In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Résumé

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

Résumé

Il est essentiel de comprendre quand et où se produisent les interactions protéines-protéines (IPP) pour comprendre la fonction protéique dans la cellule et comment des processus plus larges tels que le développement sont affectés. La germline d’elegans de Caenorhabditis est un excellent modèle pour étudier les IPP qui sont liées à la régulation des cellules souches, à la méiose et au développement. Il existe une variété de techniques bien développées qui permettent aux protéines d’intérêt d’être étiquetées pour la reconnaissance par des anticorps standard, ce qui rend ce système avantageux pour les réactions d’analyse de ligature de proximité (PLA). En conséquence, l’APL est capable de montrer où les IPP se produisent d’une manière spatiale et temporelle dans les lignées germinales plus efficacement que les approches alternatives. Décrit ici est un protocole pour l’application et la quantification de cette technologie pour sonder les IPP dans la lignée germinale C. elegans.

Introduction

On estime que plus de 80 % des protéines ont des interactions avec d’autres molécules¹, ce qui souligne l’importance des IPP pour l’exécution de fonctions biologiques spécifiques dans la cellule². Certaines protéines fonctionnent comme des plaques tournantes facilitant l’assemblage de plus grands complexes qui sont nécessaires pour la survie cellulaire¹. Ces moyeux médiateur plusieurs IPP et aider à organiser des protéines dans un réseau qui facilite des fonctions spécifiques dans une cellule³. La formation de complexes protéiques est également affectée par le contexte biologique, comme la présence ou l’absence de partenaires interagissant spécifiques^4,les événements de signalisation cellulaire et le stade de développement d’une cellule.

C. elegans est couramment utilisé comme organisme modèle pour une variété d’études, y compris le développement. La simple anatomie de cet animal est composée de plusieurs organes, dont le gonad, l’intestin et la cuticule transparente, ce qui facilite l’analyse du développement du ver. La lignée germinale résidant dans le gonad est un excellent outil pour étudier comment les cellules souches germinales mûrissent en^{gamètes 5} qui se développent en embryons et éventuellement la prochaine génération de progéniture. La région de pointe distale de la lignée germinale contient un bassin de cellules souches auto-renouvelées(figure 1). Au fur et à mesure que les cellules souches quittent la niche, elles se transforment en pachytène méiotique et finissent par se transformer en oocytes au stade des jeunes adultes(figure 1). Ce programme de développement dans la lignée germinale est étroitement réglementé par différents mécanismes, y compris un réseau de réglementation post-transcriptionnelle facilité par des protéines liant l’ARN (RBP)⁶. Les IPP sont importantes pour cette activité réglementaire, car les RBP s’associent à d’autres cofacteurs pour exercer leurs fonctions.

Il existe plusieurs approches qui peuvent être utilisées pour sonder les IPP dans le ver, mais chacune a des limites uniques. L’immunoprécipitation in vivo (IP) peut être utilisée pour isoler les complexes protéiques-protéines des extraits de vers entiers; cependant, cette approche n’indique pas où l’IPP se produit dans le ver. En outre, les complexes protéiques qui sont transitoires et ne se forment qu’à un stade spécifique de développement ou dans un nombre limité de cellules peuvent être difficiles à récupérer par co-immunoprécipitation. Enfin, les expériences de propriété intellectuelle doivent répondre aux préoccupations du réassorignement complexe en protéines après lyse et de la rétention non spécifique des protéines sur la matrice d’affinité.

Les approches alternatives pour la détection in situ des IPP sont la co-immunostaining, le transfert d’énergie de résonance de la résonance (FRET) et la compléments de fluorescence bimoléculaire (BiFC). La co-immunostaining repose sur la détection simultanée de deux protéines d’intérêt dans le tissu ver fixe et la mesure de l’étendue de la colocalisation du signal. L’utilisation de la microscopie super-résolution, qui offre plus de détails que la microscopie^{standard 7}, aide à tester plus rigoureusement la colocalisation des protéines au-delà de la barrière limitée à la diffraction de 200-300 nm⁸. Cependant, la co-immunostaining utilisant la microscopie conventionnelle et super-résolution fonctionne mieux pour des protéines avec des modèles bien définis de localisation. En revanche, il devient beaucoup moins instructif pour les partenaires en interaction distribués de façon diffuse. Mesurer la co-localisation des signaux en fonction du chevauchement ne fournit pas d’informations précises sur la question de savoir si les protéines sont en complexité^{les unes}avec les autres 9^,10.

En outre, la co-immunoprecipitation et la co-immunostaining des complexes protéines-protéines ne sont pas quantitatives, ce qui rend difficile de déterminer si de telles interactions sont significatives. FRET et BiFC sont deux techniques fluorescentes. FRET s’appuie sur le marquage des protéines d’intérêt avec des protéines fluorescentes (FP) qui ont chevauchement spectral à laquelle l’énergie d’un FP (donneur) est transférée à un autre FP (accepteur)¹¹. Ce transfert nonradiatif d’énergie entraîne la fluorescence de l’accepteur FP qui peut être détectée à sa longueur d’onde respective d’émission. BiFC est basé sur la reconstitution d’une protéine fluorescente in vivo. Il s’agit de diviser GFP en deux fragments complémentaires, tels que les hélies 1-10 et l’hélice 11¹², qui sont ensuite fusionnés à deux protéines d’intérêt. Si ces deux protéines interagissent, les fragments complémentaires de GFP deviennent assez proches à proximité pour se coucher et assembler, reconstituant le fluorophore GFP. Le GFP reconstitué est alors directement observé comme fluorescence et indique où un IPP s’est produit.

