Préparation de Drosophila Larval et Pupal Testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, Tissu intact

La division cellulaire est souvent étudiée à l’aide de lignées cellulaires cultivées dans la culture¹. Bien que nous ayons acquis une richesse de perspicacité inestimable et la compréhension des mécanismes fondamentaux de ces études², les cellules cultivées dans la culture ne peuvent pas entièrement récapituler la physiologie de la division cellulaire comme il se produit dans intact, tissu vivant. Par exemple, dans les tissus et les organes intacts, les cellules doivent se diviser au bon endroit et au bon moment afin que les cellules progénitrices soient correctement situées dans le tissu, de sorte qu’elles puissent subir une différenciation appropriée ou des programmes fonctionnels, et de sorte que la prolifération cellulaire soit correctement coordonnée avec la croissance des tissus ou l’homéostasie³. Pour les cellules cultivées en culture d’autre part, la division cellulaire est généralement réglementée par des facteurs de croissance dans le milieu de la culture⁴, et donc nous ne pouvons pas apprendre de ces cellules comment in vivo facteurs environnementaux tels que l’architecture tissulaire ou la signalisation développementale influencent le processus de division. Il est également important de noter que beaucoup de lignées cellulaires utilisées pour étudier la division cellulaire, telles que Les cellules HeLa et U2OS, ont été dérivées de tumeurs métastatiques⁵. Par conséquent, de nombreux aspects de la physiologie de base de ces cellules cancéreuses, tels que les mécanismes de régulation du cycle cellulaire et la stabilité chromosomique, ont probablement été modifiés par rapport aux cellules saines. La compréhension complète de la physiologie de division cellulaire dépend donc de notre capacité à étudier les cellules de division dans leurs environnements indigènes in vivo qui préservent les mécanismes physiologiques de régulation et l’architecture tissulaire.

Les progrès dans la compréhension du fonctionnement de la division cellulaire dans les tissus et les organes intacts sont entravés par des difficultés inhérentes à l’analyse in vivo ou ex vivo. Tout d’abord, il peut être difficile ou impossible d’accéder à des cellules de division pour une analyse microscopique dans de grands organes ou des tissus épais. Deuxièmement, il est souvent difficile de prédire quand les cellules individuelles se divisent in vivo. Troisièmement, la physiologie tissulaire peut rapidement se détériorer pendant la culture ex vivo. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes facilement accessibles pour l’analyse vivante et fixe des spermatocytes de mélanogaster de Drosophila pendant qu’ils subissent des divisions méiotiques de cellules dans des testicules entièrement intacts. Ces cellules sont idéales pour l’analyse vivante et ex vivo parce qu’elles sont facilement accessibles avec des méthodes optiques standard telles que la microscopie confocienne, elles se divisent à des moments et des endroits prévisibles, et les testicules intacts peuvent être maintenus dans la culture ex vivo jusqu’à environ 24 h. En outre, les spermatocytes Drosophila sont de grandes cellules rondes (environ 20 à 30 m de diamètre) qui ne changent pas de forme lorsqu’elles se divisent, ce qui les rend idéales pour l’imagerie à haute résolution et en time-lapse des composants cellulaires tels que l’appareil fuseau et les organites cytoplasmiques. Bien que ces cellules subissent la méiose par opposition à la mitose, beaucoup des processus essentiels de division cellulaire sont très semblables entre ces deux mécanismes de division cellulaire⁶. Ces avantages, combinés avec de puissants outils génétiques Drosophila, ont fait des spermatocytes Drosophila un modèle largement utilisé pour l’analyse ex vivo des processus essentiels de division cellulaire, y compris la formation et la régulation des fuseaux, la cytokinésie, et le remodelage et le cloison d’organelle^7,8,9,10,11.

