Article de méthode

Conjugués de BODIPY conventionnels pour la microscopie à super-résolution à cellules vives et le suivi à molécule unique

DOI :

10.3791/60950

⸱

8 juin 2020

 ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les conjugués conventionnels de BODIPY peuvent être employés pour la microscopie de localisation à cellule unique vivante (SMLM) par l’exploitation de leurs dimers terrestres de formation transitoire et à miettes rouges. Nous présentons un protocole SMLM optimisé pour suivre et résoudre les lipides neutres subcellulaires et les acides gras dans les cellules vivantes de mammifères et de levure à l’échelle de longueur nanoscopique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) surmontent la limite de diffraction optique de la microscopie conventionnelle de fluorescence et peuvent résoudre les structures intracellulaires et la dynamique des biomolécules avec une précision de 20 nm. Une condition préalable pour SMLM sont les fluorophores qui passent d’un état sombre à un état fluorescent afin d’éviter le chevauchement spatio-temporel de leurs fonctions de propagation de points dans chacun des milliers de cadres d’acquisition de données. Les BODIPY sont des colorants bien établis avec de nombreux conjugués utilisés dans la microscopie conventionnelle. La formation transitoire de dimers d’état au sol BODIPY (DII)à l’origine d’une seule molécule brillante permet une microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM). Ici, nous présentons un protocole simple mais polyvalent pour SMLM avec des conjugués conventionnels BODIPY dans la levure vivante et les cellules de mammifères. Cette procédure peut être utilisée pour acquérir des images super-résolution et pour suivre les états seuls de BODIPY-DII pour extraire des informations spatio-temporelles des conjugués de BODIPY. Nous appliquons cette procédure pour résoudre les gouttelettes lipidiques (LD), les acides gras et les lysosomes dans la levure vivante et les cellules de mammifères à l’échelle de longueur nanoscopique. En outre, nous démontrons la capacité d’imagerie multi-couleurs avec des colorants BODIPY lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec d’autres sondes fluorescentes. Nos résultats représentatifs montrent la répartition spatiale différentielle et la mobilité des acides gras BODIPY et des lipides neutres dans la levure dans des conditions nourries et jeûnées. Ce protocole optimisé pour SMLM peut être utilisé avec des centaines de conjugués BODIPY disponibles dans le commerce et est une ressource utile pour étudier les processus biologiques à l’échelle nanométrique bien au-delà des applications de ce travail.

Introduction

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Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie localisée activée par photo (PALM) sont apparues comme des méthodes pour générer des images super-résolution avec des informations au-delà de la limite de diffraction optique d’Abbe1,2 et pour suivre la dynamique des biomoléculesuniques 3,4. L’une des exigences pour les sondes compatibles avec SMLM est la capacité de contrôler le nombre de fluorophores actifs à tout moment pour éviter le chevauchement spatial de leurs fonctions de propagation ponctuelle (PSF). Dans chacun des milliers d’images d’acquisition de données, l’emplacement de chaque fluorophores fluorescent est ensuite déterminé avec une précision de 20 nm en adaptant sa fonction de répartition ponctuelle correspondante. Traditionnellement, le clignotement on-off des fluorophores a été contrôlé par photoswitching stochastique1,2,5 ou chimiquement induite clignement intrinsèque6. D’autres approches incluent l’activation induite des fluorogènes sur la liaison transitoire à une protéine fluorogène-activante7,8 et la liaison programmable-unbinding des oligomers d’ADN étiquetés dans la fluorescence interne totale de réflexion (TIRF) ou l’excitation de feuille de lumière9. Récemment, nous avons rapporté une stratégie d’étiquetage nouvelle et polyvalente pour SMLM10 dans laquelle précédemment rapporté rouge décalé dimeric (DII) états de bore conventionnel di-pyromethane (BODIPY) conjugués11,12,13 sont transitoirement formant et deviennent spécifiquement excités et détectés avec des longueurs d’onde rouge-décalées.

