des techniques standard pour la congélation des cellules primaires.
   1. Comptez le nombre de cellules.
   2. Centrifugez les cellules et retirez le supernatant. Dissoudre le granulé dans suffisamment de 100% FBS pour une concentration finale de 1 x 10⁸ cellules/mL, puis ajouter le même volume d’une solution HBS + 20% DMSO. Les cellules seront alors à 5 x 10⁷ cellules/mL. Cette étape doit être effectuée à 4 °C et la solution FBS et DMSO doit être maintenue à 4 °C avant d’être utilisation.
   3. Distribuer 1 ml de la solution cellulaire dans des cryotubes et les mettre dans un récipient de congélation lente qui a été à 4 °C pendant la nuit pour contrôler le taux de congélation cellulaire. Placez-le à -80 °C.
   4. Pour décongeler les cellules, placez les cryocials dans un bain chaud à 37 °C pendant quelques secondes avec une agitation constante. Dès que les cellules commencent à dégeler, transférez-les à 49 mL de R10 et centrifuge pour enlever le DMSO. Comptez les cellules et utilisez-les comme PBMC.
      REMARQUE : Bien que le gel et le dégel des TMC enlèvent les débris, il endommagera également certains types de cellules rares. Si des amas ou des débris sont présents après le dégel, il est préférable de passer la suspension cellulaire à travers un tamis stérile de 70 μm avant de l’utiliser.

4. Phénotypage des TMCs par cytométrie de flux

1. Récupérer 5 x 10⁶ cellules de la solution précédente pour chaque panneau de mélange d’anticorps qui doit être testé et placer dans un tube de cytométrie de 5 mL. Récupérer 1 x 10⁶ cellules pour le contrôle non taché.
2. Laver les cellules en PBS et en centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendez-les en 500 μL de PBS (1 x 10⁶ cellules/mL) et incuber avec une tache de viabilité pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
3. Ajouter 5 μL de sérum AB humain inactivé à la chaleur par 100 μL de suspension cellulaire et incuber pendant 15 min à 4 °C dans l’obscurité.
4. Laver les cellules en PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Tampon de lavage) et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
5. Resuspendez les TMC dans 500 μL de tampon de lavage contenant les anticorps tels que détaillés dans le tableau 1. Incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
6. Laver les cellules dans la tampon de lavage et la centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendez les TMC dans 500 μL de PBS contenant 0,5 % de paraformaldéhyde (PFA). Conserver dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’acquisition par cytométrie de flux.
   REMARQUE : La PFA est dangereuse. Utilisez une solution commerciale prête à l’emploi pour préparer la solution PFA à 0,5 %.

Tableau 1 : Liste des anticorps pour la caractérisation cellulaire par cytométrie de flux.

5. Exemple d’activation des TMC et de mesure de la production de cytokine

1. Diluer les TMCs dans le milieu R10 pour obtenir une concentration de 2 x 10⁶ cellules/mL.
2. Distribuer 400 000 TMC dans 200 μL de R10 dans une plaque de fond ronde de 96 puits.
3. Pour activer les cellules, ajoutez 5 μg/mL du TLR7/8 agoniste resiquimod (R848) pendant la nuit.
4. Centrifugez les plaques et récupérez le supernatant des TMC et congelez-les pour une analyse plus poussée. La production de cytokines sera évaluée à l’aide d’immunotests à base de perles pour quantifier simultanément plusieurs cytokines solubles à l’aide d’un cytomètre de débit suivant le protocole du fabricant.
5. Évaluer la viabilité des cellules à l’aide d’un test de viabilité des cellules luminescentes suivant le protocole du fabricant. Ajoutez 60 μL de solution de viabilité cellulaire aux puits et mesurez la luminescence dans un délai de 10 min (acquisition pour 1 s/puits).

Nous avons d’abord caractérisé le profil immunitaire des cellules présentes dans la culture et analysé la quantité de TMCs. Nous avons phénypique les TMC des amygdales avec la cytométrie de flux. Comme le montre la figure 1, tous les principaux types de cellules immunitaires présents dans les PBMC provenant du sang étaient représentés dans les TMC à partir d’amygdales. Toutefois, dans les TMC, la fréquence de tous les types de cellules, à l’exception des cellules B, était plus faible que dans les PBMC.