Les spermatocytes sont des cellules qui sont au stade méiotique de la spermatogénèse. Dans Drosophila, la spermatogénèse commence par un groupe de cellules souches germinales qui sont situés dans une petite région ou "hub" à un pôle des testis^12,13. Ces cellules se divisent par une mitose asymétrique, donnant lieu à un spermatogonium différencié unique. Spermatogonia subit alors quatre mitoses synchrones pour produire un groupe de 16 cellules qui restent étroitement associées dans un seul kyste. À ce stade, les cellules passent d’un cycle mitotique à un cycle de cellules méiotiques et sont appelées spermatocytes. Les spermatocytes passent environ deux à trois jours dans une étape étendue du cycle G2 de la cellule, au cours de laquelle ils se développent de façon spectaculaire et subissent des changements cytologiques en préparation pour les deux divisions méiotiques et la spermiogénèse suivante^13,14. Le groupe entier de 16 spermatocytes dans un seul kyste entrent alors dans la première division méiotique en même temps. Ainsi, plusieurs spermatocytes méiotiques peuvent être photographiés simultanément pendant qu’ils procèdent par division cellulaire. La première division méiotique se poursuit pour environ 1,5 h et est suivie presque immédiatement par la deuxième division méiotique, donnant 64 spermiatdés totaux qui continuent à se différencier en spermatozoïde mature.

Un avantage unique de l’utilisation de spermatocytes pour étudier la division cellulaire dans les tissus vivants et intacts est que les groupes ou les kystes des cellules progressent constamment à travers les différents stades de spermatogénèse, et les cellules à tous les stades de la spermatogénèse peuvent généralement être identifiés dans n’importe quel testicule donné (voir la figure 3A). Par conséquent, il est relativement facile de trouver des cellules méiotiques dans des testicules entiers. Nous concentrons généralement nos analyses sur la première par opposition à la méiose seconde parce que ces cellules sont beaucoup plus grandes et plus agréables à l’imagerie à haute résolution, mais l’ensemble du processus englobant les deux divisions méiotiques peut être photographié avec succès. Il convient également de noter que le protocole général pour la préparation et la culture des testicules peut être utilisé pour analyser d’autres processus de spermatogénèse ainsi, tels que les divisions antérieures de cellules souches mitotiques ou spermatogonial ou les changements cytologiques qui se produisent pendant que les spermatotines mûrissent dans spermatozoa¹⁵. Beaucoup de ces aspects de la spermatogénèse sont fortement conservés entre Drosophila et les humains¹⁶.

Les spermatocytes de Drosophila commencent à atteindre la phase méiotique de spermatogénèse pendant le troisième stade larvaire instar du développement de Drosophila ¹³. Par conséquent, les testicules isolés des stades du cycle de vie en commençant par les larves de troisième étoile et y compris les pupes et les adultes peuvent être utilisés pour l’analyse de la division des spermatocytes. Plusieurs protocoles excellents sont disponibles pour l’extraction des testicules de mouches mâles adultes pour l’analyse vivante et fixe de la spermatogénèse^17,18,19. Ces protocoles peuvent être préférables pour étudier les stades avancés de la spermatogénèse ou si les marqueurs génétiques qui ne sont visibles que chez les adultes doivent être utilisés. Le protocole se concentre plutôt sur la préparation des testicules à partir de larves et de pupes précoces, car les testicules à ces stades ont plusieurs avantages qui sont spécifiquement pertinents pour l’analyse de division cellulaire par haute résolution, microscopie time-lapse. Tout d’abord, les testicules des larves et des pupes sont plus petits que ceux des adultes, et les cellules à l’intérieur de l’organe sont moins encombrées. Pour cette raison, la division des spermatocytes peut souvent être imagené près de la surface extérieure des testicules larvaires, sans avoir à pénétrer à travers de multiples couches de tissu de diffusion de la lumière. Deuxièmement, les testicules adultes se déplacent rythmiquement en raison des contractions des organes accessoires attachés, et ces mouvements rendent la formation image en time-lapse des cellules individuelles difficile. Et troisièmement, les testicules larvaires sont avantageux lorsqu’ils étudient les mutations génétiques qui causent la létalité pupale ou adulte. Nos méthodes sont optimisées pour la culture à long terme des testicules au stade du microscope, permettant l’imagerie de plusieurs cycles de division cellulaire ou la progression des cellules individuelles à travers de multiples stades de spermatogénèse dans la même préparation. Nous décrivons également un protocole pour la fixation et l’immunostaining des testicules entiers. Dans l’ensemble, nos protocoles sont particulièrement utiles pour ceux qui s’intéressent à l’étude de la division cellulaire dans les tissus intacts, et la capacité de combiner l’analyse de spermatocytes avec des outils génétiques très tractables Drosophila en fait une approche particulièrement puissante.

