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Article de méthode

Élimination des neurones sérotoninergiques par injection stéréotaxique de 5,7-dihydroxytryptamine dans les noyaux du raphé dorsal de souris

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DOI :

10.3791/60968

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1 mai 2020

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1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, Frontier Science Center for Stem Cell Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Department of Ophthalmology, Shanghai Tenth People's Hospital Affiliated to Tongji University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un modèle murin lésionné du noyau du raphé dorsal (DRN) (taux de survie de >90 % chez les souris expérimentales) avec une perte stable des neurones sérotoninergiques du raphé dorsal par injection stéréotaxique de 5,7-dihydroxytryptamine dans le DRN en utilisant une approche inclinée pour prévenir les lésions du sinus sagittal supérieur.

Résumé

L’injection stéréotaxique a été largement utilisée pour l’administration directe de composés ou de virus à des zones cérébrales ciblées chez les rongeurs. Le ciblage direct des neurones sérotoninergiques dans le noyau du raphé dorsal (DRN) peut provoquer des saignements excessifs et la mort d’animaux, en raison de son emplacement sous le sinus sagittal supérieur (SSS). Ce protocole décrit la génération d’un modèle murin sérotoninergique lésionné par des neurones DRN (taux de survie de >90 %) avec une perte stable de >70 % de cellules 5-HT-positives dans le DRN. La lésion est induite par l’injection stéréotaxique d’une neurotoxine sérotoninergique sélective 5,7-dihydroxytryptamine (5,7-DHT) dans le DRN en utilisant une approche inclinée (30° dans la direction antérieure/postérieure) pour éviter de lécher le SSS. Les souris atteintes de lésions neuronales sérotoninergiques DRN présentent des altérations du comportement associées à l’anxiété, ce qui contribue à confirmer le succès de la chirurgie des lésions DRN. Cette méthode est utilisée ici pour les lésions DRN, mais elle peut également être utilisée pour d’autres injections stéréotaxiques qui nécessitent des injections angulaires pour éviter les structures médianes. Ce modèle murin de neurones sérotoninergiques DRN fournit un outil précieux pour comprendre le rôle des neurones sérotoninergiques dans la pathogenèse des troubles psychiatriques, tels que le trouble d’anxiété généralisée et le trouble dépressif majeur.

Introduction

La sérotonine, ou 5-hydroxytryptamine (5-HT), est un neurotransmetteur important principalement produit dans les intestins et le cerveau et a un impact sur diverses fonctions psychologiques. Dans le système nerveux central (SNC), le système sérotoninergique joue un rôle central dans la régulation de l’humeur et du comportement social, du sommeil et de l’éveil, de l’appétit, de la mémoire et du désir sexuel. Dans le SNC, la sérotonine est synthétisée par les neurones sérotoninergiques, qui peuvent être séparés en deux groupes : le groupe rostral, qui a des projections ascendantes innervant pratiquement tout le cerveau ; et le groupe caudal, qui se projette principalement vers la moelle épinière1. Le groupe rostral, qui contient environ 85 % des neurones sérotoninergiques du cerveau, est composé du noyau linéaire caudal, du noyau médian du raphé et du DRN, dans lequel se trouve la plus grande population de neurones sérotoninergiques du cerveau.

On pense généralement que la dérégulation du système sérotoninergique est liée à la pathogenèse du trouble dépressif majeur (TDM) et des troubles anxieux généralisés (TAG)2. Cela est dû au fait que les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS) sont un traitement pharmacologique efficace pour ces troublespsychiatriques3,4. De plus, des preuves accumulées suggèrent que la manie5 et le comportement suicidaire6 peuvent être associés à des niveaux plus faibles de fonctionnement de la sérotonine dans le DRN. Il a également été signalé que Pet1-Cre ; Les souris Lmx1bflox/flox et les souris hTM-DTAiPet1 (modèles de souris génétiques dépourvus de la plupart des neurones sérotoninergiques centraux de la fin du stadeembryonnaire 7 et de l’âgeadulte 8, respectivement) présentent une mémoire contextuelle de peur améliorée. Cependant, malgré des recherches approfondies, l’implication exacte des neurones sérotoninergiques DRN dans ces troubles psychiatriques reste à élucider.