En tant que tel, FRET et BiFC dépendent de grandes étiquettes fluorescentes qui peuvent perturber la fonction de la protéine étiquetée. En outre, FRET et BiFC ont besoin d’une expression abondante et comparable des protéines étiquetées pour obtenir des données précises. FRET peut ne pas convenir à des expériences où l’un des partenaires est au-dessus de l’autre, ce qui peut conduire à un arrière-plan élevé¹³. La surexpression dans les expériences BiFC devrait également être évitée, car cela peut induire l’assemblage non spécifique¹⁴ qui a comme conséquence l’arrière-plan accru. Les deux techniques nécessitent l’optimisation des conditions d’expression et d’imagerie des protéines étiquetées, ce qui peut prolonger le temps nécessaire pour terminer les expériences.

L’essai de ligation de proximité (PLA) est une approche alternative qui peut répondre aux limites des techniques mentionnées ci-dessus. L’APL tire parti des anticorps primaires qui reconnaissent les protéines d’intérêt (ou leurs étiquettes). Ces anticorps primaires sont ensuite liés par des anticorps secondaires contenant des sondes d’oligoucléotide qui peuvent s’hybrider les uns avec les autres lorsqu’ils se trouvent à une distance de 40 nm (ou plus courte)¹⁵. L’ADN hybride qui en résulte est amplifié par une réaction de PCR, qui est détectée par des sondes qui complètent l’ADN. Il en résulte des foyers qui sont visualisés par un microscope. Cette technologie permet de détecter les IPP in situ dans les tissus complexes (c’est-à-dire le gonad ver), qui est organisé comme une chaîne d’assemblage contenant des cellules à divers stades de développement et de différenciation. Avec l’APL, les IPP peuvent être directement visualisées dans un gonad de ver fixe, ce qui est avantageux pour déterminer si les IPP se produisent à un stade spécifique de développement. L’APL offre une plus grande résolution des IPP par opposition aux essais basés sur la co-localisation, ce qui est idéal pour effectuer des mesures précises. Si elle est utilisée, la microscopie super-résolution a le potentiel de fournir des détails plus fins sur l’emplacement des foyers PLA dans une cellule. Un autre avantage est que les foyers résultant des réactions de l’APL peuvent être comptés par un flux de travail d’analyse basé sur ImageJ, ce qui rend cette technique quantitative.

La famille LC8 de chaînes lumineuses de dynein a d’abord été décrite comme un sous-unité du complexe moteur de dynein¹⁶ et a émis l’hypothèse de servir d’adaptateur de cargaison. Depuis sa découverte initiale, LC8 a été trouvé dans de multiples complexes protéiques en plus du complexe moteur de dynein^17,18,19,20. Balayage pour les séquences de protéines qui contiennent le motif d’interaction LC8¹⁹ suggère que LC8 peut avoir de nombreuses interactions avec un large éventail de protéines différentes^{17,18,19,20,21,22}. En conséquence, les protéines de la famille LC8 sont maintenant considérées comme des plaques tournantes qui aident à promouvoir l’assemblage de plus grands complexes protéiques^19,22, tels que des assemblages de protéines intrinsèquement désordonnées²¹.

Une protéine de la famille C. elegans LC8, la chaîne de lumière de la dynein-1 (DLC-1), est largement exprimée sur de nombreux tissus et non enrichie dans des structures souscellulaires spécifiques^23,24. Par conséquent, l’identification des partenaires in vivo biologiquement pertinents de DLC-1 dans C. elegans est difficile pour un certain nombre de raisons : 1) la co-immunoprécipitation n’indique pas la source tissulaire où l’interaction se produit; 2) l’expression limitée de partenaires particuliers ou d’interactions transitoires peut entraver la capacité de détecter une interaction par co-immunoprécipitation; et 3) la distribution diffuse du DLC-1 entraîne un chevauchement non spécifique avec les protéines partenaires potentielles par co-immunostaining. Sur la base de ces défis, PLA est une approche idéale pour tester les interactions in vivo avec DLC-1.