BODIPYs sont des colorants largement utilisés avec des centaines de variantes qui étiquetent spécifiquement les compartiments sous-cellulaires et les biomolécules14,15,16. En raison de leur facilité d’utilisation et de leur applicabilité dans les cellules vivantes, les variantes BODIPY sont disponibles dans le commerce pour la microscopie à fluorescence conventionnelle. Ici, nous décrivons un protocole détaillé et optimisé sur la façon dont les centaines de conjugués BODIPY disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour les CELLULES vivantes SMLM. En accordant la concentration des monomers BODIPY et en optimisant les pouvoirs laser d’excitation, les paramètres d’imagerie et d’analyse de données, les images super-résolutions de haute qualité et les données de suivi d’une seule molécule sont obtenues dans les cellules vivantes. Lorsqu’ils sont utilisés à faible concentration (25-100 nM), les conjugués BODIPY peuvent être utilisés simultanément pour SMLM dans le canal red-shifted et pour la microscopie de fluorescence conventionnelle corrélative dans le canal d’émission classique. Les données sur les molécules uniques obtenues peuvent être analysées pour quantifier l’organisation spatiale des structures immobiles et pour extraire les états diffusifs des molécules dans les cellules vivantes17. La disponibilité des sondes BODIPY sous forme verte et rouge permet une imagerie multicolore lorsqu’elle est utilisée dans la bonne combinaison avec d’autres fluorophores compatibles.

Dans ce rapport, nous fournissons un protocole optimisé pour l’acquisition et l’analyse des données SMLM à cellules vivantes à l’aide de BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rouge et lysotracker-vert en plusieurs couleurs. Nous résolvons les acides gras et les lipides neutres dans les cellules vivantes de levure et de mammifères avec la résolution de nm de 30 nm. Nous démontrons en outre que les cellules de levure régulent la distribution spatiale des acides gras ajoutés à l’extérieur en fonction de leur état métabolique. Nous constatons que les acides gras BODIPY ajoutés (FA) se localisent au réticulum endoplasmique (ER) et aux gouttelettes lipidiques (LD) dans des conditions alimentées tandis que les BODIPY-FAs forment des grappes non LD dans la membrane plasmatique au jeûne. Nous étendons davantage l’application de cette technique aux lysosomes et LD d’image dans les cellules vivantes de mammifères. Notre protocole optimisé pour SMLM utilisant les conjugués conventionnels de BODIPY peut être une ressource utile pour étudier des processus biologiques à l’échelle nanométrique avec la myriade de conjugués BODIPY disponibles.

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Protocole

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REMARQUE: Pour le clonage de levure et le marquage endogène s’il vous plaît se référer à notre publication récente10.

1. Préparation d’échantillons de cellules de levure pour l’imagerie

  1. Préparer une culture liquide du jour au lendemain d’une souche de levure w303. À l’aide d’un bâton en bois stérile, apercevrez une petite quantité de cellules de levure d’une plaque d’agar contenant de l’extrait de levure-peptone-dextrose dans un tube de culture avec 2 ml de milieu synthétique de dextrose complète (SCD). Incuber le tube pendant la nuit dans un incubateur secouant à 270 tr/min et 30 oC.
  2. Effectuer une dilution matinale de 1:50 des cellules dans SCD. Continuer à cultiver les cellules diluées pendant 4 h à 30 oC dans un incubateur de secousses de 270 tr/min, permettant aux cellules de se développer en phase exponentielle et d’atteindre une densité optique (OD) de 0,6 .
    REMARQUE : La procédure peut varier ici en fonction de l’état métabolique étudié. Les conjugués BODIPY n’ont pas besoin de cellules dans la phase de croissance exponentielle. Cependant, être conscient de l’autofluorescence des cellules mortes pendant la phase stationnaire, car il peut causer un signal de fond trop fort pour analyser les émetteurs seuls BODIPY-DII.
  3. Pour étudier les cellules à jeun, cultiver la culture de levure pendant 2 jours sans échange de médias.
  4. À 30 minutes avant de placage des cellules, incuber un verre de couverture chambré de 80 ll de Concanavalin stérile A2(ConA) déionisé à température ambiante. Après 30 min, laver le verre de couverture trois fois avec déionisé H2O.
  5. À 30 minutes avant l’imagerie, pipette les cellules sur le verre de couverture chambré, avec le volume correct de SCD frais pour atteindre une densité optique de 0,12 (généralement la culture de levure de 60 l à OD 0,6 en 240 'L SCD). Laissez les cellules se déposer et adhérer à la surface conA pendant 30 min.
  6. Ajouter le conjugué BODIPY désiré directement au verre de couverture chambré à une concentration finale de 100 nM.
    REMARQUE : Une expérience d’optimisation de concentration BODIPY peut être nécessaire en fonction de la densité locale DE BODIPYs dans un compartiment cellulaire particulier.

