Capture d’ADN environnemental (ADNe) à partir d’échantillons d’eau par floculation

Résumé

L’ADN environnemental (ADNe) est généralement capturé à partir d’échantillons d’eau par précipitation d’alcool, filtration ou floculation. Voici un protocole alternatif qui utilise du chlorure de lanthane pour permettre la collecte d’acides nucléiques dissous et liés aux particules à partir d’échantillons d’eau contenant des cellules eucaryotes, des cellules procaryotes et des virus.

Résumé

L’analyse de l’ADN environnemental (ADNe) est devenue une approche largement utilisée pour résoudre les problèmes dans la gestion des espèces. L’objectif est de détecter les espèces cryptiques, y compris les espèces envahissantes et les espèces en péril, généralement en analysant l’eau et les sédiments pour détecter la présence de signatures d’ADN caractéristiques. Des procédures fiables et efficaces pour la capture de l’ADNe sont nécessaires, en particulier celles qui peuvent être facilement exécutées sur le terrain par du personnel ayant une formation limitée et des scientifiques citoyens. La capture de l’ADNe à l’aide de la filtration membranaire est largement utilisée actuellement. Cette approche présente des problèmes inhérents qui incluent le choix du matériau filtrant et de la porosité, l’encrassement du filtre et le temps nécessaire sur site pour que le processus soit effectué. La floculation offre une alternative qui peut être facilement mise en œuvre et appliquée à des régimes d’échantillonnage qui s’efforcent de couvrir de vastes territoires en un temps limité.

Introduction

Avant le milieu des années 2000, le terme « ADN environnemental » était généralement utilisé pour désigner l’ADN obtenu à partir de microbes de l’eau et du sol, bien que certaines utilisations pour la détection de l’ADN humain et animal à des fins de suivi des sources fécales ou de détection d’espèces non indigènes aient commencé ^1,2,3. À l’heure actuelle, l’ADN environnemental est généralement utilisé pour décrire l’ADN des cellules provenant d’organismes eucaryotes, et l’analyse de cet ADN est devenue un outil de gestion largement utilisé. ....

Protocole

1. Décontamination de l’équipement et préparation du réactif de floculation

1. Lavez soigneusement toutes les bouteilles, tubes et autres équipements précédemment utilisés avec du détergent à vaisselle et de l’eau chaude.
2. Vaporisez toutes les bouteilles, les tubes et tout autre équipement précédemment utilisé avec une solution d’acide citrique à 6 % pour éliminer les dépôts minéraux, laissez reposer 20 minutes et rincez à l’eau du robinet.
3. Ajouter une solution d’eau de Javel domestique diluée 10 fois (concentration finale de 0,5 à 0,6 % d’hypochlorite de sodium) à toutes les bouteilles (environ 10 % du volume du contenant), agiter, laisser....

Résultats

Huit échantillons d’eau de 500 mL (450 mL chacun) prélevés dans un aquarium abritant deux tortues peintes de l’Est (Chrysemys picta picta) ont été utilisés pour préparer l’ADNe selon le protocole décrit. Huit autres échantillons d’eau de 500 mL ont été filtrés sur des filtres en fibre de verre de 47 mm de porosité de 1,5 μm ne contenant aucun liant et l’ADNe a été extrait à l’aide de la même méthode d’extraction que celle utilisée pour le protocole de floculation. L’ADN préparé à l’aide des deux méthodes a été a.......

Discussion

Bien que cette technique soit simple, certaines étapes sont essentielles au succès. La collecte et le transfert des flocs doivent se faire complètement afin de ne pas perdre d’ADN. Les matières résiduelles doivent être récupérées à l’aide de rinçages stratégiques. Le protocole décrit utilise un kit d’extraction d’ADN commercial pour le traitement final de la matière floculée. D’autres méthodes d’extraction peuvent avoir des performances similaires ou supérieures, mais les modifications a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 M EDTA, pH 8,0	Disponible auprès de plusieurs sources
1 x tampon TE, pH 8,0	Disponible auprès de plusieurs sources
Tubes à centrifuger coniques de 15 ml Bouteilles	usage
de 16 oz	Réutilisables avec nettoyage et décontamination
Bouchon en polypropylène 38/400 avec sensible à la pression Liner	Laissez les capuchons fixés sans serrer jusqu’à utilisation. Fermez hermétiquement pour sceller la doublure sensible à la pression.
Tubes à centrifuger coniques de 50 ml Solution	d’acide
6 %	À utiliser pour éliminer les dépôts minéraux des bouteilles d’échantillon réutilisables.
Kit de microbes fécals/salis	Utilisez une résine ou une colonne
Chlorure de lanthane (III) heptahydraté	100 mM Solution
Pompe à courant continu péristaltique	N’importe quelle pompe péristaltique fera l’affaire, ou peut être siphonnée
Support de polyacryle	10 % linéaire
sodium	1 M, filtre stérilisé et stocké à température

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