Il a été précédemment rapporté que DLC-1 interagit directement avec et sert de cofacteur pour les protéines de liaison ARN (RBPs) FBF-2²³ et GLD-1²⁵. Notre travail prend en charge le modèle de DLC-1 servant de protéine de plaque tournante et suggère que DLC-1 facilite un réseau d’interaction qui s’étend au-delà de la dynein^19,22. À l’aide d’un essai de retrait de la TPS, un nouveau RBP d’interaction DLC-1 nommé OMA-1 a été identifié²⁶. OMA-1 est important pour la croissance oocyte et la maturation méiotique²⁷ et fonctionne en conjonction avec un certain nombre de répresseurs translationnels et activateurs²⁸. Alors que FBF-2 et GLD-1 sont exprimés dans les cellules souches et les régions méiotiques pachytene, respectivement, OMA-1 est exprimée diffusement dans la lignée germinale du pachytene méiotique par les oocytes²⁷ (figure 1). Ceci suggère que DLC-1 forme des complexes avec des RBPs dans différentes régions du gonad. Il a également été constaté que l’interaction directe entre DLC-1 et OMA-1 observée in vitro n’est pas récupérée par une ADRESSE in vivo. L’APL a été utilisé avec succès comme une approche alternative pour étudier plus avant cette interaction dans la lignée germinale C. elegans, et les résultats suggèrent que l’APL peut être utilisé pour sonder de nombreux autres IPP dans le ver.

Protocole

REMARQUE : Ce protocole utilise des souches C. elegans dans lesquelles les partenaires potentiels d’interaction sont tous deux étiquetés. Il est fortement recommandé d’utiliser une souche de contrôle négatif, dans laquelle on ne s’attend pas à ce qu’une protéine étiquetée interagit avec un autre partenaire d’interaction candidat marqué. Ici, GFP seul a été utilisé comme un contrôle négatif pour évaluer le fond, comme DLC-1 ne devrait pas interagir avec GFP dans le ver. L’OMA-1 étiqueté GFP a été utilisé comme souche expérimentale, car les données préliminaires suggèrent une interaction avec DLC-1. Les souches de nématode co-exprimant des protéines de contrôle et de test avec DLC-1 3xFLAG-étiquetées sont mentionnées dans ce texte sous le nom de 3xFLAG::DLC-1 ; GFP et 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (souches disponibles sur demande; plus d’informationsdans la Table des Matériaux ), respectivement. Ici, les balises 3xFLAG et GFP sont utilisées; cependant, d’autres étiquettes peuvent être remplacées tant que leurs anticorps sont compatibles avec les réactifs du kit PLA.

1. Soins aux animaux

1. Conserver les vers sur les plaques moyennes de croissance des nématodes (NGM) qui sont ensemencées avec la souche OP50 d’E. coli et maintenir à 24 oC pour une expression optimale du GFP.
2. Passer les vers adultes tous les 2-3 jours pour propager les vers et les garder bien nourris.

2. Préparation de la culture synchrone

1. Synchroniser les vers en blanchissant une assiette d’hermaphrodites bien nourris et gravidés. Un protocole de blanchiment est décrit dans Porta-de-la-Riva et al.²⁹. Laissez les embryons éclore toute la nuit dans un tube de centrifugeuse à 24 oC tout en tournant sur l’extrémité dans 10 ml de M9 minimum média (M9) tampon. Cela produira une culture de larves de L1 arrêtées.
2. Incuber le tube des larves de stade L1 arrêtés sur la glace pendant 10 min, puis couronner le tube avec de la glace froide 1x M9.
3. Utilisez une centrifugeuse pour pelleter les larves à 600 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez soigneusement le supernatant de sorte que seulement 1-2 ml de restes supernatants.
4. Suspendre à nouveau le granulé de larves et utiliser une micropipette pour transférer 2 L de la culture des larves suspendues à une glissière en verre. Comptez le nombre de larves présentes pour déterminer la densité de la culture des larves, ce qui aidera à orienter l’ensemencement des vers à l’étape 2.5.
   REMARQUE : Une densité de 10-15 larves de L1/1 lil fonctionne bien pour l’ensemencement.
5. Utilisez une micropipette pour transférer le volume de culture des larves nécessaire pour semer environ 100-120 larves de L1 sur une plaque op50 de 60 mm. Par exemple, graine 10 l d’une culture de larves qui a une densité de 10 larves de L1/1 'L de culture.
   REMARQUE : Ne dépassez pas un volume de 40 l pour ensemencer les larves, ou l’excès de liquide perturbera la pelouse de l’OP50. Si le volume de la culture dépasse 40 ll, répétez les étapes 2.3-2.4 pour réduire davantage le volume et augmenter la densité de la culture des larves.
6. Cultivez les vers à 24 oC. Enregistrez le moment où les L1 sont ensemencés sur la plaque et vérifiez périodiquement le stade de développement pour identifier le moment idéal pour la dissection.
   REMARQUE : À 52 h après l’ensemencement des L1, les vers cultivés à 24 oC sont généralement au stade des jeunes adultes, ce qui est l’étape idéale pour la dissection de l’APL ciblé par les gonades. Cependant, le moment réel auquel les vers synchronisés atteignent le stade des jeunes adultes peut varier d’une souche à l’autre et d’une température d’incubation.

3. Dissection/extrusion gonad

REMARQUE : La dissection pour extruder le gonad est nécessaire pour que l’APL viscède fonctionne avec succès. Cette approche peut également libérer des embryons, qui fonctionnent également en utilisant ce protocole pour PLA (voir Discussion pour plus d’informations). Après dissection, le contrôle négatif et les échantillons expérimentaux sont fixés et traités pour pla en parallèle. Il est également suggéré qu’un ensemble supplémentaire d’échantillons soient préparés aux fins de la co-immunostaining fluorescent²³ pour démontrer les modèles d’expression des partenaires protéiques d’intérêt.