Figure 1 : Phénotypage des TMC dans les amygdales. Des TMCs de donneurs sains ont été obtenus après la dissection du tissu amygdaleur humain et l’isolement des cellules. (A) Les cellules ont été tachées, et les données ont été acquises par cytométrie de flux. Les données représentent une expérience représentative. (B) Le tableau résume le pourcentage de chaque type de cellules dans les TMC vivants dans les amygdales de six donneurs sains différents et compare chacun au pourcentage de chaque type de cellules dans les PBMC du sang, tel que défini dans la littérature18,19. Les données sont affichées comme le pourcentage de cellules vivantes SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nous avons ensuite testé les réponses immunologiques des TMC. Une façon de reproduire l’activation d’une cellule contre un agent pathogène est de stimuler les capteurs immunitaires innés de la famille des récepteurs toll-like (TLR). Les TLR sont principalement présents dans les monocytes/macrophages, tous les sous-types de cellules dendritiques (DC), les cellules dendritiques plasmacytoides (PDC), ainsi que dans les cellules B. Dans cet exemple, nous avons étudié TLR7 et TLR8, parce qu’ils se spécialisent dans les réponses antivirales et la plupart des cas d’amygdalite (c.-à-d. les infections à amygdale) sont causés par une infection virale. Ainsi, les TMC provenant d’amygdales (graphique en bleu) de sept donneurs sains ont été stimulés du jour au lendemain avec le TLR7/8 ligand resiquimod (R848). Comme dans les PBMC (graphique en vert), l’activation par la signalisation TLR7/8 a déclenché la production d’interférons de type I (IFN) et de cytokines pro-inflammatoires. En fait, la cytokine la plus fortement produite dans les TMC lors de l’activation était IFNα, un membre de la famille IFN de type I qui est principalement impliqué dans l’immunité innée contre l’infection virale et est principalement produite par les PDC. Toutes les cytokines testées, à l’exception de l’IFN2/3 et de l’IL-8, ont été produites par les TMC, bien qu’à des niveaux inférieurs à ceux des PBMC. Il est intéressant de noter que certaines cytokines (principalement IL-8, mais aussi IL-6, IL-10 et TNFα) étaient présentes en plus grande quantité aux niveaux basaux. En outre, nous avons comparé la cytokine produite par des TMC isolés ou par des blocs de tissus amygdalers préparés comme décrit précédemment6. Nous avons mesuré tous les types d’IFN produits dans le supernatant des deux cultures cellulaires à l’aide de l’essai de reporter de ligne cellulaire STING-37 tel que décrit précédemment17 et nous avons montré que nous ne pouvions mesurer les niveaux d’IFN dans les TMC isolés.

Figure 2 : Les TMCs ont produit des cytokines lors de la stimulation. (A) Les TMCs purifiés et isolés (bleus) et les PBMC (verts) ont été stimulés pendant la nuit avec du R848 (5 μg/mL). Les supernatants ont été récupérés et congelés jusqu’à leur utilisation. Un immunotest à base de perles a été exécuté pour quantifier plusieurs cytokines solubles simultanément utilisant un cytomètre de flux. Les graphiques représentent la concentration en picogrammes par millilitre de chaque cytokine mesurée. Les augmentations de pli sont annotées en rouge sur les graphiques. Test Mann-Whitney U. (B) Les TMCs purifiés et isolés à partir d’amygdales (bleues) et de blocs de tissus amygdales (orange) ont été stimulés pendant 24 h avec le virus de la grippe A (IAV). Un test de ligne de cellule STING-37 a été utilisé pour mesurer la production d’IFN dans le supernatant. Parcelles de boîte et de moustache avec la médiane ± minimum au maximum. Test Mann-Whitney U. P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = non stimulé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Enfin, nous avons testé la viabilité des TMC. Plusieurs techniques sont disponibles pour mesurer la viabilité cellulaire. Ici, nous avons utilisé un test de viabilité cellulaire luminescente, un test facile et rapide en deux étapes. Comme le montre la figure 3, nous avons clairement détecté la cytotoxicité induite par le composé 1 dans les TMC, qui n’était pas toxique pour les PBMC. Ainsi, les TMC ont montré une plus grande sensibilité au médicament testé.

Figure 3 : Le composé 1 était toxique pour les MTC. Les TMC et les PBMC purifiés et isolés ont été préincubés avec le composé 1 (C1) à diverses concentrations pendant 1 h, puis stimulés pendant la nuit avec du R848 (5 μg/mL). Des supernatants ont été récupérés, 60 μL de solution de viabilité cellulaire ont été ajoutés, et la luminescence a été mesurée. Le * représente l’analyse statistique comparant C1 à NS. Parcelles de boîte et de moustache avec la médiane ± minimum au maximum. Test Kruskal-Wallis avec la correction post hoc de Dunn. P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = non stimulé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.