Afin d’explorer les mécanismes par lesquels les neurones sérotoninergiques DRN régulent la pathogenèse des troubles psychiatriques associés à la sérotonine, des modèles animaux ont été générés. Des outils optogénétiques ont été appliqués pour inhiber les neurones sérotoninergiques chez le rat DRN, et ces animaux présentent une augmentation des comportements anxiogènes9. Cependant, l’optogénétique a des limites. Par exemple, un dispositif d’administration de lumière doit être implanté dans la région ciblée profonde du cerveau, et les tissus environnants peuvent être blessés lors d’une chirurgie d’implantation ou par la chaleur émise par l’appareil lumineux. Même si l’altération de la température ne peut pas causer de lésions détectables aux tissus cérébraux, elle peut tout de même induire des effets physiologiques et comportementaux remarquables10.

La manipulation pharmacologique peut être une approche plus facile pour créer des modèles animaux atteints de lésions neuronales sérotoninergiques DRN. Certains groupes ont généré des rats atteints de lésions neuronales sérotoninergiques DRN par micro-injection stéréotaxique de neurotoxine sérotoninergique 5,7-DHT dans le DRN. Cependant, ces modèles de rats présentent différentes altérations comportementales, telles que le comportement anxiolytique11, l’augmentation du comportement anxiolytique12 et la mémoire d’objets altérée13. Malgré de nombreuses études chez le rat, moins d’études ont été réalisées sur les influences de la 5,7-DHT sur les souris. Un groupe a signalé une mortalité excessive (>50 %) et une déplétion limitée en sérotonine chez des souris expérimentales ayant reçu des micro-injections stéréotaxiques de 5,7-DHT dans le DRN14. Un autre groupe a rapporté que le stress chronique léger imprévisible (UCMS) peut induire une altération significative de la latence d’attaque chez les souris atteintes de lésions DRN induites par la 5,7-DHT. Cependant, aucun résultat histologique n’a été fourni pour confirmer la perte exacte de neurones sérotoninergiques dans le DRN15. L’injection stéréotaxique dans le DRN à l’aide de procédures standard peut entraîner des saignements massifs et une mortalité élevée chez les souris, étant donné que la position anatomique du DRN est inférieure à la SSS16.

Ce protocole décrit le protocole permettant de générer un modèle murin de neurones sérotoninergique DRN (taux de survie de >90 % des souris expérimentales) avec perte stable de neurones sérotoninergiques DRN par injection stéréotaxique de 5,7-DHT. L’injection dans DRN utilise une approche inclinée pour éviter de blesser le SSS. Cette chirurgie provoque systématiquement une perte de >70 % de neurones sérotoninergiques dans le DRN des souris, et elle produit des altérations du comportement associées à l’anxiété. Le protocole utilisé ici permet d’induire des lésions DRN, mais il peut également être utile aux chercheurs qui souhaitent effectuer des injections stéréotaxiques dans d’autres structures de la ligne médiane. De plus, ce modèle murin de neurones sérotoninergiques DRN fournit un outil précieux pour comprendre le rôle des neurones sérotoninergiques dans les troubles psychiatriques (c’est-à-dire le TDM et le TAG) et évaluer les agents neuroprotecteurs potentiels ou les stratégies thérapeutiques pour ces conditions.

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Protocole

Toutes les interventions chirurgicales et les procédures de soins aux animaux ont été approuvées par le Comité des animaux de l’École des sciences et technologies de la vie de l’Université de Tongji, à Shanghai, en Chine.

1. Logement des animaux

  1. Maintenir les souris C57BL/6NCrl mâles (âgées de 10 semaines, 25 g, n = 21) dans des conditions normales (température de 24 °C ; 55 % d’humidité) sous un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h.
  2. Fournir de la nourriture et de l’eau à volonté.
    REMARQUE : Ici, trois des souris sont utilisées pour confirmer la trace de l’aiguille.