1. Choisissez 30-40 jeunes vers adultes dans un plat en verre de montre contenant 500 L de 1x M9 ' levamisole (concentration finale de 2,5 mM). Après avoir recueilli les vers, enlever soigneusement et jeter la plupart des médias pour enlever les bactéries qui sont transférées avec les vers.
2. Ajoutez 500 L frais de 1x M9 et utilisez la pipette pour dessiner et distribuer doucement les médias pour rincer les vers. Enlever et jeter soigneusement la plupart des médias pour effacer les bactéries qui sont transférées avec les vers.
   1. Répétez cette étape 2x-3x jusqu’à ce que toutes les bactéries soient éliminées. Une fois les lavages terminés, laissez les vers dans environ 100 l de médias pour rester hydratés.
      REMARQUE: Ne laissez pas les vers s’asseoir dans les médias pendant plus de 7 min, car cela altérera l’extrusion des gonades pendant la dissection. Effectuez des lavages à l’aide de la dissection du microscope pour surveiller l’enlèvement des supports afin que les vers ne soient pas perdus.
3. À l’aide d’une pipette en verre ou en polyéthylène, transférer les vers dans une lame de microscope de 25 mm x 75 mm recouverte de 0,001 % de poly-L-lysine (les diapositives utilisées dans cette procédure ont un périmètre enrobé époxy, laissant trois espaces de travail, 14 mm x 14 mm chacun). Retirez l’excès de supports de sorte qu’il reste environ 10 à 15 lil de médias.
4. À l’aide d’un microscope disséquant et à l’aide de deux aiguilles de jauge 261/2, placez une aiguille sur l’autre de sorte que les extrémités forment une paire de ciseaux. En utilisant des aiguilles orientées de cette façon, les vers coupés derrière le pharynx pour libérer les lignées germinales. Disséquer tous les vers en 5 minutes.
   REMARQUE: Plus de détails sur la façon d’effectuer des dissections peuvent être trouvés dans une publication précédente par Gervaise et Arur³⁰.
5. Après que tous les vers soient disséqués, placez doucement un housse de 22 mm x 40 mm sur la glissière de sorte qu’il soit perpendiculaire à la glissière. Les extrémités du coverlip doivent accrocher la glissière.
6. Congeler les lames sur un bloc d’aluminium pré-réfrigéré maintenu sur de la glace sèche pendant au moins 20 min. Déposer délicatement un crayon réfrigéré sur le dessus du coverlip pour éviter que le coverlip ne se détache en raison de l’expansion de la glace.

4. Fixation/blocage

1. Une fois prêt à la fixation, feuilletez les couvertures avec un crayon ou tout autre outil émoussé et trempez immédiatement la glissière dans un bocal contenant du méthanol frais et glacé (réfrigéré à -20 oC) pendant 1 min.
2. Essuyez doucement les bords de la glissière qui entourent l’échantillon de sorte que le réactif suivant soit maintenu par la tension de surface autour de l’échantillon. Appliquer 150 L de fixatif (2% de formaldéhyde dans 100 mM KH₂PO_4, pH à 7,2) pour 5 min à RT.
   REMARQUE : Nous avons également testé une procédure de fixation du méthanol/acétone^31,32 et nous avons constaté qu’elle est compatible avec la réaction de l’APL.
3. Touchez la glissière à un essuie-tout à un angle perpendiculaire de 90 degrés pour laisser le fixateur s’écouler de la glissière et absorber dans le papier absorbant. Bloc glisse 2x pendant 15 min à RT dans un bocal Coplin avec 50 ml de 1x PBS/1% Triton X-100/1% albumin de sérum bovin (PBT/BSA).
   REMARQUE : Des pots coplin ou d’autres types de pots de coloration sont recommandés pour cette étape de blocage et les étapes de lavage ci-dessous dans les sections 6-9. Ceux-ci fournissent des volumes suffisants pour l’échange efficace de tampon de blocage ou de lavage avec l’échantillon.
4. Bloquer les diapositives avec une solution PBT/BSA contenant 10% de sérum de chèvre normal. Essuyez délicatement les bords qui entourent la glissière et appliquez 100 L de la solution à la glissière. Incuber pendant 1 h à RT dans une chambre humide.
   REMARQUE : Cette étape est fortement recommandée pour la coloration avec l’anticorps primaire de l’AFLAG. La chambre humide est construite en fixant des pipettes en verre avec du ruban adhésif dans le plateau pour que les toboggans s’y mentent pendant qu’ils couvent. Des lingettes de tâche amorties(tableau des matériaux) sont placées dans le plateau pour augmenter l’humidité interne du plateau pour prévenir l’évaporation. Le couvercle et le plateau sont recouverts de papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière pendant les étapes sensibles à la lumière.
5. Déposer la glissière sur un essuie-tout pour laisser la solution PBT/BSA/10%NGS s’écouler de la glissière et essuyer doucement les bords de la glissière. Utilisez le réactif de blocage(tableau des matériaux)pour bloquer les diapositives. Appliquer une goutte sur l’espace de 14 mm x 14 mm. Glisse incubation pendant 1 h à 37 oC dans une chambre humide.