1. Préparer les animaux, les outils et les médias pour la dissection

1. Traversez les mouches mâles et femelles pour obtenir la progéniture du génotype désiré. Les marqueurs transgéniques utiles pour l’identification et la mise en scène des spermatocytes méiotiques incluent GFP-tubulin pour étiqueter le fuseau méiotique et la DP-histone 2A pour étiqueter les chromants⁸. Utilisez cinq à dix femelles par croix et maintenez les croix sur les aliments à mouche standard dans des flacons dans un incubateur de 25 oC jusqu’à ce que les larves de l’étoile troisième commencent à ramper sur les côtés de la fiole (4-5 jours). Les premières pupes blanches commenceront à se former un jour plus tard.
2. Obtenez deux paires de forceps droits avec des pointes fines. Assurez-vous que les pointes sont nettes, même en longueur, et droites (figure 1A). Utilisez ces forceps uniquement pour les dissections, et le bouchon avec des pointes de pipette de 10 l lorsqu’ils ne sont pas utilisés.
3. Préparer un outil de scalpel.
   1. Insérez l’extrémité émoussée d’une goupille noire d’insecte en acier anodisé dans un porte-épingle, et tordez la vis du support pour fixer la goupille en place. À l’aide d’une paire de forceps et sous un microscope disséqué, saisissez la goupille d’insecte au milieu et pliez-la pour former un angle interne de 135 degrés(figure 1B). L’extrémité pointue est pour couper le tissu, tandis que le bord est employé pour transférer des testicules entre les gouttes de support.
   2. Capuchon avec une pointe de pipette de 1 000 l lorsqu’il n’est pas utilisé.
4. Travailler dans une hotte de culture tissulaire, préparer 5 mL aliquots des médias de Schneider et stocker à 4 oC jusqu’au moment de l’utilisation. Lorsqu’il est prêt à commencer les dissections, réchauffer un aliquot média de 5 ml à température ambiante. Ensuite, transférer le support de dissection réchauffé dans une seringue de 10 ml et attacher un filtre à seringue de 0,22 m.

2. Dissection des testicules des larves et des pupaes précoces

1. Utilisez la seringue de filtre remplie de supports pour expulser trois gouttes de support (50 ll chacune) en haut, au milieu et au bas d’une glissière en verre.
2. Utilisez une sonde disséquée pour transférer cinq à dix troisième larves instar ou pupes précoces (pupes encore blanches ou jaunes) à la chute supérieure. Agitez doucement les larves et les pupes dans les médias avec la sonde disséquante pour enlever toute nourriture ou débris.
3. Sous un microscope disséqué, tournez une seule larve ou pupe sur le côté avec une sonde disséquante pour identifier les deux testicules bilatéraux s’ils sont présents, qui apparaissent comme des structures translucides ovales dans le tiers postérieur du corps(figure 2A, B). Les animaux qui n’ont pas de testicules sont femelles et doivent être jetés.
4. Lorsqu’une larve ou une pupe mâle est trouvée et est propre, déplacez-la vers la deuxième goutte de médias. Répétez l’opération jusqu’à ce que 3 ou 4 larves mâles et/ou pupes aient été transférées à la deuxième goutte de médias.
5. Travaillant dans la deuxième goutte de médias, saisissez une seule larve mâle ou pupe avec une paire de forceps à sa mi-région, juste antérieur aux testicules. Utilisez la deuxième paire de forceps pour déchirer doucement l’animal en deux.
6. Maintenez l’extrémité postérieure de la larve ou la pupe vers le bas sur la glissière en verre avec une paire de forceps. En commençant juste à côté des forceps, poussez vers le bas sur la cuticule en utilisant le bord de l’outil de scalpel et déplacez le scalpel vers l’extrémité coupée de l’animal. Cela expulsera les organes internes de l’animal, qui comprennent les intestins, les corps gras et les testicules.
7. Taquiner doucement les testicules du reste des organes. Les testicules sont des organes clairs de forme ovale encastrés dans des rubans de graisse corporelle(figure 2C).
8. Transférer les testicules un à la fois à la troisième goutte de médias. Pour ce faire, insérer le bord du scalpel sous le corps gras, soulever le tissu hors des médias, et rapidement le déplacer à la troisième goutte.
9. Alternativement, s’il n’y a pas assez de corps de graisse encore attaché aux testicules pour soulever avec succès le tissu, transférer doucement le tissu à l’aide d’une pipette pasteur en verre qui a été pré-mouillé avec des supports de dissection.
10. Utilisez l’extrémité pointue de l’outil de scalpel pour trancher doucement l’excès de graisse du corps des testicules, laissant juste une petite jante de corps gras autour des bords(figure 2C). Il n’est pas nécessaire d’enlever tout le corps gras, et tenter de le faire entraînera probablement une endommagement ou une rupture des testicules.
11. Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les larves mâles sur la glissière en verre.
12. Procédez soit à l’étape 3, soit à l’étape 5.