2. Préparation des réactifs

REMARQUE : Toutes les étapes de préparation du médicament doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination. Toutes les solutions préparées sont conservées dans un congélateur à -80 °C. Il est recommandé d’utiliser une aliquote à la fois, de décongeler complètement, de bien mélanger avant utilisation, de jeter les restes dans le tube et d’éviter la congélation et la décongélation répétées.

  1. Dissoudre 0,25 g de chlorhydrate de désipramine dans 100 mL de solution saline à 0,9 % pour obtenir une solution à 2,5 mg/mL. Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre à seringue avec une membrane PES hydrophile de 0,22 μm de taille de pore. Ensuite, aliquote la solution (1,8 mL/tube) dans des tubes de microcentrifugeuse (EP) de 2 mL. Étiquetez, datez et conservez immédiatement dans un congélateur à -80 °C. La posologie recommandée pour l’utilisation animale est de 25 mg/kg.
  2. Dissoudre 5 mg de 5,7-DHT dans 1,67 mL de solution saline à 0,9 % contenant 0,1 % d’acide ascorbique pour obtenir une solution à 3 g/μL. Agitez doucement pour mélanger, stérilisez la solution à l’aide d’un filtre à seringue (pores de 0,22 μm) et aliquote la solution (10 μL/tube) dans des tubes EP de 0,5 mL. Étiquetez, datez et congelez immédiatement à -80 °C. La posologie recommandée pour l’utilisation animale est de 2 μL/souris.
  3. Dissoudre le kétoprofène (analgésique) en suivant la méthode décrite précédemment17. Dissoudre 250 mg de kétoprofène dans 15 mL d’eau et 1 mL de 1 M de NaOH, ajuster le pH à 7,3 et augmenter le volume final à 125 mL, ce qui donnera une concentration finale de 2 mg/mL. Stériliser la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm et aliquote de la solution (0,4 mL/tube) dans des tubes EP de 1,5 mL. Étiquetez, datez et congelez à -80 °C jusqu’à utilisation. La posologie recommandée pour l’utilisation animale est de 5 mg/kg.

3. Préparation des instruments et des souris

  1. Préparez une trousse chirurgicale (contenant un scalpel, une paire de pinces à tissus, une paire de ciseaux, un porte-aiguille, des sutures 3-0, des étiquettes d’oreille et un applicateur d’étiquette d’oreille) préalablement stérilisée dans des autoclaves à haute température. Placez de l’éthanol à 75 %, de la povidone iodée, du peroxyde d’hydrogène à 3 %, une solution pour véhicule (0,1 % d’acide ascorbique dans une solution saline à 0,9 %), un coton-tige, un onguent ophtalmique à l’ofloxacine et une cage de récupération pour souris sur un coussin chauffant, à l’aide d’une seringue Hamilton avec une aiguille de 32 g et une seringue de 1 cc.
  2. h avant l’injection de 5,7-DHT, peser et consigner le poids corporel des souris, puis les soumettre à des injections intrapéritonéales (i.p.) de désipramine (2,5 mg/mL, 10 μL/g de poids).
    REMARQUE : Le but de l’administration de désipramine 1 h avant l’injection de 5,7-DHT est de prévenir la perte de cellules catacholaminergiques18.
  3. Anesthésier les souris à l’aide d’une anesthésie par inhalation d’isoflurane (3 % pendant l’induction, 1,5 % pendant l’entretien, débit = 2 L/min). Administrer du kétoprofène (2 mg/mL, 2,5 μL/g en poids) par injection sous-cutanée (s.c.). Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie par l’absence de réponse de pincement de la queue.