5. Incubation primaire d’anticorps

REMARQUE : Pour obtenir les meilleurs résultats de l’APL et un contexte minimal, le facteur de dilution des anticorps primaires peut nécessiter une optimisation (voir Discussion pour plus de détails). En outre, les anticorps primaires doivent être élevés chez différents hôtes qui correspondent à la spécificité des anticorps secondaires utilisés pour l’APL.

1. Déposer la glissière sur un essuie-tout pour laisser le réactif de blocage s’écouler de la glissière et essuyer doucement les bords. Utilisez le diluant anticorps(tableau des matériaux)pour diluer les anticorps primaires. Appliquer 40 L de solution d’anticorps primaires par espace de 14 mm x 14 mm.
2. Glisse incubate dans une chambre humide pendant la nuit à 4 oC.

6. Incubation de sonde de l’APL (anticorps secondaires)

REMARQUE : Pour les étapes 6-9, utilisez les tampons de lavage A et B à RT. Si les tampons sont stockés à 4 oC, laissez-les réchauffer à RT avant de l’utiliser.

1. Laver les toboggans 2x pendant 5 min avec 50 ml de tampon de lavage 1x A(tableau des matériaux) à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 tr/min.
2. Déposer la glissière sur un essuie-tout pour laisser couler la mémoire tampon de la glissière et essuyer délicatement les bords. Préparer une solution de 40 L contenant des sondes PLUS et MINUS (diluée 1:5 avec diluant d’anticorps). Appliquer la solution sur chaque espace de 14 mm x 14 mm.
3. Glisse incubation dans une chambre humide pendant 1 h à 37 oC.

7. Ligation

1. Laver les toboggans 2x pendant 5 min avec 50 ml de tampon de lavage de 1x A à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 tr/min.
2. Diluer le tampon de ligature (Tableau des matériaux) 1:5 avec de l’eau ultrapure. Utilisez ce tampon pour diluer la ligase (Tableau des matériaux) 1:40 pour préparer un stock de travail de solution de ligation.
   1. Placez la lame sur un essuie-tout pour laisser le tampon de lavage s’écouler de la glissière et essuyer doucement les bords. Appliquer 40 L de la solution de ligature à chaque espace de 14 mm x 14 mm.
3. Glisse incubation dans une chambre humide pendant 30 min à 37 oC.

8. Amplification

REMARQUE : L’utilisation de réactifs de détection avec des fluorophores rouges(tableau des matériaux) entraîne le moins d’arrière-plan dans le tissu de C. elegans.

1. Laver les toboggans 2x pendant 5 min avec 50 ml de tampon de lavage de 1x A à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 tr/min.
2. Diluer le tampon rouge d’amplification(Tableau des matériaux) 1:5 avec de l’eau ultrapure. Utilisez ce tampon pour diluer la polymérase(Tableau des matériaux) 1:80 pour préparer un stock de travail de solution d’amplification et protéger de la lumière.
   1. Placez la lame sur un essuie-tout pour laisser le tampon de lavage s’écouler de la glissière et essuyer doucement les bords. Appliquer 40 L de la solution d’amplification à chaque espace de 14 mm x 14 mm.
3. Glisse incubation dans une chambre humide pendant 1 h et 40 min à 37 oC. Assurez-vous que la chambre humide est recouverte de papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière.

9. Lavages finaux

1. Laver les toboggans 2x pendant 10 min avec 50 ml de tampon de lavage B(tableau des matériaux)à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 tr/min.
2. Laver les toboggans 1x pendant 1 min avec 50 ml de tampon de lavage B de 0,01x à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 tr/min. Ce tampon est préparé en dilant le tampon B avec de l’eau ultrapure.

10. Coverslip montage

1. Laissez l’excédent de tampon de lavage s’écouler de la glissière sur un essuie-tout et essuyer tout tampon résiduel restant sur le périmètre époxy de la glissière.
2. Ajouter 10 L de support de montage(tableau des matériaux) pour échantillonner et poser délicatement un coverlip sur le dessus, permettant au milieu de montage de s’étaler.
3. Peignez autour du bord du coverlip avec du vernis à ongles pour sceller le coverlip et la diapositive. Soyez doux avec l’application de vernis à ongles pour éviter de déplacer le coverlip, qui endommagera les lignées germinales. Laisser durcir le vernis à ongles pendant au moins 20 minutes à RT, tandis que les diapositives sont protégées de la lumière, avant de la visualiser au microscope.
4. Conservez les diapositives dans un contenant sombre ou un porte-toboggan, car les échantillons étiquetés PLA sont sensibles à la lumière. Le fabricant suggère que les diapositives peuvent être stockées à -20 oC pour le stockage à long terme ou à 4 oC pour le stockage à court terme. Les diapositives préparées à l’aide de ce protocole dureront au moins 2 mois lorsqu’elles seront stockées à 20 oC.