3. Montage d’essaiicules pour l’imagerie microscopique en direct

REMARQUE: Cette procédure de montage a été adaptée d’un protocole récemment publié pour l’imagerie des neuroblastes larvaires larvaires de Drosophila ²⁰. Vous trouverez des détails supplémentaires dans cette référence.

1. Utilisez la seringue de filtre pour déposer une seule goutte de supports de Schneider (environ 30 ll) sur le centre d’un plat de culture à gaz de 50 mm perméable.
2. Utilisez une pipette Pasteur pré-mouillée pour transférer les testicules préparés à la goutte sur le plat perméable au gaz. Les testicules flottent généralement à la surface de la chute.
3. Utilisez l’outil scalpel pour pousser doucement les testicules vers le bas sur la membrane perméable au gaz. Veillez à ne pas rompre la membrane perméable au gaz avec le point pointu du scalpel. Poussez tous les testicules au centre de la goutte.
4. Utilisez une seringue de 1 ml remplie d’huile de halocarbone pour faire quatre gouttes d’huile, environ 30 ll chacune, sur la membrane perméable du gaz. Espacez les gouttes d’huile autour de la goutte de support contenant les testicules pour correspondre aux quatre coins d’un housse de verre de 22 mm.
5. Alignez les coins d’un housse en verre de 22 mm avec les quatre gouttes d’huile de halocarbone et abaissez doucement le coverlip sur le support et l’huile. Laissez le coverlip se déposer et que les supports contenant les testicules se propagent entre les gouttes d’huile.
6. Retirez l’excès de support pour permettre au coverlip de s’installer sur la surface des testicules. Tout en observant les testicules sous un microscope disséquant, insérer le coin d’une tâche délicate essuyer dans les médias sous le coverlip pour évincer une petite quantité de liquide. Wick loin assez de médias jusqu’à ce que le coverlip de verre prend juste contact avec la surface des plus grands testis. Il est essentiel de ne pas enlever trop de supports et d’abaisser le coverlip trop loin, car cela exercera une pression sur les testicules et les entraînera à la rupture (voir la figure 5).

4. Imagerie en direct des spermatocytes méiotiques

REMARQUE: Les spermatocytes peuvent être photographiés à l’aide d’un microscope confocal de balayage laser ou de disque tournant. Le système doit avoir une vitesse et une sensibilité adéquates pour éviter le photoblachage des protéines fluorescentes ou le photodamage du tissu.