2. Préparation de cellules de mammifères pour l’imagerie SMLM

  1. Maintenir les cellules mammifères U2OS dans les DMEM non fluorescents avec 10% de sérum bovin fœtal, 4 mM glutamine, 1 mM pyruvate de sodium et 1% d’antibiotiques pénicilline-streptomycine dans un flacon T25.
    REMARQUE : Les cellules peuvent également être maintenues dans le DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% d’antibiotiques pénicilline-streptomycine, cependant, le milieu doit être échangé avant l’imagerie avec une solution non-autofluorescente.
  2. Diviser les cellules à 70-80% confluence 1:5 dans un seul puits d’une plaque de 8 puits. Culture des cellules dans la plaque de 8 puits pendant 12 à 24 h avant l’imagerie.
  3. Ajouter BODIPY-C12, LysoTracker Green ou tout autre conjugué BODIPY à une concentration finale de 100 nM (solutions de stock en sulfoxide de diméthyle [DMSO]) 10 min avant l’imagerie. Ce temps peut varier en fonction de l’expérience souhaitée.
    REMARQUE : L’imagerie peut être effectuée à température ambiante (23 oC) à l’aide d’une solution d’imagerie cellulaire vivante. Cependant, l’imagerie à 37 oC et 5 % de CO2 avec des DMEM non fluorescents mélangés à 10 % de sérum bovin fœtal, à 4 mM de glutamine, à 1 mm de pyruvate de sodium et à 1 % d’antibiotiques à la pénicilline-streptomycine est préférable de garder les cellules plus près des conditions physiologiques et de tirer des conclusions biologiques.

3. Préparation de l’équipement

  1. Montez les ensembles de filtres appropriés dans la trajectoire d’émission en fonction de la couleur d’émission de BODIPY utilisée.
    REMARQUE : Un miroir dichroique quad-band (zt/405/488/561/640rdc) sépare d’abord l’excitation de la lumière d’émission. Les émissions vertes (525 nm) et les émissions rouges (595 nm) sont ensuite fractionnées par un séparateur d’faisceau à long passage dichroique (T562lpxr) suivis de filtres à pas de bande ET525/50 dans le canal vert et ET 595/50 dans le canal rouge. Les deux canaux sont ensuite projetés à différentes zones de la même puce de l’appareil photo. De même, l’émission rouge (595 nm) et l’émission rouge lointain sont d’abord fractionnées par un séparamètre d’faisceau de long-passe dichroique (FF652-Di01) suivi des filtres à pas de bande ET 610/75 dans le rouge et ff731/137 dans le canal rouge lointain.
  2. Allumez le microscope, le microscope, les lasers (488 nm, 561 nm) et la caméra. Ici, un microscope inversé avec un système de mise au point parfait et une caméra EMCCD refroidi à -68 oC sont utilisés.
  3. Ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope.
  4. Ouvrez le logiciel Hal4000 (voir la Table des Matériaux) qui contrôle la lumière LED pour l’imagerie de champ lumineux, les pouvoirs laser, les volets laser et les paramètres de caméra pour l’imagerie. Réglez le gain EMCCD à 30 et la température de la caméra à -68 oC. Préparer la caméra et le logiciel correspondant pour enregistrer des films à 20 Hz.
    REMARQUE : Cette technique s’applique à tout microscope à champ large capable de la microscopie de localisation photo activée (PALM) et de l’imagerie par microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM). Les logiciels correspondants peuvent varier.
  5. Allumez le chauffe-étape au microscope et placez-le à une température de 37 oC et à un niveau de CO2 de 5 %. Ajuster le collier de correction objective en conséquence.
  6. Monter l’échantillon sur la scène du microscope et se concentrer jusqu’à ce que le système de mise au point s’engage. Déplacez la scène à l’aide du contrôleur de scène jusqu’à ce que des cellules saines apparaissent dans le champ de vision.
    REMARQUE : Pour l’imagerie avec des cellules de levure à température ambiante, il n’est pas nécessaire d’allumer le chauffage ou le contrôle du CO2.
  7. Allumez les lasers appropriés pour l’excitation des monomères ainsi que des dimers. Pour BODIPY vert ou LysoTracker vert, nous utilisons un laser 561 nm pour exciter les états DII pour SMLM et un laser de 488 nm pour exciter les monmers pour la fluorescence conventionnelle.
    REMARQUE : Pour le rouge BODIPY, utilisez un laser de 640 nm pour exciter les états DII pour SMLM et un laser de 561 nm pour exciter les monomers pour la fluorescence conventionnelle. Pour le rouge BODIPY, ajustez les puissances laser de 561 nm et 640 nm pour visualiser la fluorescence en vrac dans le canal rouge et les éclats de molécule unique dans le canal rouge lointain. La puissance typique pour 561 nm est de 0,06 W/cm2 et de 5 kW/cm2 pour 640 nm. Pour LE vert BODIPY, attendez-vous également à voir la fluorescence conventionnelle dans le canal d’émission verte sous 561 nm excitation. Pour le rouge BODIPY, attendez-vous à voir la fluorescence conventionnelle dans le canal rouge sous 640 nm excitation. Ce signal provient de l’émission anti-Stokes, qui devient utile pour les images de co-localisation monméaux/dimer avec une excitation laser continue.