11. Acquisition d’images

1. Aux fins de la quantification, utilisez un microscope confocal pour capturer des images de lignées germinales extrudées qui sont en vue claire, intactes et non obstruées. Capturez une pile z de la lignée germinale qui s’étend sur toute la lignée germinale du z-plane et génèrez une image de projection maximale à utiliser pour la quantitation.
   REMARQUE : La microscopie confocale est idéale pour obtenir et quantifier les images de PLA avec moins d’arrière-plan comparée à celles obtenues à l’aide d’un microscope épifluorescent.
   1. Si la lignée germinale ne s’inscrit pas dans un champ de vision, capturez les champs de vision qui se chevauchent au besoin pour l’image de l’ensemble de la lignée germinale. Les projections maximales de ces images peuvent être cousues ensemble dans FIJI.
2. Assurez-vous de maintenir les conditions d’imagerie les mêmes entre les échantillons de contrôle et les échantillons expérimentaux afin de fixer un seuil juste et approprié pour l’identification des foyers lors de l’analyse de l’image.
   REMARQUE : Enregistrez au moins 8 à 10 lignées germinales de chaque échantillon par réplique pour faciliter l’analyse statistique de la quantification de l’APL. Au moins trois répliques biologiques sont recommandées pour l’APL afin d’obtenir des résultats quantitatifs fiables et cohérents.

12. Analyse et quantification d’images à l’aide de FIJI/ImageJ

REMARQUE : Le flux de travail suivant est basé sur des images acquises à l’aide de l’objectif 40x sur un microscope confocal, dans lequel les images sont enregistrées dans le format .czi. Ces images .czi et leurs métadonnées qui l’accompagnent, y compris les dimensions, peuvent être consultées et ouvertes en FIJI/ImageJ pour une analyse plus approfondie. Il convient de vérifier si FIJI accepte le format des fichiers confocals du confocal disponible pour l’utilisateur spécifique. Si ce n’est pas le cas, les images du format .tiff peuvent être utilisées alternativement pour l’analyse, mais l’utilisateur devra définir manuellement l’échelle de l’image dans FIJI/ImageJ (Analyse Échelle définie). Il est recommandé d’analyser toutes les images de contrôle négatifs ensemble en premier pour établir le niveau de fond.