1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur le housse en verre juste au-dessus des testicules. Retournez sur le plat et placez-le sur le microscope et déplacez l’objectif de microscope (40x ou 60x) dans l’huile jusqu’à ce qu’il soit juste en dessous des testicules. Utilisez la lumière transmise pour trouver un testicule unique et la mettre au point.
2. Tout en capturant des images rapides avec le confocal, déplacez les testicules autour d’examiner l’organisation des cellules. Une extrémité des testicules aura beaucoup de petites cellules densément emballées. Cette extrémité contient les cellules souches germinales et la spermatogonie. Se déplaçant vers l’autre extrémité de l’organe, identifier les cellules progressivement plus grandes organisées en grappes discrètes ou kystes. Ces grandes cellules sont les spermatocytes(figure 3A).
3. Si l’imagerie GFP-tubulin, identifier les spermatocytes qui commenceront la méiose dans les 30-60 min par la présence de deux asters microtubule lumineux (c.-à-d., centrosomes) situés au cortex de la cellule(figure 3B, C).
4. Une fois qu’un kyste de spermatocytes méiotiques a été identifié, configurez des paramètres d’acquisition pour capturer des z-stacks d’images au fil du temps. Typiquement, l’acquisition de 15-20 images espacées de 1,5 m dans la dimension z est suffisante pour capturer le volume complet de plusieurs spermatocytes dans le même kyste.
5. Acquérir des z-stacks complets toutes les 2 minutes si l’imagerie de toute la première division méiotique, qui prend environ 1,5 heures. Il est possible d’utiliser des taux d’acquisition plus rapides, surtout si seulement un événement spécifique de méiose doit être analysé. Cependant, prenez soin de ne pas causer de photoblaching ou de photodamage en raison de l’exposition répétée de l’échantillon à l’excitation laser.
6. Utilisez un système de commande de mise au point automatique et continu pour prévenir la dérive focale au cours de la longue période d’acquisition. Le contrôle de température de l’échantillon au stade du microscope n’est généralement pas nécessaire, en supposant une température ambiante d’environ 22 à 23 oC. Si un contrôle de la température est disponible, maintenez l’échantillon à 25 oC au stade du microscope.
7. Si les spermatocytes méiotiques ne sont pas trouvés, conservez l’échantillon pendant plusieurs heures ou toute la nuit dans un incubateur et une image de 25 oC.

5. Fixation et immunostachation

1. De l’étape 2.10 ci-dessus, utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer les testicules dans un puits dans un plat de dissectage en verre de 9 puits contenant 0,5 mL de paraformaldéhyde de 8% dans PBSTx (phosphate tamponné saline avec 0,3% Triton X-100). Assurez-vous que les testicules sont posés sur le fond du plat.
   REMARQUE: Le paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé avec des gants dans une hotte à fumée.
2. Fixer les testicules pendant 20 minutes à température ambiante.
3. Transférer les testicules dans un puits contenant 0,5 mL PBSTx. Laver pendant 5 min avec une agitation douce. Répétez l’étape de lavage dans de nouveaux puits avec PBSTx frais deux fois de plus.
4. Diluer l’anticorps primaire à la concentration désirée dans 0.5 mL PBSTx contenant 5% d’albumin de sérum bovin (BSA) dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Transférer les testicules du plat de dissectage en verre de 9 puits au tube d’anticorps primaire dilué et incuber toute la nuit à 4 oC avec une légère berçage ou une noix.
5. Laver les testicules dans 0,5 ml de PBSTx pendant 5 minutes dans un puits d’un plat de dissection en verre de 9 puits. Répétez l’étape de lavage avec PBSTx frais deux fois de plus.
6. Diluer l’anticorps secondaire dans 250 l 'L de PBSTx contenant 5% BSA et distribuer dans un puits propre d’un plat de dissection de verre 9-bien. Si désiré, ajouter DAPI à tacher l’ADN. Transférer les testicules vers le puits contenant des anticorps secondaires, couvrir d’une pellicule plastique et incuber dans l’obscurité avec une agitation douce pendant 4 heures à température ambiante.
7. Transférer les testicules à un puits propre rempli de 0,5 ml de PBSTx. Laver avec PBSTx frais deux fois pendant 5 min et une troisième fois pendant 30 min.

6. Montage des testicules fixes

1. Transférer les testicules du dernier lavage sur une glissière en verre à l’aide d’une pipette Pasteur. Si nécessaire, utilisez le bord de l’outil scalpel pour pousser les testicules vers le bas sur la surface de la glissière.
2. Utilisez le coin d’une tâche délicate essuyer pour éventer l’excès de liquide des testicules. Retirer autant de liquide que possible.
3. Appliquer une goutte de microscopie de 30 à 50 l de mioscopie à la vitesse des testicules.
4. Placez un housse de 22 mm sur la goutte de support de montage et laissez reposer le coverlip et le support de montage pour se propager sous le coverlip. Appliquer une légère pression sur le coverlip si nécessaire pour presser l’excès de support de montage et permettre au coverlip de se reposer sur la surface des testicules.
5. Utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords du coverlip.