4. Acquisition de données

  1. Chargez les séquences d’obturation laser pour l’excitation des monomères ainsi que des dimers.
    REMARQUE : Nous utilisons généralement neuf cadres d’excitation de molécule unique à 561 nm suivis d’un cadre d’excitation conventionnel à 488 nm. Cela offre un signal de fluorescence classique plus lumineux et évite la fuite d’un autre fluorophore excitable de 488 nms tels que la protéine fluorescente verte (GFP) dans le canal rouge de détection d’une seule molécule dans les applications d’imagerie multi-couleurs. Alternativement, allumez le laser de 561 nm en continu et comptez sur l’émission anti-Stokes pour les images conventionnelles dans le canal de longueur d’onde plus courte.
  2. Accordez les pouvoirs laser de telle sorte que des éclats de fluorescence d’une seule molécule sont détectés dans le canal d’émission red-shifted sous 561 nm excitation, et la fluorescence conventionnelle apparaît dans le canal d’émission verte avec 488 nm excitation. Les puissances laser typiques du laser de 561 nm seront d’environ 0,8-1 kW/cm2 pour SMLM, et 0.035-0.07 W/cm2 pour le laser 488 nm dans le mode d’imagerie de fluorescence classique.
  3. Choisissez un dossier de destination pour les films et enregistrez 5 000 à 20 000 cadres d’acquisition pour collecter suffisamment de localisations pour la reconstruction d’images super-résolution.
  4. Déplacez-vous vers différents champs de vision et répétez les étapes ci-dessus pour recueillir des données à partir d’un plus grand nombre de cellules.

5. Analyse des données et suivi d’une seule molécule

  1. Chargez le film dans un logiciel d’analyse SMLM.
    REMARQUE : Tout logiciel18 peut être utilisé. Nous utilisons INSIGHT (voir le Tableau des Matériaux) et recoupons les résultats à l’aide du plugin ThunderSTORM19 pour imageJ (Fidji).
  2. Examiner visuellement le film et ajuster les paramètres de contraste de telle sorte que le clignotement de fluorescence à une seule molécule est visible. Au besoin, limitez la région ou la plage de trame pour l’analyse des données SMLM si certaines parties de l’échantillon sont en fluorage continu.
  3. Définissez des paramètres d’identification d’une seule molécule pour l’ajustement avec des FPS gaussiens 2D (ROI : 7 x 7 pixels avec la taille de pixel 160 nm, largeur 260-650 nm, hauteur 'gt; 50 photons). Examiner visuellement à travers quelques images d’exemple pour vérifier les paramètres d’identification et détecter de façon fiable les éclats distincts de fluorescence d’une seule molécule (voir la figure 1C).
    REMARQUE : Certains paramètres d’identification tels que la hauteur et la largeur peuvent être légèrement ajustés pour optimiser la reconnaissance des signaux de fluorescence à molécule unique perçus visuellement.
  4. Effectuez l’analyse d’image SMLM avec les paramètres d’identification optimisés, puis rendre chaque molécule comme un Gaussien 2D dont la largeur est pondérée par la racine carrée inverse du nombre détecté de photons.
  5. Évaluer la qualité des données. Utilisez des plages de cadre restreintes pour observer les distributions de molécules uniques à des cas plus spécifiques dans le temps. Cela peut expliquer le mouvement des organelles lors de l’acquisition de données.
  6. Pour analyser plus en profondeur la distribution spatiale et la dynamique des distributions de molécules, exporter la liste des molécules obtenues contenant les coordonnées, les cadres d’apparence, les photons, les largeurs et les hauteurs des localisations. Importer la liste des molécules dans les procédures d’analyse écrite personnalisées.
  7. Pour obtenir des informations spatiales de la distribution d’une seule molécule, calculer la fonction de distribution radiale (r), qui représente la densité des localisations en fonction de la distance radiale20. Pour obtenir 'r), calculer les distances uniques paire-sage de toutes les localisations, construire l’histogramme avec des bacs centrés à ri avec la hauteur H (ri) et avec une largeur dr et diviser par 2'r i'dr; (ri) - H (ri)/r i '(ri'dr)2-ri2). La fonction de distribution radiale peut ensuite être utilisée pour quantifier et comparer le degré de clustering ainsi que la taille caractéristique des clusters.
  8. Pour obtenir des informations dynamiques sur la diffusion des molécules, liez les localisations qui apparaissent par exemple à moins de 3 pixels (0,48 m) dans des cadres consécutifs d’acquisition de données pour créer des traces de molécules uniques.
    REMARQUE : La distance de liaison dépendra de la diffusion des molécules et de la densité des localisations. La distance de liaison maximale peut être estimée en analysant la densité des localisations dans chaque cadre21,22. La densité moyenne a été déterminée à 0,043 localisation par m2; ainsi, un rayon de 0,48 m se trouvait dans une densité suffisamment faible pour s’assurer que différentes molécules n’étaient pas reliées entre elles.
  9. Moyenne des déplacements pour différents temps de décalage de plusieurs traces d’au moins trois temps de décalage pour créer un déplacement carré moyen (MSD) par rapport à la parcelle. S’adapter à la courbe MSD vs 't avec l’équation MSD '4D 't'2 pour calculer le coefficient de diffusion moyenne D3.

