Nous présentons un flux de travail librement disponible construit pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans des compartiments cellulaires spécifiques dans des images de microscopie de fluorescence. Ce flux de travail convivial est conçu sur le logiciel open-source Icy et utilise également les fonctionnalités ImageJ. Le pipeline est abordable sans connaissance dans l’analyse d’image.
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Article de méthode
Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dernière décennie a été caractérisée par des percées dans les techniques de microscopie de fluorescence illustrées par l’amélioration de la résolution spatiale, mais aussi dans l’imagerie à cellules vivantes et les techniques de microscopie à haut débit. Cela a conduit à une augmentation constante de la quantité et de la complexité des données de microscopie pour une seule expérience. Étant donné que l’analyse manuelle des données de microscopie prend beaucoup de temps, qu’elle est subjective et qu’elle interdit les analyses quantitatives, l’automatisation de l’analyse de la bioimage devient presque inévitable. Nous avons construit un flux de travail informatique appelé Substructure Analyzer pour automatiser entièrement l’analyse du signal dans les bioimages à partir de la microscopie fluorescente. Ce flux de travail est développé sur la plate-forme open-source iux conviviale et est complété par des fonctionnalités d’ImageJ. Il comprend le pré-traitement des images pour améliorer le rapport signal/bruit, la segmentation individuelle des cellules (détection des limites cellulaires) et la détection/quantification des corps cellulaires enrichis dans des compartiments cellulaires spécifiques. Le principal avantage de ce flux de travail est de proposer des fonctionnalités complexes de bio-imagerie aux utilisateurs sans expertise en analyse d’image via une interface conviviale. En outre, il est très modulaire et adapté à plusieurs questions allant de la caractérisation de la translocation nucléaire/cytoplasmique à l’analyse comparative de différents corps cellulaires dans différentes sous-structures cellulaires. La fonctionnalité de ce flux de travail est illustrée par l’étude des corps Cajal (enroulés) dans des conditions de stress oxydatif (OS). Les données de la microscopie de fluorescence montrent que leur intégrité dans les cellules humaines est affectée quelques heures après l’induction de l’OS. Cet effet est caractérisé par une diminution de la nucléation de la coiline dans les corps cajal caractéristiques, associée à une redistribution nucléoplasmique de la coiline dans un nombre accru de foyers plus petits. Le rôle central de la coiline dans l’échange entre les composants CB et le nucléoplasme environnant suggère que la redistribution induite par l’OS de la coiline pourrait affecter la composition et la fonctionnalité des corps de Cajal.
Introduction
La microscopie légère et, plus particulièrement, la microscopie de fluorescence sont des techniques robustes et polyvalentes couramment utilisées en sciences biologiques. Ils donnent accès à la localisation précise de diverses biomolécules comme les protéines ou l’ARN par leur étiquetage fluorescent spécifique. La dernière décennie a été caractérisée par des progrès rapides dans les technologies de microscopie et d’imagerie comme en témoigne le prix Nobel de chimie 2014 qui récompense Eric Betzig, Stefan W. Hell et William E. Moerner pour le développement de la microscopie de fluorescence super-résolue (SRFM)1. SFRM contourne la limite de diffr....
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Protocole
REMARQUE : Des didacticiels convivial sont disponibles sur le site web de Icy http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Télécharger icy et le protocole d’analyseur de sous-structure
- Téléchargez Icy à partir du site Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/download) et téléchargez le protocole Substructure Analyzer : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
REMARQUE : Si vous utilisez un système d’exploitation 64 bits, assurez-vous d’utiliser la version 64 bits de Java. Cette version permet d’au....
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Résultats
Toutes les analyses décrites ont été effectuées sur un ordinateur portable standard (processeur quad-core 64 bits à 2,80 GHz avec mémoire d’accès aléatoire (RAM) de 16 Go fonctionnant avec la version 64 bits de Java. La mémoire à accès aléatoire est un paramètre important à considérer, en fonction de la quantité et de la résolution des images à analyser. L’utilisation de la version 32 bits de Java limite la mémoire à environ 1300 Mo, ce qui pourrait être inapproprié pour l’analyse big data, tandis que la version 64 bits .......
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Discussion
Un nombre croissant d’outils logiciels libres sont disponibles pour l’analyse des images des cellules de fluorescence. Les utilisateurs doivent choisir correctement le logiciel adéquat en fonction de la complexité de leur problématique, de leurs connaissances dans le traitement d’image, et au temps qu’ils veulent passer dans leur analyse. Icy, CellProfiler, ou ImageJ / Fidji sont des outils puissants combinant à la fois la facilité d’utilisation et la fonctionnalité3. Icy est un outil autonome qui.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
G.H. a reçu une bourse d’études supérieures du Ministère délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. a reçu une bourse d’études supérieures de l’Institut de Cédrologie de Lorraine (ICL), tandis que Q.T. a bénéficié d’une subvention publique supervisée par l’Agence nationale de la recherche Français (ANR) dans le cadre du deuxième programme « Investissements d’Avenir » FIGHT-HF (référence : ANR-15-RHU4570004). Ces travaux ont été financés par le CNRS et l’Université de Lorraine (UMR 7365).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution de formaldéhyde à 16 % (p/v) sans méthanol | Thermo Fisher Scientific | 28908 | pour fixer les cellules |
| Alexa Fluor 488 de chèvre anti-lapin | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | anticorps secondaire fluorescent |
| Alexa Fluor 555 de chèvre anti-souris | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | anticorps secondaire fluorescent |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | anticorps secondaire fluorescent |
| Étalon d’albumine sérique bovine (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | Milieu de culture cellulaire |
| Duolink In Situ Milieu de montage avec DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | |
| Homme : cellules HeLa S3 | IGBMC, Strasbourg, France | lignée cellulaire utilisée pour réaliser les expériences | |
| Solution de peroxyde d’hydrogène 30 % (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | utilisé comme agent stressant |
| Lipofectamine 2000 Réactif | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | Réactif de transfection |
| Anti-spirale monoclonal de souris | abcam | ab11822 | Anticorps spécifique de la bobine |
| Microscope à fluorescence Nikon Optiphot-2 | Microscope à épifluorescence | ||
| Opti-MEM I Sérum réduit Thermo | Fisher Scientific | 31985062 | milieu de transfection |
| PBS pH 7,4 (10x) | gibco | 70011-036 | pour laver les cellules |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | Anticorps |
| Anticorps polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | l’EDC4 |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | pour perméabiliser les cellules |
Références
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C.
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Réimpressions et autorisations