Lorsque ce protocole est exécuté avec succès, les testicules resteront entièrement intacts pour l’imagerie par microscopie confocienne ou d’autres méthodes de microscopie de fluorescence. Comme on le voit dans la figure 3A, l’organisation cellulaire des testicules est préservée, et la progression de la différenciation cellulaire d’une extrémité des testicules à l’autre, y compris la spermatogonie, les spermatocytes et les spermiatdés haploïdes est visible. GFP-tubulin est un marqueur utile pour identifier la division des spermatocytes et pour l’imagerie vivante de la progression des cellules par la méiose. Comme le montre la figure 3B, les spermatocytes au sujet de la méiose de départ peuvent être identifiés par leurs deux asters de microtubule proéminents. En métaphase, les gros fuseaux méiotiques sont magnifiquement étiquetés par GFP-tubulin(figure 3C).

La grande taille des spermatocytes de Drosophila et leur progression lente relative par la méiose les rendent idéales pour l’analyse de la dynamique et de la réorganisation des composants cellulaires tels que les organites cytoplasmiques pendant la division cellulaire8,,11,21. La figure 4 et la vidéo 1 montrent l’analyse d’imagerie en direct de la réorganisation dynamique du réticulum endoplasmique (ER) en ce qui concerne les microtubules au cours de la méiose. Comme décrit ci-dessus, pendant l’interphase tardive juste avant l’apparition de la méiose, deux centrosomes situés au cortex de la cellule sont clairement visibles par la fluorescence de GFP-tubulin. À ce stade, la fluorescence de la DP (RFP-KDEL) ciblée par les urgences révèle que l’ER est réparti uniformément dans tout le cytoplasme. Les centrosomes commencent alors à migrer vers les côtés opposés de l’enveloppe nucléaire pour établir les deux poteaux de fuseau. Pendant ce temps, l’ER s’accumule rapidement autour des microtubules centrosomales et est progressivement effacé du reste du cytoplasme. La dégradation de l’enveloppe nucléaire (ONÉ) est révélée par l’apparition de la fluorescence GFP-tubulin dans la région nucléaire. Il convient de noter que les cellules Drosophila se divisent par la mitose semi-ouverte ou la méiose, ce qui signifie que les composants de l’enveloppe nucléaire se décomposent et se dispersent et de grandes molécules cytoplasmiques entrent dans la région nucléaire, mais une enveloppe de membranes dérivées d’ER entoure le fuseau et les chromatides à travers la division cellulaire22,23,24. Au moment de l’ONÉ et en progressant à travers la métaphase, l’ER est presque entièrement associé aux microtubules astrales qui entourent les deux centrosomes de mâts fuseaux. Ces deux accumulations de microtubule astrale de l’ER puis la partition aux deux cellules de fille pendant l’anaphase, assurant l’héritage approprié d’ER par les cellules nouvellement formées8,11.

La figure 5 montre les effets de la rupture des testicules sur l’imagerie vivante des spermatocytes. Comme décrit dans le protocole, il faut faire très attention de ne pas abaisser le coverlip trop loin sur la surface des testicules pendant les étapes de montage, car cela exercera une pression sur les testicules et les fera éclater. Comme on le voit dans la figure 5 et la vidéo 2, les kystes des spermatocytes sortent rapidement des testicules rompus, et ce mouvement des cellules rend l’imagerie vivante et en time-lapse extrêmement difficile.