1. Commencez le flux de travail d’analyse en analysant d’abord toutes les images de contrôle négatif, puis passez aux échantillons expérimentaux. Ouvrez une image de projection maximale dans FIJI/ImageJ à analyser (figure 2A). Si vous utilisez un fichier .czi, une boîte d’options d’importation Bio-Formats sera invitée.
   1. Inclure les options suivantes pour ouvrir votre image : voir la pile avec le navigateur de données; mode couleur - Colorized. Une fenêtre avec l’image doit maintenant s’ouvrir avec une barre de diapositives à basculer entre les différents canaux capturés par confocal (par exemple, DAPI ou PLA).
   2. Si les images doivent être cousues, créez des doublons de chaque canal à partir de chaque image en sélectionnant correctement l’image avec la souris et en sélectionnant du dupliqué pour ouvrir la fenêtre Duplicate. Spécifier uniquement le numéro de canal (c) qui correspond au canal PLA ou DAPI (par exemple, 2) et décocher la boîte pour Duplicate Hyperstack.
   3. Avec les deux images à coudre ouvert, sélectionnez Plugins Stitching - France Déprécié Couture 2D. Une fenêtre de couture de 2D Images s’ouvrira. Sélectionnez quelles images seront utilisées pour la couture et utilisez les paramètres par défaut qui sont prédéfinis dans la fenêtre, puis sélectionnez Ok. L’image résultante sera une image assemblée à l’échelle grise.
      REMARQUE : Si les sous-images ne s’alignent pas parfaitement, l’ajustement des paramètres (c.-à-d. augmenter le nombre de pics à vérifier de 5 à 500 ou changer la méthode de fusion du mélange linéaire à Max. Intensité) peut aider à obtenir l’image désirée. Bien que d’autres outils de couture soient disponibles, cette approche conserve la dimensionnalité de l’image, ce qui est important pour la quantification.
2. Ouvrez le gestionnaire du ROI (Région d’intérêt) en appuyant sur T sur le clavier. Une nouvelle fenêtre nommée ROI Manager s’ouvrira.
3. Sélectionnez l’outil polygon dans la boîte à outils FIJI. Points de chute autour de la lignée germinale pour l’esquisser et générer un retour sur investissement(figure 2B). Connectez le dernier point au premier pour générer un retour sur investissement complet.
   REMARQUE : Pour les images plus foncées, il est utile d’ajuster le contraste pour améliorer la visibilité de la lignée germinale (qui est réversible) afin qu’elle puisse être décrite avec plus de précision.
   1. Immédiatement après avoir terminé le retour sur investissement, rendez-vous chez le gestionnaire du roi et sélectionnez Ajouter [t] pour stocker le retour sur investissement. Il est impératif que toute modification du retour sur investissement, y compris l’ajout/suppression de points ou le mouvement du retour sur investissement et les points, soit mise à jour (sélectionner la mise à jour du gestionnaire du retour sur investissement) avant de passer à l’étape suivante, ou qu’elles soient perdues. D’autres détails sur la manipulation des IPP et de leurs points peuvent être trouvés dans le guide d’utilisateurs FIJI/ImageJ.
4. Une fois que l’orientation du retour sur investissement est définie, elle peut être enregistrée pour une référence ultérieure en sélectionnant le nom de retour sur investissement dans le gestionnaire du roi d’australie, suivi de More Enregistrer (nom du fichier et spécifier la destination pour savoir où enregistrer). Les ROIs enregistrés peuvent être ouverts dans le gestionnaire du retour sur investissement en sélectionnant plus de Ouvert (sélectionnez le fichier).
5. Mesurez la zone à l’intérieur du retour sur investissement en sélectionnant le nom de retour sur investissement du gestionnaire du roi d’investissement, puis en sélectionnant le bouton Mesure sur le gestionnaire du retour sur investissement. Une fenêtre de résultats s’ouvrira avec des informations sur le retour sur investissement, y compris la zone qu’il couvre dans l’image (M²) (encart de la figure 2B). Enregistrez ces informations dans une feuille de calcul pour les calculs ultérieurs.
   REMARQUE : Assurez-vous que l’échelle de l’image a été correctement définie afin que les dimensions correctes du retour sur investissement soient collectées. Les types de mesures indiquées dans la boîte de résultats peuvent être modifiés en allant à l’analyse . Définir les mesures....
6. Ouvrez une image en double du seul canal PLA en sélectionnant à droite l’image plaaisons et en sélectionnant duplicate (figure 2C). Une fenêtre en double s’ouvrira. Spécifier uniquement le numéro de canal (c) qui correspond au canal PLA (par exemple, 2) et décocher la boîte pour Duplicate Hyperstack. La duplication de cette image est recommandée afin que l’image originale ne soit pas modifiée.
   REMARQUE : Ces options n’apparaîtront que lorsque vous visionnerez les images contenant plusieurs canaux sur FIJI/ImageJ. Une autre approche consiste à diviser les canaux Image ' Couleur Chaînes fractionnées, mais cela modifiera votre fichier d’image d’origine.
7. Avec seulement l’image de la chaîne PLA sélectionnée, rendez-vous sur Image ( Ajuster Seuil. Une fenêtre Seuil pour l’image s’ouvrira. Sélectionnez Par défaut comme méthode de seuil, rouge comme la couleur, et vérifiez la boîte de fond sombre. En utilisant la voie supérieure sur la fenêtre, faites glisser la barre vers la droite jusqu’à ce que tous les foyers PLA sont nettement mis en évidence dans l’image.
   1. Enregistrez la valeur de la boîte à droite de la voie supérieure et prenez note de la valeur utilisée pour fixer le seuil. Sélectionnez Appliquer dans la fenêtre Seuil pour finaliser le seuil, et l’image se convertira en fond blanc avec seulement le seuil foci visible sous point noir (figure 2D). Testez le seuil sur plusieurs images de contrôle négatif pour s’assurer qu’il est approprié pour capturer tous les foyers pla plaais d’image en image avant la quantitation.
      REMARQUE : Pour voir les foyers de seuil comme des points noirs sur le fond blanc, allez au processus . Binaire Options... et décocher la boîte de fond noir. Une valeur seuil comprise entre 30 et 40 est un bon point de départ pour identifier l’APL dans la lignée germinale; cependant, la valeur idéale peut varier selon les antécédents.
8. Pour quantifier les foyers pla aPL, appliquez le retour sur investissement généré des étapes 12.3-12.3.1 à l’image seuil en sélectionnant le nom de retour sur investissement de la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement. Le contour du retour sur investissement doit apparaître sur l’image au même endroit qu’à partir de l’image source(figure 2E).
   1. Aller à l’analyse (fr) Analyser les particules. La fenêtre Analyze Particles s’ouvrira et sélectionnera les paramètres suivants : taille (micron-2) ' 0-Infinity,circularité ' 0.00-1.00, montrent rien. Cochez la case Résumé.
   2. Sélectionnez Ok, et un tableau sommaire apparaîtra avec des informations sur le retour sur investissement (c.-à-d., le nombre total de foyers aPL, la superficie totale occupée par les foyers pla plaais à l’intérieur du retour sur investissement, la taille moyenne des foyers pla, et le pourcentage de la zone occupée par pla foci par rapport à la taille du retour sur investissement) (encart de la figure 2E). Enregistrez ces mesures dans une feuille de calcul.
9. Répétez les étapes 12.1-12.8 pour plusieurs images de contrôle négatif utilisant le même seuil.
   1. Une fois que toutes les images de contrôle négatif ont été analysées, répétez les étapes 12.1-12.8 pour tous les échantillons expérimentaux utilisant le même seuil qui a été déterminé par le contrôle négatif pour identifier et quantifier les foyers de PLA.

Résultats

Co-immunostaining des deux 3xFLAG::DLC-1; GFP et 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlines avec DES anticorps FLAG et GFP a révélé leurs modèles d’expression dans la lignée germinale (Figure 3Aii-iii,3Bii-iii). Alors que GFP a été exprimée tout au long de la germline (figure 3Aiii), OMA-1::GFP expression a été limitée à la pachytene tardive et les oocytes (figure 3...