4. Injection stéréotaxique

  1. Placez la souris anesthésiée sur la plate-forme stéréotaxique, puis fixez sa tête avec les barres d’oreille et la barre incisive de l’appareil stéréotaxique.
  2. Rasez la tête de la souris, puis nettoyez le cuir chevelu exposé avec un gommage d’éthanol à 75 % suivi d’un gommage de povidone iodée.
  3. Appliquez la pommade à la lidocaïne sur le cuir chevelu à l’aide d’un coton-tige pour fournir une analgésie locale. Mettez une pommade oculaire à l’ofloxacine sur les yeux pour protéger la cornée.
  4. Faites une incision sur le cuir chevelu le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel de 1 mm en arrière des yeux jusqu’à la ligne interaurale.
  5. Utilisez un écouvillon imbibé de peroxyde d’hydrogène à 3 % pour retirer le périoste, puis séchez le crâne et exposez les sutures crâniennes. Marquez l’emplacement du bregma et du lambda.
  6. Ajustez la position de la tête à l’aide de la barre incisive jusqu’à ce que le bregma et le lambda reposent dans le même plan horizontal. Ajustez la pointe de l’aiguille pour toucher le bregma ou le lambda, notez les coordonnées médiale/latérale (ML) et dorsale/ventrale (DV) et ajustez la barre d’incisive de sorte que les coordonnées DV et ML du bregma et de la lambda soient égales, respectivement.
  7. Déverrouillez le bouton de positionnement perpendiculaire et la vis de verrouillage, puis réglez le bras manipulateur (axe z) à 30° dans la direction avant/postérieure (AP) comme illustré sur les figures 1A, B. Verrouillez le bouton.
  8. Fixez la seringue Hamilton remplie de 2 μL de 5,7-DHT (3 μg/μL) sur le support (pour le groupe fictif, les souris sont injectées avec une solution saline à 0,9 % contenant 0,1 % d’acide ascorbique). Ajustez la pointe de l’aiguille pour toucher le point de repère du bregma, puis mettez à zéro les valeurs ML, AP et DV à l’aide du module d’affichage numérique.
    REMARQUE : La solution 5,7-DHT est un liquide de couleur brune, ce qui permet de déterminer facilement si la seringue Hamilton est correctement remplie. S’il n’y a pas d’accès à un module d’affichage numérique, enregistrez le numéro affiché sur trois axes lorsque la pointe de l’aiguille touche le bregma, et les coordonnées finales représentent « le nombre enregistré plus la coordonnée fournie dans ce protocole ». Par exemple, si le numéro enregistré sur le bras manipulateur de l’axe y (direction A/P) est « a », alors la coordonnée finale dans la direction A/P doit être « a - 6,27 ».
  9. Déplacez le bras manipulateur pour ajuster la pointe de l’aiguille à la position d’injection (APa = -6,27, ML = 0 ; la formule de calcul des coordonnées finales est indiquée à la figure 1B). Marquez la position cible à l’aide d’un marqueur.
  10. Percez le trou de la meule à l’aide d’une perceuse à grande vitesse à micromoteur portable, puis déplacez le bras manipulateur pour abaisser la pointe de l’aiguille vers la cible (DVa = -4,04). Injectez lentement 2 μL de la solution dans le cerveau (0,5 μL/3 min), en gardant l’aiguille sur place pendant 5 minutes supplémentaires pour éviter les fuites de solution. Retirez l’aiguille doucement après l’injection.
  11. Appliquez des sutures interrompues sur l’incision à l’aide de sutures 3-0. Enveloppez l’incision suturée avec un coton-tige imbibé de povidone iodée pour éviter l’infection.
  12. Nettoyez l’oreille droite avec un coton-tige à la povidone iodée, puis appliquez l’étiquette d’oreille stérilisée à la base de l’oreille pour l’identification.
  13. Retirez les souris expérimentales de l’appareil stéréotaxique et placez-les dans une cage de récupération de souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce que la récupération complète de l’anesthésie soit observée.

5. Soins postopératoires des souris

  1. Soumettre les souris à des injections de kétoprofène 1x/jour jusqu’à 2 jours après la chirurgie.
  2. Inspectez les souris tous les jours jusqu’à 7 jours après la chirurgie.

6. Test de labyrinthe en T élevé

REMARQUE : Effectuez le test comme décrit précédemment 19,20.