Figure 1 : Outils nécessaires pour une dissection réussie. (A) Les Forceps utilisés pour la dissection doivent être droits et avoir des pointes nettes et ininterrompues (indiquées par la marque de contrôle verte). N’utilisez pas de forceps avec des pointes pliées ou cassées (marques X rouges), car elles seront inefficaces pour saisir les larves et taquiner les tissus. (B) Pour préparer l’outil scalpel, plier une goupille noire d’insecte en acier anodisé à un angle interne d’environ 135 degrés. Le point pointu est utilisé comme un couteau pour couper à travers les tissus, et le bord droit est utilisé pour le déplacement des tissus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Identification des testicules larvaire et pupal. (A) Images de larves mâles et femelles. Les testicules sont identifiables chez le mâle comme les structures translucides circulaires ou ovales dans le tiers postérieur de l’animal (pointe de flèche). Notez l’absence d’une structure similaire chez la femelle. (B) Image d’une pupe mâle précoce, avec les deux testicules translucides indiqués par des pointes de flèche. (C) Testes avec des corps de graisse attachés après dissection. Les deux testicules sur la gauche ont des corps graisseux excessifs encore attachés qui doivent être coupés loin. Les deux testicules de droite ont été correctement coupés de leur corps gras et sont prêts pour l’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Identification des spermatocytes méiotiques dans un testicule bien préparé. (A) Image confocale d’un testicule vivant et intact préparé avec succès exprimant GFP-tubulin. Le moyeu des cellules souches est situé vers la pointe inférieure des testicules, bien qu’il ne soit pas identifiable dans cette préparation. Plusieurs couches de petites spermatogonia sont indiquées, et celles-ci sont suivies par de nombreux kystes de spermatocytes. Un kyste de spermatocytes dans la première division méiotique est identifiable basé sur la grande taille des cellules (environ 20 à 30 m de diamètre) et la présence de fuseaux méiotiques étiquetés GFP-tubulin. Les spermatocytes dans la deuxième division méiotique ont également des fuseaux, mais ces cellules sont approximativement la moitié de la taille des cellules I de méiose. Les spermiatdés post-méiotiques sont également visibles, tout comme l’elongating spermatozoa. (B) Spermatocytes qui commenceront la méiose dans les 30 - 60 min peuvent être identifiés par leurs deux grands asters microtubule très lumineux (indiqué par des têtes fléchées) étiquetés par GFP-tubulin. Le kyste des cellules pré-méiotiques est délimité par la ligne jaune pointillée. (C) Les cellules de la méiose sont identifiables par leurs grandes broches méiotiques qui sont facilement visualisées avec GFP-tubulin. Le kyste des cellules méiotiques est délimité par la ligne jaune pointillée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Imagerie en accéléré de la méiose dans un seul spermatocyte. Un seul spermatocyte co-exprimant GFP-tubulin et RFP ciblées à l’ER (RFP-KDEL) a été photographié toutes les deux minutes au cours de la méiose. Les images représentatives du spermatocyte à des stades spécifiques de la méiose, commençant par interphase tardif et progressant par telophase. Les temps sont en quelques minutes. Chaque image est un seul plan optique à partir d’une pile de quinze tranches optiques acquises à chaque point de temps. Ce chiffre a été modifié à partir de Karabasheva et Smyth, 20198. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Images représentatives d’un testicule avant et après la rupture. L’image de gauche, étiquetée "Intact", montre un GFP-tubulin exprimant des testicules juste avant la rupture. L’image de droite montre les mêmes testicules après la rupture. Des kystes de spermatocytes peuvent être vus en streaming hors des testicules rompus. Les pointes de flèche indiquent un kyste des spermatocytes méiotiques ; Notez le mouvement significatif de ces spermatocytes après les ruptures de testis, rendant l’imagerie de ces spermatocytes au fil du temps extrêmement difficile. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo 1: Division méiotique complète d’un spermatocyte unique. On y voit le temps plein de la GFP-tubulin et de la DP-KDEL exprimant le spermatocyte dans la figure 4. Les images ont été capturées toutes les deux minutes, et le taux de lecture est de trois images par seconde. Cette vidéo a été modifiée à partir de Karabasheva et Smyth, 20198. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Testicules rompus. Time-lapse d’un testicule avant et après la rupture. La rupture est évidente en raison de la diffusion soudaine de kystes de cellules à travers le coin inférieur gauche des testicules. Les images ont été capturées toutes les deux minutes, et le taux de lecture est de trois images par seconde. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.