Discussion

Lors de l’étude des IPP dans la lignée germinale C. elegans, la résolution plus élevée offerte par l’APL par rapport à la co-immunostaining permet la visualisation et la quantification des endroits où les interactions se produisent dans la lignée germinale. Il a déjà été signalé que DLC-1 interagit directement avec OMA-1 à l’aide d’un essai in vitro de retrait de la TPS^26; cependant, cette interaction n’a pas été récupérée par un retrait in vivo. La co-immunostaining fluorescente...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de paraformaldéhyde à 16 %	Services de microscopie électronique	15710	utilisés pour fabriquer une solution de travail à 4 %
1M KH2PO4	Sigma	P0662	Préparer une pellicule de 1 M
1 x M9	divers		préparé comme 10 fois la matière utilisée à 1x ; voir wormbook.org pour
le protocole 1x PBS	divers	voir	wormbook.org pour protocole
Aiguille de calibre 26,5 Aiguille	Exel International	26402	Aiguilles utilisées pour la dissection
BSA	Lampire	7500802
Tubes à centrifuger	Thermo Scientific	05-529C	50ml Tube à centrifuger Oak ridge utilisé pour la synchronisation
Microscope confocal	Zeiss	880
Coplin Jar	PolyLab	62101
Couverture pour congélation	Globe d’échantillon Scientific	1411-10	22x40mm, n° 1
Couverture pour sceller Globe	de lame Scientific	1404-15	22x22mm, n° 1,5
Support de montage DAPI pour vecteur d’immunofluorescence		H-1200
Ligase	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x Ligase, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Rouge DUO92008
Tampon rouge d’amplification	Sigma-Aldrich	DUO82011	Tampon rouge d’amplification Duolink 5x, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Red DUO92008
Tampon de ligature	Sigma-Aldrich	DUO82009	Tampon de ligature Duolink 5x, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Red DUO92008
Diluant	d’anticorps Sigma-Aldrich	DUO82008	Diluant d’anticorps Duolink, livré avec DUO92004 et DUO92002, Remarque : Une solution 1x PBS / 1 % BSA peut également être utilisée comme substitut pour diluer l’anticorps.
Solution de blocage	Sigma-Aldrich	DUO82007	Solution de blocage Duolink, livrée avec DUO92004 et DUO92002
Support de montage pour PLA	Sigma-Aldrich	DUO82040	Milieu de montage in situ Duolink avec
sonde DAPI MINUS	Sonde Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink Sonde In Situ Anti-Mouse
MINUS PLUS Sonde	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In Situ Tampon de lavage Anti-Rabbit PLUS
A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Tampon de lavage in situ A
Tampon de lavage B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Tampon de lavage in situ Duolink B
Polymérase	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polymérase, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Red DUO92008
microscope épifluorescent	Leica		DFC300G caméra, DM5500B microscope
Chèvre anti-souris Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Utilisation à 1:500
Chèvre anti-lapin Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Utilisation à 1:200
Logiciel de traitement d’image	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Pipette en verre	Corning	7095B-5X
Lévamisole	ACROS Organiques	187870100	Préparez un stock de travail de 250 mM
Méthanol	Fisher Scientific	A454
Anti-FLAG	Sigma	F1804	Utilisation à 1:1000 pour l’immunofluorescence et le PLA, pré-blocage avec sérum de chèvre normal recommandé
Vernis à ongles	L.A. Couleurs	CNP195
Milieu de croissance des nématodes (NGM)	divers		Voir wormbook.org pour protocole
Sérum de chèvre normal	JacksonImmuno	005-000-121
Pipette Pasteur en polyéthylène	Globe Scientific	135030
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P1524	Préparée sous forme de solution mère à 0,1 % dans l’eau, stockée à -20 °C et diluée 1:100 dans l’eau pour enrober les lames Boîtes
Pétri	Tritech	PD7060	60 mm de diamètre
Lapin anti-GFP	Thermo Fisher	G10362	utiliser au 1:200 pour l’immunofluorescence, 1:4000 pour
les lames	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	Les lames autoclavables à trois carrés 14x14 mm avec barres sont commandées sur mesure par Fisher Scientific. Poly-L-Lysine ajouté aux lames en laboratoire
Solution d’hypochlorite de sodium	Fisher Scientific	SS290-1
Lingettes de travail	Kimtech	34120	4,4 x 8,4 pouces
Plateaux (242 x 241 x 20 mm)	Thermo Fisher	240845	Utilisé pour fabriquer une chambre humide
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Eau ultrapure	Milli-Q		Eau ultrapure obtenue à partir du système de purification d’eau intégral Milli-Q
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
° ; C congélateur-80
° ; C congélateur
Feuille d’aluminium
souche OP50 E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode souches utilisées dans cette étude (toutes deux disponibles sur demande)
mntSi13[pME4.1] II ; UNC-119(ED3) III ; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom ::3xFLAG ::d lc-1 ::d lc-1 3'UTR ; oma-1 prom ::oma-1 ::GFP ; Référence 24
mntSi13[pME4.1] II ; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 prom ::3xFLAG ::d lc-1 ::d lc-1 3'UTR ; gld-1 prom ::ceGFP ::fbf-1 3'UTR + unc-119(+) ; Référence : cette étude