  1. Assurez-vous que le test du labyrinthe en T surélevé (ETM) est composé de deux bras ouverts (30 cm x 5 cm x 0,5 cm) perpendiculaires à deux bras fermés (30 cm x 5 cm x 16 cm x 0,5 cm) avec une plate-forme centrale (5,0 cm x 5,0 cm x 0,5 cm). L’un des bras fermés est bloqué par une feuille de plastique opaque pour former une forme en T (Figure 2A).
  2. Trois jours avant le test ETM, habituez les animaux en les manipulant quotidiennement pendant 5 min.
  3. Le 30e jour après l’opération, effectuez le test ETM.
  4. Le jour du test comportemental, exposez les souris à l’un des bras ouverts pendant 10 min.
  5. Pour les tests d’évitement inhibiteur, placez chaque souris dans l’extrémité distale du bras fermé et notez le temps nécessaire pour quitter ce bras avec quatre pattes dans trois essais. Le premier essai est l’évitement de base, le deuxième essai est l’évitement 1 et le troisième essai est l’évitement 2.
  6. Gardez les souris dans leur cage pendant 30 secondes entre les traînées et établissez un temps limite (ici, 300 s sont utilisés pour chaque essai).

7. Perfusion, fixation, coloration immunohistochimique et quantification

  1. À la fin de l’étude (35 jours après l’intervention, après le test comportemental), effectuez une perfusion et une fixation du corps entier une fois que la souris est sous anesthésie générale.
    1. Anesthésie la souris comme décrit à l’étape 3.3. Placez la souris profondément anesthésiée en décubitus dorsal.
    2. Mouillez la fourrure avec de l’alcool à 75 % sur toute la zone ventrale.
    3. Faites une incision sous le sternum suivie d’une incision en forme de V dans la cage thoracique. Saisissez la cage thoracique à l’aide de la pince pour exposer le cœur.
    4. Insérez l’aiguille de perfusion veineuse dans le ventricule gauche, puis coupez immédiatement l’appendice auriculaire avec des ciseaux pour laisser le sang s’écouler.
    5. Allumez la pompe péristaltique pour perfuser une solution saline dans tout le corps à travers le système circulatoire. Passez d’une solution saline à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) lorsque le liquide sortant de l’oreillette droite devient clair et lorsque le foie passe du rouge au rouge pâle. Perfuser 5 mL supplémentaires de PFA à 4 % lorsque la queue de la souris bouge et que le corps est raide.
      REMARQUE : Le balancement de la queue de la souris est le signe d’une perfusion adéquate.
  2. Isolement du cerveau après perfusion intracardiaque avec 4 % de PFA
    1. Décapitez la souris à l’aide de gros ciseaux, puis coupez la peau pour exposer le crâne.
    2. Faites deux incisions à la base du crâne (reliée au cou), faites une incision le long de la ligne reliant les yeux, puis coupez le crâne le long de la suture sagittale. Saisissez et décollez le crâne de chaque hémisphère vers l’extérieur pour exposer le cerveau à l’aide d’une pince.
      REMARQUE : La coupe du crâne le long de la suture sagittale doit être effectuée avec soin, sinon le cerveau peut être endommagé et se séparer en parties.
    3. Retirez le cerveau et placez-le dans 4 % de PFA à 4 °C pendant la nuit pour la post-fixation, puis transférez le cerveau dans du saccharose à 30 % jusqu’à ce qu’il coule au fond.
      REMARQUE : La déshydratation à l’aide de 30 % de saccharose n’est pas nécessaire si les sections sont coupées avec un vibratome.
  3. Absorbez tout excès de liquide autour du tissu à l’aide d’une serviette en papier avant de l’encastrer. Intégrez le tissu cérébral dans l’OCT avec la face rostrale sur le mandrin.
    REMARQUE : L’orientation de l’échantillon est importante. La face rostrale du cerveau doit être attachée au mandrin pour s’assurer que le tranchant est la partie caudale.
  4. Coupez une section coronale du DRN (4,0 à 4,8 mm en arrière du bregma) à 30 μm d’épaisseur (intervalles de quatre sections) à l’aide d’un cryostat et collectez les sections dans du PBS. Conserver dans une solution de cryoconservation par section cérébrale (SCS) à -20 °C.
    REMARQUE : L’identification du DRN est très importante. Les structures anatomiques consécutives sont illustrées aux figures 3A à H. Les structures caractéristiques sont les suivantes : renfoncement latéral du quatrième ventricule (LR4V, trait rouge sur les figures 3A, E), quatrième ventricule (4V, triangle en tiret rouge sur les figures 3B, F), deuxième lobule cérébelleux (2Cb, structure en forme de losange sur la figure 3C/G) et aqueduc (Aq, trou de tiret rouge sur la figure 3D,H). Commencer à prélever les tissus lorsque les structures sont observées comme le montre la figure 3D,H, puis couper en sections de 30 μm d’épaisseur (intervalles de quatre sections) pour obtenir 24 sections coronales totales. La coloration H&E des sections est illustrée (Figure 3E–H). La quatrième section de chacune des quatre sections sera sélectionnée pour effectuer une coloration immunofluorescente. Les sections restantes sont stockées dans le SCS. S’il est difficile de reconnaître les structures, il est utile de monter une partie des sections sur la glissière.
  5. Effectuer un dosage immunohistochimique tel que décrit précédemment 21,22.
  6. Comptez les cellules 5-HT positives à différents niveaux de section dans l’ensemble du DRN à l’aide d’ImageJ.