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Résultats

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Ici, nous présentons une procédure optimisée de préparation d’échantillons, d’acquisition et d’analyse de données pour SMLM à l’aide de conjugués BODIPY basés sur le protocole ci-dessus(figure 1A). Pour montrer un exemple du flux de travail pour l’acquisition et l’analyse des données SMLM, nous employons BODIPY (493/503) dans la levure pour résoudre les LD en dessous de la limite de diffraction optique(figure 1B-F). Des exemples des différents m...

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Discussion

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Dans ce protocole, nous avons démontré comment les conjugués conventionnels DE BODIPY peuvent être utilisés pour obtenir des images SMLM avec un ordre d’amélioration de grandeur dans la résolution spatiale. Cette méthode est basée sur l’exploitation précédemment rapportée, rouge-décalé DII états des colorants conventionnels BODIPY, qui se forment transitoirement par des rencontres bi-moléculaires. Ces états peuvent être spécifiquement excités et détectés avec des longueurs d’onde red-shifted et sont clairsemés...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

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La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R21GM127965.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BODIPY C12ThermoFisherD3822Analogue d’acide gras vert
BODIPY C12 RougeThermoFisherD3835Analogue d’acide gras rouge
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Marqueur lipidique neutre
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Immobilisation cellulaire sur surface en verre
Drop-out Mix Complete sans base d’azoteUS BiologicalD9515Acides aminés pour SCD
DextroseSigma-AldrichG7021Source de carbone pour SCD
Huit puitsCellvisC8-1.58-NLunettes de protection à huit puits
, Lb-Tek IISigma-AldrichLunettes de protection à chambre
ET525/50ChromaFiltre passe-bande
ET595/50ChromaFiltre passe-bande
ET610/75ChromaFiltre passe-bande
Sérum de veau fœtal (FBS)Gibco26140079Sérum
FF652SemrockSéparateur de faisceau
FF731/137SemrockFiltre passe-bande
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Milieu
de culture cellulaireHal4000Zhuang Lab, Université deLogiciel d’acquisition de données
Ixon89Ultra DU-897UCaméra AndorEMCCD pour la détection de photons
Laser 405, 488, 561, 640 nmLasers CW-OBISpour l’excitation
Insight3Zhuang Lab, UniversitéLogiciel de localisation de molécule unique
L-GlutamineGibco25030-081Acide aminé requis pour la culture cellulaire
Solution d’imagerie de cellules vivantesThermoFisherA14291DJTampon d’imagerie
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Marqueur de lysosome basé sur Bodipy
Cellules de mammifères ATCC U2OS (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (Université du Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonImmersion dans l’huile objectif
Pénicilline streptomycineGibco15140-122Antibiotiques
Pyruvate de sodiumGibco11360-070Supplément pour la culture cellulaire
T562lpxrChromaBeam splitter
Trypsin-EDTAGibco15400-054Dissociation de la cellule adhérente
W303 Souche MATaHorizon-DharmaconYSC1058Souche de levure parentale
Base azotée de levureSigma-AldrichY1250Base azotée sans acides aminés
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband miroir dichroïque
Harvard de Harvard

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Microscopie de localisation de mol cule uniqueImagerie des gouttelettes lipidiquesSuivi des acides grasImagerie sur cellules vivantesMicroscopie de fluorescenceOptimisation de la puissance du laserBODIPY C12

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