Caractérisation des structures amyloïdes dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de l’imagerie à vie de fluorescence

Summary

L’imagerie à vie de fluorescence surveille, quantifie et distingue les tendances d’agrégation des protéines dans les modèles vivants, vieillissants et stressés de la maladie de C. elegans.

Abstract

Les fibrilles amyloïdes sont associées à un certain nombre de maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson ou la maladie d’Alzheimer. Ces fibrilles amyloïdes peuvent séquestrer des protéines métastables endogènes ainsi que des composants du réseau de protéostasie (PN) et exacerber ainsi les mauvais pliages de protéine dans la cellule. Il existe un nombre limité d’outils disponibles pour évaluer le processus d’agrégation des protéines amyloïdes chez un animal. Nous présentons un protocole pour la microscopie à vie de fluorescence (FLIM) qui permet la surveillance ainsi que la quantification de la fibrilisation amyloïde dans des cellules spécifiques, telles que les neurones, d’une manière non invasive et avec la progression du vieillissement et sur la perturbation de le PN. La FLIM est indépendante des niveaux d’expression du fluorophore et permet une analyse du processus d’agrégation sans autre coloration ni blanchiment. Les fluorophores sont étanchéités lorsqu’elles sont à proximité des structures amyloïdes, ce qui entraîne une diminution de la durée de vie de la fluorescence. L’étanchéité est directement corrélée avec l’agrégation de la protéine amyloïde. FLIM est une technique polyvalente qui peut être appliquée pour comparer le processus de fibrilisation de différentes protéines amyloïdes, stimuli environnementaux, ou des antécédents génétiques in vivo d’une manière non invasive.

Introduction

L’agrégation protéique se produit à la fois dans le vieillissement et la maladie. Les voies qui mènent à la formation et au dépôt de grands amyloïdes ou d’inclusions amorphes sont difficiles à suivre et leur cinétique est tout aussi difficile à démêler. Les protéines peuvent se tromper en raison de mutations intrinsèques dans leurs séquences de codage, comme dans le cas des maladies génétiques. Les protéines se déplient également parce que le réseau de protéostasie (PN) qui les maintient solubles et correctement pliés est altéré, comme cela arrive pendant le vieillissement. Le PN comprend les chaperons moléculaires et les machines de dégradation et est responsable de ....

Protocol

1. Synchronisation de C. elegans

1. Synchroniser C. elegans soit par traitement de solution d’hypochlorite alcaline ou via la ponte simple pour 4 h à 20 oC⁸.
2. Cultivez et maintenez les nématodes à 20 oC sur les plaques moyennes de croissance des nématodes (NGM) ensemencées avec OP50 E. coli selon les procédures standard⁹. Vieillissez les nématodes jusqu’au stade ou au jour du développement désiré.
   REMARQUE : Dans ce protocole, les jeunes adultes sont photographiés le jour 4 et les vieux nématodes sont photographiés le jour 8 de la vie.

2. RNAi-....

Results

Le protocole montre comment surveiller avec précision la formation d’espèces agrégées dans les C. elegansvivants, tant pendant son vieillissement naturel que lorsqu’elles sont soumises au stress. Nous avons sélectionné quatre souches différentes de nématodes transgéniques exprimant des protéines de polyglutamine de 40Q, 44Q, ou 85Q répétitions. Ces protéines sont synthétisées dans différents tissus et ont été fusionnées à différents fluorophores. Les souches C. elegans o.......

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une technique à base de microscopie pour identifier les espèces agrégées dans le système modèle C. elegans. FLIM peut caractériser avec précision la présence d’espèces agrégées et solubles fusionnées à un fluorophore par mesure de leurs caries de fluorescence à vie. Lorsqu’une protéine de fusion commence à agréger sa durée de vie moyenne enregistrée passera d’une valeur plus élevée à une valeur inférieure^{de 16}. La propension de l’agrégation peut alors être.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	Composant NGM
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicilline	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotique
B& H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Logiciel d’acquisition
B& H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Logiciel d’acquisition
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Cadeau de Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Cadeau aimable de Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Cadeau de Morimoto Lab
Deckglä ; ser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Lamelles de protection
Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Montage Stéréomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Microscope confocal
Chlorhydrate de lévamisole	AppliChem GmbH	A4341	Anesthésique
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Logiciel d’acquisition
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Chlorure de sodium anesthésique
	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	Composant
NGMstandard-objektträ ; ger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Lames de verre
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Microscope confocal
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Microscope confocal