8. Analyse statistique

  1. Utilisez un logiciel statistique pour l’analyse des données. Exprimez les résultats sous forme ± SEM.
  2. Traitez les valeurs pour l’analyse statistique à l’aide d’une ANOVA à deux facteurs ou d’un test t non apparié et considérez les différences comme significatives à **p < 0,01.

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Résultats

Dans une coupe coronale, l’emplacement du DRN se situe juste en dessous du SSS et de l’aqueduc (Figure 1B,C) ; ainsi, le ciblage du DRN à l’aide de procédures standard peut entraîner des hémorragies massives et une mortalité élevée chez les souris16. Par conséquent, des injections stéréotaxiques ont été effectuées ici en utilisant une approche inclinée au lieu de l’approche verticale standard pour éviter d’endommager le SSS (Figur...

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Discussion

Ce protocole décrit avec succès la production d’un modèle murin fiable de neurones sérotoninergiques DRN avec une reproductibilité élevée des lésions et un faible taux de mortalité. Cibler le DRN est une tâche complexe, car il peut endommager le SSS situé juste au-dessus du DRN16 et entraîner des saignements excessifs et même la mort14. Par conséquent, des injections stéréotaxiques ont été effectuées en réglant le bras de manipulation à 30°...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme national de recherche et de développement clés de la Chine [numéros de subvention 2017YFA0104100] ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [Subventions n° 31771644, 81801331 et 31930068] ; et les Fonds pour la recherche fondamentale pour les universités centrales.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre à seringue 0,22 micronMilliporeSLGPRB
3 % peroxyde d’hydrogèneCaoshanhu Co., Ltd, Jiangxi, Chine
5,7-DihydroxytryptamineSigma-AldrichSML20583ug/ul, 2ul
Appareil d’anesthésie compact pour petits animauxRWD Life Science Co., LtdSérie
CryostatLeica Biosystems, Wetzlar, AllemagneCM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-165-0031:2,000
dapiSigma-AldrichD8417
chlorhydrate de desipramineSigma-AldrichPHR172325mg/kg
Eppendorf tubeQuality Scientific Plastics509-GRD-Q
anticorps anti-5-HTAbcamab660471:800
GraphPad PrismGraphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Seringue MicroliterHamilton87943
KetoprofèneSigma-AldrichK1751-1G5mg/kg
Acide L-ascorbiqueBBI Life SciencesA610021-05000,10
pommade à la lidocaïneTsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. LtdH20063466
ofloxacine pommade oculaireShenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, ChineH10940177
pompe péristaltiqueHuxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, ChineHL-1D
appareil stéréotaxiqueRWD Life Science Co., Ltd68018
congélateur ultra-basse températureHaierDW-86L388
VortexKylin-bellVORTEX-5
R500 %

Références

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